PLoS ONE: lavmolekylært heparin ablaterer lungekræft Cisplatin-Modstand ved at inducere Proteasome-medieret ABCG2 Protein Nedbrydning

Abstrakt

Kræft side befolkning (SP) celler, der ofte omtales som cancer stamceller, menes at være ansvarlig for lungekræft kemoterapi modstand, og i øjeblikket intet lægemiddel kan specifikt retter sig mod disse celler. Vi hypotesen lav molekylvægt heparin (LMWH) kan påvirke de biologiske egenskaber af SP-celler og kan anvendes til klinisk målrette disse celler. For at teste dette blev SP-celler isoleret fra cisplatin (DDP) -resistente lungeadenocarcinom A549 /DDP-celler ved flowcytometrisk sortering. Sammenlignet med ikke-SP celler, dannede SP celler øget antallet af kolonier

in vitro

, og havde en 1000-fold stigning i tumorgenicitet

in vivo

. Celleproliferation og apoptose analyser viste LMWH havde ingen signifikant effekt på lunge SP celledeling eller apoptose. Imidlertid LMWH reduceret lunge SP celle kolonidannelse evne og protein ekspression af multilægemiddeltransportøren, ABCG2, ved FACS og western blot-analyser uden at påvirke dets mRNA-niveauer ved hjælp af RT-PCR. Konsekvent blev immunhistokemi farvninger af ABCG2 i LMWH-behandlede tumorvæv væsentligt reduceret sammenlignet med dem i kontrol. Endvidere fandt vi proteasomalaktivitet inhibitor MG132, men ikke lysosomal inhibitorer leupeptin og pepstatin A, kan genoprette ABCG2 proteinniveauer i LMWH-behandlede SP-celler. Disse tyder LMWH ablaterer lunge SP celle kemoresistens af proteasom-medieret reduktion af ABCG2 protein niveauer uden at påvirke dens mRNA-niveauer. Vi bestemt også LMWH kombineret med cisplatin kunne overvinde cisplatin-modstand og inducerede lunge SP celler apoptose både

in vitro

in vivo

. Denne undersøgelse giver et eksperimentelt grundlag for at anvende en kombination af LMWH, som er rettet mod lunge SP celler, med kemoterapi for at forbedre lungekræft overlevelse

Henvisning:. Niu Q, Wang W, Li Y, Ruden DM, Wang F, Li Y, et al. (2012) lavmolekylært heparin ablaterer lungekræft Cisplatin-Modstand ved at inducere Proteasome-medieret ABCG2 Protein Nedbrydning. PLoS ONE 7 (7): e41035. doi: 10,1371 /journal.pone.0041035

Redaktør: Giuseppe Viglietto, University Magna Graecia, Italien

Modtaget: Marts 12, 2012; Accepteret: 17 Juni 2012; Udgivet: 23 Jul 2012

Copyright: © 2012 Niu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette projekt blev støttet af den Videnskabelige Research Foundation for det returnerede Overseas Chinese Scholars, Kina Statens Uddannelsesstøtte Ministeriet (nr 2007-1108) til QN og National Institutes of Health give ES012933 til DMR. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft død på verdensplan. I øjeblikket, lungekræft overlevelsesrater er fattige, med en 5-års overlevelse på 15% [1].

cancer stamceller (CSC) teori, at tumorer er organiseret i en hierarkisk måde, der ligner normale væv , med en sub-population af tumorigene stamceller-lignende celler, der er kemoterapi og generere differentierede tumorceller [2]. Side befolkning (SP) celler med CSC-lignende egenskaber blev først identificeret i leukæmi og efterfølgende isoleret fra faste tumorer, herunder bryst-, hjerne-, lunge-, lever-, prostata, colon, pancreas, og hoved- og halscancer [3] – [9] . SP-celler udtrykker høje niveauer af ATP bindende kassette (ABC) multilægemiddeltransportøren proteiner, som menes at være grundlaget for kemoterapi modstand og behandlingssvigt. Brystkræft resistens protein (BRCP /ABCG2), et medlem af ABC proteiner familie, er en væsentlig lægemiddel transportør som anses for at spille en central rolle i beskyttelsen SP-celler fra cytotoksiske midler, såsom cisplatin, og er involveret i multiresistens [10 ] – [12]

på trods af mange midler, som målretter CSC celler er blevet identificeret, disse potentielle midler er langt fra anvendelse i klinikken.. Kandidat CSC celle målretning molekyler påvirker Wnt, EpCAM, Hedgehog, og Delta /Notch signalering, mens andre tilgange, herunder anti-Delta-lignende 4 ligand (DLL4) antistof, salinomycin, metformin, TGF, sulforaphane, og andre er blevet testet til at ændre CSC drug-resistens egenskaber [13] – [17]. Selv om mange af disse midler synes lovende, især

in vitro

, det store problem med specifik målretning til CSCS celler og undgåelse af

in vivo

toksicitet tilbage.

Lav molekylvægt heparin (LMWH) blev godkendt af FDA i 1998 for antikoagulationsbehandling og er blevet administreret sikkert i over 13 år [18]. Undersøgelser viste, at heparin med lav molekylvægt behandling reducerede mortalitet cancer hos patienter med dyb venetrombose i forskellige cancertyper, som ikke er relateret til forskellene i dødelighed af tromboemboli [19] – [21]. Selv om flere kliniske undersøgelser har vist, at LMWH reduceret dødelighed og forlænget overlevelse hos patienter med fremskreden solid malignitet, den mekanisme, gennem hvilken LMWH udøver en anticancer effekt forbliver udefineret [22] – [25].

Vi hypotesen LMWH kan være i stand til at ændre de biologiske egenskaber af lunge SP-celler med CSC-lignende egenskaber. Derfor er denne undersøgelse undersøger, om LMWH påvirker lunge SP celleproliferation, apoptose, og kemoresistens samt tumorvækst

in vivo

og hvis mekanisme LMWH tager virkninger. Vore undersøgelser tyder LMWH kunne være en sikker lunge SP celle målrettet medicin, som kunne anvendes umiddelbart i klinikken for at overvinde kemoterapi modstand og forbedre lungekræft overlevelse.

Resultater

Side Befolkning Sortering

Flowcytometrianalyse med Hoechst33342 farvning viste, at en SP på 10% -17% celler eksisterede i A549 /DDP celler. Som en positiv kontrol blev antallet af SP-celler formindsket i nærvær af verapamil, et lægemiddel kendt for at inhibere ABC trasporter pumpen er ansvarlig for den side befolkning fænotype. Renheden af ​​SP-celler var 95% (gennemsnit 97%), og renheden af ​​ikke-SP-celler var 95%. SP og ikke-SP A549 /DDP-celler blev sorteret separat og anvendt til yderligere eksperimenter (figur 1).

(A) A549 /DDP-celler inkuberet med Hoechst 33342, uden verapamil og den indrammede region angiver SP på FACS. (B) A549 /DDP-celler inkuberet med Hoechst 33342 i nærvær af verapamil, med en kontrol identificere SP region på FACS. Repræsentative mikrografer af A549 /DDP dannede kolonier efter 10 dage fra (C) SP-celler og (d) ikke-SP-celler dyrket i serum-frit medium og (E) SP-celler (F) ikke-SP celler behandlet med LMWH, skala bar = 50 um. (G) Log kolonidannende effektivitet (CFE) af SP og ikke-SP-celler dyrket i serum-frit medium,

s Restaurant 0,05. (H) tumorer dannet efter podning med forskellige antal A549 /DDP side population (SP) og ikke-SP celler i NOD /SCID-mus efter 14 dage.

LMWH Formindsker SP Cell Colony Formation Evne

evne SP og ikke-SP celler til at danne kolonier blev testet

in vitro

. Kolonier af begge celletyper var synlige efter 10 dage; imidlertid blev antallet af kolonier steg betydeligt i SP-celler sammenlignet med ikke-SP-celler. Log10 kolonidannende effektivitet (CFE) af SP celler var signifikant højere end ikke-SP-celler (1,544 ± 0,150 vs 0,301 ± 0,082,

s

0,05, figur 1). LMWH betydeligt reduceret CFE i SP-celler (1,544 ± 0,150 vs. 0,812 ± 0,082,

s

0,05) sammenlignet med ikke-SP-celler (0,301 ± 0,082 vs 0,295 ± 0,053, p 0,05).

SP celler har Øget

in vivo

Tumorigenicitet

in vivo

tumorigen assay viste, at 5 × 10

3 SP celler var tilstrækkelige til tumordannelse

in vivo

, mens mere end 5 × 10

6 ikke-SP celler var nødvendige for at indlede tumorer (Figur 1). Tumorer blev fundet i alle seks mus injiceret med 5 x 10

5 og 5 × 10

4 SP-celler, men ingen tumor blev fundet i mus injiceret med det samme antal ikke-SP-celler. blev ikke observeret nogen tumorer, når 1 × 10

6 ikke-SP-celler blev podet. Vi konkluderer, at der var en større end 1000-fold forskel i tumorigenicitet mellem SP og ikke-SP celler.

LMWH påvirker ikke SP Cell Proliferation

Effekten af ​​LMWH på SP celledeling var bestemt under anvendelse af MTT-assayet. LMWH havde ingen signifikant effekt på SP celledeling sammenlignet med kontrolgruppen SP celler (hæmning rate af LMWH-behandlede SP celler var 3,11% ± 0,20%,

s

0,05, figur 2).

Annexin V-farvning i (A) kontrol SP-celler (B) SP celler behandlet med LMWH (C) SP celler behandlet med cisplatin og (D) SP celler behandlet med LMWH plus cisplatin. (E) Kvantificering af apoptose satser i A549 /DDP SP celler induceret af LMWH og DDP. Ingen signifikant forskel blev observeret i kontrol og LMWH-behandlede SP-celler. Apoptose induceret af LMWH plus DDP var signifikant højere end DDP alene (

s

0,05). (F) Inhiberingen på LMWH-behandlede A549 /DDP SP-celler i MTT-assay. Ingen signifikant forskel blev observeret i hæmning på kontrol og LMWH-behandlede SP celler.

LMWH Øger Cisplatin (DDP) induceret apoptose i SP Celler

Effekten af ​​LMWH på apoptose i SP-celler blev analyseret ved FACS. Der var ingen signifikant forskel i antallet af apoptose i LMWH behandlet SP celler og kontrol SP-celler (7,21% ± 0,81% vs. 8,01% ± 0,91%,

s

0,05); Men hastigheden af ​​apoptose i LMWH plus DDP behandlet SP-celler (65,89% ± 5,98%) var signifikant højere end SP celler behandlet med DDP alene (45,74% ± 4,12%,

s

0,05) og kontrol SP-celler (8,01% ± 0,91%,

s

0,05, figur 2).

LMWH Formindsker Ekspression af SP celleoverflademarkøren ABCG2

A549 /DDP SP celler udtrykker ABCG2, CD243 (p-gp) og CD24 på et højt niveau. Efter inkubation med LMWH i 36 timer, blev ABCG2 proteinekspression betydeligt reduceret i SP celler: ABCG2 udtrykker celler faldt fra 42,25% ± 4,11% til 9,92% ± 4,08%, (

s

0,05, figur 3) . Ingen signifikant ændring blev observeret i ekspressionen af ​​p-gp og Oct-4 efter inkubation med LMWH (figur 3).

(A) Ekspression af ABCG2 (CD338) i kontrolceller SP-celler og (B) induceret af LMWH i A549 /DDP SP-celler. (C) Angivelse af ABCG2 (CD338) i kontrol tumorceller og (D) fremkaldt af LMWH i A549 /DDP SP xenograft tumorceller. (E) Kvantificering af ekspression af CSC markør ekspression induceret af LMWH i SP-celler og xenograft tumorceller. LMWH signifikant nedreguleret udtryk for ABCG2 ved FACS (

s

0,05).

FACS analyse af ABCG2 Expression i tumorceller

Celler opnået fra xenograft tumor væv udtrykte ABCG2, CD243 (p-gp) og CD24. Proteinet udtryk for ABCG2 i tumorvæv af LMWH behandlede mus var væsentligt lavere end i kontrol mus (30,38% ± 2,13% vs. 20,22% ± 2,01%,

s

0,05, figur 3). Ingen signifikant ændring blev observeret i ekspressionen af ​​p-gp og Oct-4 efter inkubation med LMWH (figur 3).

LMWH påvirker ikke ABCG2 mRNA ekspression i SP Celler og tumorceller med RT-PCR

for at bestemme om LMWH affets ABCG2 ekspression på mRNA-niveauet, udførte vi QRT-PCR-analyse af SP-celler behandlet med LMWH i 16 timer og tumorceller fra LMWH behandlede og kontrolmus. Ingen signifikant ændring blev fundet i ABCG2 mRNA-niveau efter LMWH behandling (figur 4). Således LMWH usandsynligt påvirker ABCG2 ekspression på dets mRNA-niveau.

(A) ABCG2 mRNA-ekspression ændringer i LMWH behandlet tumorceller og LMWH behandlet SP-celler. Kvantitativ realtids RT-PCR viser, at udtryk for ABCG2 mRNA ikke blev ændret betydeligt i LMWH behandlet tumorceller eller LMWH behandlet SP celler sammenlignet med dem i kontroller (

s

0,05). β-actin blev anvendt som en intern reference. (B) Western blot-analyse af ABCG2 udtryk i SP celler behandlet med LMWH, LMWH + MG123, LMWH + pepstatin A + leupeptin og kontrol. SP-celler blev indledningsvis behandlet med LMWH eller kontrol i 10 timer, og derefter MG132 (10 uM) blev Pepstain A + Leupeptin (hver 100 ug /ml), eller kontrol tilsættes tilsvarende og inkuberet i 6 timer. Derefter blev cellerne høstet til Western blot-analyse. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. De tætheder af ABCG2 protein bands i western blot blev kvantificeret med Mængde One-4.6.2-programmet. (C) ABCG2 udtryk i LMWH behandlet og kontrol tumorvæv (IHC, SP × 200). Den gennemsnitlige SI score på ABCG2 udtryk i LMWH behandlet tumorvæv var 3,63 sammenlignet med den gennemsnitlige SI score på 9,13 i kontrol tumorvæv (3,63 ± 1,69 vs 9,13 ± 2,03,

s

0,05).

ABCG2 Protein Expression kan genoprettes ved den proteasomalaktivitet Inhibitor MG132 i LMWH-behandlede SP celler

Da vi ikke finde betydelig ændring af ABCG2 mRNA-niveauer i SP og tumorceller, vi testede, hvis LMWH induceret reduktion ABCG2 skyldes ubiquitinmedieret protolysis eller lysosomet. For at teste dette blev SP celler behandlet med LMWH, LMWH + MG132, og LMWH + Pepstatin A + Leupeptin. Som vist i fig. 4, ABCG2 proteinekspression i LMWH behandlet SP-celler blev signifikant reduceret sammenlignet med den i kontrol efter 16 timers behandling. Reduktionen kunne genoprettes ved proteasomalaktivitet inhibitor MG132 behandling, mens lysosomale inhibitorer pepstatin A plus leupeptin havde ingen effekt. Disse tyder på, at LMWH induceret ABCG2 proteinnedbrydning gennem proteasomet vej.

LMWH behandling Mindsker ABCG2 Protein Expression i tumorvæv ved immunhistokemi

ABCG2-ekspression til stede i forskellige intensiteter og forskellige celle udlodninger immunhistokemi farvning . Betydeligt blev observeret lave niveau af ekspression af ABCG2 i LMWH behandlet tumorvæv sammenlignet med kontroller. Efter mellemstationer kriterier pletten intensitet (SI), den gennemsnitlige SI score på ABCG2 udtryk i LMWH behandlet tumorvæv var 3,63 sammenlignet med den gennemsnitlige SI score på 9,13 i kontrol tumorvæv (3,63 ± 1,69 vs 9,13 ± 2,03,

s

. 0,05, figur 4)

Cisplatin xenotransplantat vækst Delay øges af LMWH

Administration af LWMH plus DDP til A549 /DDP tumor-bærende mus resulterede i signifikant reduceret tumorvækst sammenlignet med DDP alene (0,17 ± 0,05 cm

3 vs 0,29 ± 0,06 cm

3,

s

0,05) eller kontrol mus (0,44 ± 0,09 cm

3,

p

0,05) efter 30 dage. I A549 /DDP tumor-bærende nøgne mus, forskellene i LMWH kombineret med cisplatin og cisplatin-behandlede tumorer var signifikant efter 25 dage (0,17 ± 0,03 cm

3 vs 0,24 ± 0,08 cm

3,

s

0,05) og inden for 23 dage i kontroldyr (0,16 ± 0,09 cm

3 vs 0,27 ± 0,09 cm

3,

s

0,05, figur 5). Ingen signifikant forskel i tumorvolumen af ​​LMWH og DDP grupper blev fundet fra dag 8-30 (figur 5).

A549 /DDP SP-celler blev inokuleret i Balb /C nøgne mus og tumorvolumener blev registreret begyndende dag 1 af behandling med normalt saltvand kontrol, LMWH, DDP og DPP plus LWMH. Forskellene af tumor størrelser i LMWH kombineret med cisplatin og cisplatin-behandlede tumorer var signifikant efter 25 dage (0,17 ± 0,03 cm

3 vs 0,24 ± 0,08 cm

3,

s

0,05) og inden for 23 dage i kontroldyr (0,16 ± 0,09 cm

3 vs 0,27 ± 0,09 cm

3,

s

0,05). Ingen signifikant forskel i tumor volumen LMWH og DDP grupper blev fundet fra dag 8-30.

Diskussion

Isolering af lunge SP celler med CSC-lignende egenskaber og identifikation af eksisterende lægemidler, der modificerer lunge SP celler og overvinde deres kemoresistens kan levere innovative strategier til at forbedre det kliniske resultat i lungekræft. Vi demonstrerede at SP-celler fra A549 /DDP cisplatin-resistente humane lungeadenocarcinoma celler er beriget i CSC-lignende egenskaber som de i høj grad har øget kolonidannelse

in vitro

og tumorigenicitet

in vivo

, indikerer at A549 /DPP SP celler giver en god model til at studere lunge SP celler og et nyt system til at studere kemoresistens.

Vores undersøgelse tyder på, at LMWH ikke direkte dræber lunge SP celler eller inducerer SP celle apoptose

i vitro

. Imidlertid LMWH sensibiliserer cisplatin-resistente SP-celler over for cisplatin-induceret apoptose

in vitro

.

In vivo

forsøg viser, at LMWH kombineret med cisplatin signifikant hæmmer cisplatin-resistente tumor xenograft vækst. Yderligere undersøgelser viser, at LMWH reducerer ABCG2 proteinekspression, ved FACS og western blot analyser. Yoh fandt, at ekspression af ABCG2, men ikke af Pgp, MRP1, MRP2, og MRP3, var en prædiktiv faktor af dårlig klinisk resultat i avanceret NSCLC patienter selv om den rolle, ABCG2 som transportør af platin-konjugater er stadig kontroversiel [12]. Vores resultater er i overensstemmelse med sine resultater og alle disse klart tyder ABCG2 er et lægemiddel transporter, der spiller en stor rolle i cisplatin modstand i SP celler. Immunhistokemi analyser konsekvent viste, at LMWH reducerer ABCG2 proteinekspression betydeligt i LMWH-behandlede tumorvæv sammenlignet med kontroller. Alle disse tyder på, at LMWH kan forhindre kemoresistens af SP celler ved at reducere ABCG2 proteinekspression uden at påvirke dens mRNA-niveauer.

Yderligere undersøgelser viser, at ABCG2 protein reduktion i SP celler skyldtes induceret nedbrydning af LMWH gennem ubiquitin- proteasomforløb fordi proteasomalaktivitet inhibitor-MG132, men ikke lysosomal inhibitors- leupeptin og pepstatin A, gendanner ABCG2 proteinekspression i LMWH-behandlede SP-celler. Vi spekulere, at LMWH kan binde til ABCG2 i SP cellemembraner og inducere ubiquitinization og nedbrydning, hvilket reducerer kemoresistens af lunge SP-celler.

LMWH er en sikker antikoagulerende middel, der anvendes i koagulerende og ikke-koagulerende betingelser, som har været anvendes i behandling af cancer i mere end et årti [18]. Retrospektiv data antyder, at det kan forbedre overlevelse hos nogle kræftpatienter, men den nøjagtige mekanisme stadig uklar [26]. Eksperimentelle modeller tyder LMWH er i stand til at inhibere tumorvækst, invasion, metastase, angiogenese, matrixdannelse og reverse multilægemiddelresistens [27] – [31]. Denne undersøgelse viser, at LMWH alene moderat kan reducere tumorvækst

in vivo

selv om det ikke kunne fremkalde tumorceller apoptose direkte

in vitro

. Grunden kan være, at LMWH udøver sin tumor hæmmende effekt gennem forstyrrelse af tumorceller vedhæftning, invasion, angiogenese, eller microenvironement [32], [33].

Til vores viden, denne undersøgelse er den første rapport, at LMWH kan forhindre kemoresistens af lunge SP-celler ved at reducere ABCG2 protein udtryk gennem proteasom-afhængige nedbrydning. Evne LMWH at bevidstgøre SP celler til kemoterapi ved at inducere ABCG2 nedbrydning gennem proteasomet pathway kan give en forklaring på den ukendte mekanisme, som LMWH forbedrer kemoterapi respons og overlevelse hos kræftpatienter [28], [34].

Afslutningsvis vores undersøgelser, at LMWH reducerer lungekræft kemoresistens via induktion ABCG2 proteinnedbrydning gennem proteasomforløb. Kombinationen af ​​LMWH med cisplatin kunne målrette både kemoterapi lunge SP celler og chemosensitive ikke-SP cancerceller, hvilket giver en effektiv ny strategi for lungekræft behandling. Som LMWH kan anvendes uafhængigt af hypercoagulant betingelser og bivirkningerne er veltolereret, den kliniske anvendelse af LMWH i lungekræft har et stort potentiale. Det er klart, er behov for yderligere kliniske studier af LMWH kombineret med kemoterapi og strålebehandling i lungekræft, og det vil være umagen værd at undersøge, om LMWH kan ændre SP celler fra andre typer kræft.

Materialer og metoder

Cancer Cell Culture og reagenser

cisplatin-resistente humane lunge adenocarcinom cellelinie A549 /DDP blev opnået fra American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) og rutinemæssigt dyrket i RPMI medium suppleret med 10% humant AB serum og 2 pmol cisplatin (Qilu Pharmaceutical Co., Ltd., Shandong, Kina). A549 /DDP celler blev dyrket i komplet RPMI medium uden cisplatin i 3 dage, inden de blev brugt i forsøgene. Leupeptin, pepstatin A, og MG132 blev købt fra Sigma (St Louis, MO, USA).

Side Befolkning Sortering og analyse

A549 /DDP celler blev suspenderet ved 1 x 10

6 celler /ml i PBS indeholdende 4% FBS, inkuberet ved 37 ° C i 60 minutter med 5 pg /ml Hoechst 33342 (Sigma, St. Louis, MO, USA) enten alene eller i nærværelse af 500 pmol verapamil (Sigma, St Louis, MO, USA). Efter inkubation blev 1 ug /ml propidiumiodid tilsat, og derefter blev suspensionen filtreret gennem et 40 um cellefilter (BD Bioscience, San Diego, CA, USA) for at opnå en enkelt cellesuspension. Flow cytometery analyse og sortering blev udført under anvendelse af en FACS Vantage SE (BD Bioscience). Hoechst 33342 var ophidset med UV-laser ved 350 nm og fluorescens emission blev målt med 405 /BP30 (Hoechst blå) og 570 /BP20 (Hoechst rød) optiske filtre. Renheden af ​​SP-celler og ikke-SP-celler blev testet igen under anvendelse af FACS. Efter FACS-sortering, har SP og ikke-SP A549 /DDP-celler blevet holdt i komplet RPMI-medium, og blev anvendt til yderligere eksperimenter i løbet af 2 timer.

kolonidannelse Assay

Kolonidannelse assay var udført for at vurdere den klonogene evne SP og ikke-SP-celler. Efter sortering blev 100 SP eller 100 ikke-SP A549 /DDP-celler udpladet i RPMI 1640/10% på plader med 6 brønde i tre eksemplarer. Mediet blev skiftet to gange om ugen, og efter 10 dage blev antallet af kolonier i hver brønd bestemt under et mikroskop og repræsentative felter blev fotograferet. Procent kolonidannende effektivitet (% CFE) blev beregnet som = (Antal kolonier opnåede /antal dyrkede celler) × 100 og log transformerede værdier blev beregnet [35], [36].

I vivo

Tumorigenicitet Experiment

Alle eksperimenter dyr blev udført med godkendelse af Institutional Animal Care og brug Udvalg for 304 PLA Hospital Institute for Biological Sciences. Tyve fire fem uger gamle ikke-overvægtige diabetiske /svær kombineret immundefekt (NOD /SCID) hanmus blev købt fra den kinesiske Association for Laboratory Animal Science (CALAS, Beijing, Kina) og opstaldet under specifikke patogenfrie betingelser, i et kontrolleret temperatur og fugtighed med 12 timers lys /mørke-cykler. Mus blev injiceret subkutant på den ene side med 5 × 10

5, 1 × 10

5, 5 × 10

4 eller 5 × 10

3 SP celler eller 1 × 10

7, 5 × 10

6, 5 × 10

5 eller 5 × 10

4 ikke-SP celler i 100 ul suspensioner og tumorvækst blev overvåget. 0,3 mg /0,20 ml LMWH blev injiceret subkutant i LMWH behandlingsgruppen på dag -1. Mus blev aflivet på dag 60, eller når tumorer nåede et maksimum volumen på 1.000 mm

3. Tumorvolumen blev beregnet ved anvendelse af (bredde

2 x længde) /2. Fold forskel i tumorigenicitet blev beregnet ved mindste antal ikke-SP-celler nødvendige for at generere en tumor /mindste antal SP celler nødvendige for at generere en tumor.

MTT assay

A549 /DDP SP sorteret celler blev podet i plader med 96 brønde ved 7,5 x 10

3 per brønd og behandlet med eller uden 5 IU /ml LMWH (lavmolekylære heparin calcium, Bopuqin, Tianjing Chase Sun Pharmaceutical Co, Ltd, Tianjing, Kina) i tre eksemplarer. Tre brønde indeholdende tumorceller suspenderet i komplet medium blev anvendt som kontroller for cellelevedygtighed og tre brønde indeholdende kun komplet medium blev anvendt som kontroller for ikke-specifik reduktion farvestof. Efter 48 timer blev MTT farveopløsning tilsat til hver brønd, og prøver blev inkuberet ved 37 ° C i 4 timer blev formazan produktet opløst ved tilsætning af 100 pi DMSO til hver brønd, og absorbans (A) blev aflæst ved 570 nm med en ELISA Reader (Anthos 2020 Salzbrug, Australien) hæmningen rate (%) blev beregnet som 100% × (kontrolgruppe A værdier -experimental gruppe A værdier) /gruppe A værdier kontrol.

Apoptose Assay og SP Cell Marker Expression Analysis

A549 /DDP SP-celler (1 x 10

6/96 brønd plade) var ubehandlede (kontrol) eller behandlet med 5 IU /ml LMWH, LMWH plus 2,2 ug /ml cisplatin (DDP ), eller DDP alene i 36 timer og farves ved hjælp af Annexin V-FITC apoptose afsløring kit (BioVision, Mountain View, CA, USA) og analyseret på en FACScalibur flowcytometer (BD Bioscience). For SP-celle markør analyse blev A549 /DDP SP celler inkuberet med LMWH i 36 timer, derefter inkuberet i 30 minutter ved 4 ° C med monoklonale antistoffer mod p-gp (ABCAM, Hong Kong Science Park, New Territories, Hong Kong), ABCG2 (Abcam, Hong Kong Science Park, New Territories, Hong Kong), CD24 (Biolegend, Roselle Street, San Diego, CA, USA), og oktober-4 (Biolegend, Roselle Street, San Diego, CA, USA) koblet til FITC eller PE (Biolegend, San Diego, CA, USA) ved koncentrationen anbefalet af fabrikanten og analyseret ved flowcytometri. Apoptose-assay og SP cellemarkør ekspressionsanalyse blev gentaget 3 gange.

kvantitativ real-time RT-PCR

A549 /DDP SP celler af LMWH behandlede eller ubehandlede celler og tumorceller indsamlet fra LMWH behandlet eller ubehandlede mus blev suspenderet ved 1 x 10

6 celler /ml i 5 ml PBS som prøve hhv. Derefter, isolering af totalt RNA blev udført ved anvendelse TriPure Isolation reagens (Roche Diagnostics GmbH. Tyskland) eller RNeasy Mini Kit (Qiagen, USA) ifølge producentens instruktioner.

mRNA niveauer blev analyseret ved kvantitativ realtids RT- PCR under anvendelse af en Bio-Rad iCycler systemet (Bio-Rad, Hercules, CA). MRNA’erne blev revers-transkriberet til cDNA ved anvendelse af en iScript cDNA-syntese kit (Bio-Rad, Hercules, CA). Primersekvenserne anvendt i real-time RT-PCR er: 5′-GGGTAATCCCCAGGCCTCTA-3 ‘(sense-primer af humant ABCG2 genet), 5′-CCAGCTCTGTTCTGGATTCCA-3′ (antisense-primer af humant ABCG2 genet), 5’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT- 3 ‘(sense-primer af humant β-actin-gen), og 5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’ (antisense-primer af humant β-actin-gen). Reaktionen blev udført under følgende betingelser: en cyklus ved 48 ° C i 45 minutter; 95 ° C i 2 min; 40 cykler ved 95 ° C i 30 s, 55 ° C i 1 min, og 68 ° C i 2 min. Hver RT-PCR-amplifikation blev gentaget tre gange. PCR effektivitet blev undersøgt ved seriefortynding skabelonen cDNA og smeltekurven data blev opsamlet for at kontrollere PCR-specificitet. Hver cDNA prøve blev triplikerede og den tilsvarende ikke-RT-mRNA-prøve blev medtaget som en negativ kontrol. Den β-actin primer var inkluderet i hver plade for at undgå eksempelvariationer. MRNA-niveauet af hver prøve blev normaliseret til den for β-actin mRNA. Relative mRNA-niveauet blev præsenteret som 2

– [(Ct /ABCG2- Ct /β-actin) LMWH – (Ct /ABCG2- Ct /β-actin) kontrol]. Alle viste data var middelværdien ± SD af tre separate eksperimenter.

tumorvækst xenotransplantat Study

Seks uger gamle indavlede Balb /C nøgne mus blev opnået fra Institut for kinesiske Association for Laboratory Animal Science (CALAS). A549 /DDP lungeadenokarcinom celler (5 x 10

6) blev subkutant inokuleret i øverste venstre flanke på dag 1. Når diametrene af tumorerne var 5 mm, blev musene inddelt i kontrol, DDP, og LMWH med DDP grupper (n = 10 hver) og behandlet med ip injektion på 8 mg /kg DDP eller et tilsvarende volumen saltopløsning en gang om ugen i 3 uger. LMWH (0,3 mg /0,20 ml) eller saltvandsopløsning blev givet s.c. hver dag fra dag 8 til dag 30. Tumorvolumen blev bestemt tre gange om ugen som tidligere beskrevet og mus blev aflivet på dag 30.

SP cellemarkør Ekspression i tumoreksplantater

Tumor prøver var udskåret fra mus, skyllet, mekanisk hakket, og fordøjet i 4 timer ved 37 ° C i en rysteinkubator med 0,1 Wunsch enheder /ml collagenase i (Roche Diagnostics) i DMEM. Fordøjelsen blev disaggregeret ved anvendelse af en 18,5-gauge kanyle, sigtet gennem en 100 um cellefilter og forberedt til flowcytometrianalyse af SP cellemarkør ekspression som beskrevet tidligere. Salg

Western Blot

SP-celler var oprindeligt behandlet med LMWH eller kontrol i 10 timer, og derefter MG132 (10 uM), Pepstain A + Leupeptin (hver 100 ug /ml), eller kontrol blev tilsat tilsvarende og inkuberet i 6 timer. Derefter blev cellerne høstet til Western blot-analyse. Primært antistof inkubation blev udført ved 4 ° C i 16 timer med et muse anti-ABCG2 antistof (Biolegend, San Diego, CA, USA) fortyndet til 1:300 i 3% bovint serumalbumin efterfulgt af inkubation med horseradishperoxidase-konjugeret hest anti-muse-sekundært antistof og fremkaldt under anvendelse af et forøget kemiluminescens påvisningssystem (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). Anti-β-actin antistof blev anvendt som lastning kontrol (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Californien, USA).

Immunhistokemi Farvning af ABCG2 i tumorvæv

De paraffinindstøbte væv blev skåret i 4 um objektglas og bagt ved 60 ° C i 60 minutter. Sektionerne blev de-paraffinized med xylener og rehydreret. Derefter snit blev nedsænket i EDTA antigen hentning buffer i en trykkoger i 10 minutter og derefter afkølet ved stuetemperatur i 20 minutter. Snittene blev behandlet med 3% hydrogenperoxid i methanol til standsning af endogen peroxidaseaktivitet, efterfulgt af inkubation med normalt serum for at blokere uspecifik binding. Derefter blev slides inkuberet med renset anti-human ABCG2 antistof (Abcam, Hong Kong Science Park, New Territories, Hongkong, Kina) med en fortynding på 1:20 ved 4 ° C natten over. Det andet antistof var fra en SP reagens kit (Zhongshan Biotechnology Company, Beijing, Kina). Efter vask blev vævssnittene behandlet med biotinyleret anti-muse-sekundært antistof, efterfulgt af yderligere inkubation med streptavidin-peberrodsperoxidase-kompleks i 20 minutter. Farvet med diaminobenzidin (DAB) blev snittene modfarvet med hematoxylin. Kendt positivt væv blev anvendt til positive kontroller. Det primære antistof blev udeladt for negative kontroller. Et Olympus (Olympus, Tokyo, Japan) mikroskop blev anvendt til at visualisere farvning af målrettede proteiner.

De farvede objektglas blev revideret og afsluttet uafhængigt af to observatører, og den score blev bestemt ved at kombinere den andel af positivt farvede tumor celler og intensiteten af ​​farvning. Tumor celle andel blev scoret som følger: 0 (ingen positive tumorceller); 1 (≤30% positive tumorceller); 2 (31-50% positive tumorceller); 3 (51-80% positive tumorceller) og 4 ( 80% positive tumorceller). Farvning intensitet blev gradueret efter følgende kriterier: 0 (-, ingen farvning); 1 (+, svag farvning = lysegul); 2 (++, moderat farvning = gul brun) og 3 (+++, stærk farvning = brun). Farvning (SI) blev beregnet som produktet af farvningsintensitet score og andelen af ​​positive tumorceller. Ved hjælp af denne metode til vurdering, vurderet vi ABCG2 udtryk i tumorvæv ved bestemmelse af SI, med snesevis af 0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9 eller 12.

Statistisk analyse

data er præsenteret som middelværdi ± SD