PLoS ONE: Bidrag af epidermal vækstfaktor receptor til Erhvervelse af Platinum Resistance i ovariecancerceller

Abstrakte

Køb af platin modstand efter første linje platin /taxan terapi er almindeligt forekommende i æggestokkene kræftpatienter og forhindrer kliniske effekt. Der er få muligheder for at forhindre platin modstand; Imidlertid har demethylering midler vist sig at resensitize patienter til platinbehandling hvilket viser, at DNA-methylering er en kritisk bidragyder til udvikling af platinmodstandstermometer. Vi har tidligere rapporteret epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) er en ny regulator af DNA methyltransferase (DNMT) aktivitet og DNA methylering. Andre har vist, at EGFR-aktivering er forbundet med cisplatin behandling og platinmodstandstermometer. Vi antager, at cisplatin-induceret aktivering af EGFR medierer ændringer i DNA-methylering associeret med udviklingen af ​​platinmodstandstermometer. For at undersøge dette, vi evaluerede EGFR-signalering og DNMT aktivitet efter akut cisplatin eksponering. Vi udviklede også en

in vitro

model af platin modstand at undersøge virkningerne af EGFR-hæmning ved køb af cisplatin modstand. Akut cisplatinbehandling aktiverer EGFR og nedstrøms signalveje, og inducerer en EGFR-medieret stigning i DNMT aktivitet. Cisplatin-resistente celler viste også øget DNMT aktivitet og global methylering. EGFR-inhibering under gentagne cisplatin behandlinger frembragte celler, der var mere følsomme over for cisplatin og ikke udviklede stigninger i DNA-methylering eller DNMT aktivitet sammenlignet med kontroller. Disse resultater antyder, at aktivering af EGFR under platin behandling bidrager til udviklingen af ​​platinmodstandstermometer. Endvidere kan EGFR-hæmning være en effektiv strategi på at dæmpe udviklingen af ​​platin resistens og dermed forbedre effektiviteten af ​​kemoterapeutiske behandling i kræft i æggestokkene

Henvisning:. Granados ML, Hudson LG, Samudio-Ruiz SL (2015) Bidrag fra den epidermal vækstfaktor receptor til Erhvervelse af Platinum Modstand i æggestokkene cancerceller. PLoS ONE 10 (9): e0136893. doi: 10,1371 /journal.pone.0136893

Redaktør: J. Christopher stater, University of Louisville, UNITED STATES

Modtaget: April 10, 2015; Accepteret: August 9, 2015; Udgivet: 9 September, 2015

Copyright: © 2015 Granados et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Cancer Institute of National Institutes of Health under Award nummer K01CA172591. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter National Institutes of Health. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er den førende dødsårsag som følge af gynækologiske maligniteter [1]. Fremskreden sygdom, sent diagnose, peritoneal metastaser og hyppige udvikling af kemoresistens hindrer forbedringer i den samlede overlevelse, som fortsat lav på nogenlunde 44% [1]. Første linje behandling for kræft i æggestokkene omfatter kirurgisk debulking og platin (cisplatin eller carboplatin) -taxan (paclitaxel) kemoterapi [2]. Så mange som 70-80% af patienter med ovariecancer vil udvikle platin modstand efter første linje terapi og de fleste af disse patienter til sidst bukke under for kemoterapi sygdom [3-5]. Således platinmodstandstermometer fortsat en væsentlig klinisk udfordring. Til dato er der begrænsede indgreb rådighed for at forhindre eller vende platin modstand; dog har der været nogle fremskridt i anvendelsen af ​​demethylere midler ved resensitization af patienter til platinbaseret terapi [6-10]. Konkret Matei og kolleger viste, at platin resistente patienter behandlet med en lav dosis demethyleringsmiddel induceret demethylering af gener inden for tumorceller og positivt korreleret med progressionsfri overlevelse [7]. Dette fremhæver DNA methylering som et kritisk bidragyder til erhvervelse af resistens i kræft i æggestokkene. Men mekanismer, der regulerer DNA methylering og erhvervelse af platin resistens efter cisplatin behandling er ikke blevet fuldt belyst. Vi har tidligere rapporteret, at epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) regulerer af DNA methyltransferaser (DNMT) og DNA methylering [11]. Derfor kan EGFR bidrage til udviklingen af ​​platinmodstandstermometer.

EGFR er en receptortyrosinkinase, der overudtrykkes i 30-98% af epitelial ovariecancer [4,5] og overekspression af EGFR (og dens ligander) i patienter med ovariecancer korrelerer med dårlig prognose [12]. Aktivering af EGFR i ovarietumorer er forbundet med forøget malignitet og dårlig patientresultatet [13,14]. Endvidere aktivering af EGFR er blevet vist i ~ 30% af ovarietumorer [15]. Den EGFR er ansvarlig for aktivering af flere intracellulære signalveje, herunder Ras /Raf /MAPK, Jak /Stat og AKT /PI3K og regulerer mange cellulære processer, såsom celle overlevelse, formering og migration (se [14] for gennemgang). Desuden EGFR aktivering forekommer som respons på cisplatin [16-19] og hyperaktivering af receptoren, og dens downstream signalveje, er impliceret i platinmodstandstermometer [20,21]. Vi har tidligere vist, at aktivering af EGFR i ovariecancerceller forøger DNMT aktivitet og over sigt EGFR aktivering længe kan føre til øget DNA-methylering [11] samt nedsat følsomhed over for cisplatin [22].

Platinum eller cisplatin resistens er korreleret med øget DNA-methylering og efterfølgende silencing af gener involveret i passende lægemiddelrespons [23-28]. Genekspressionsanalyse af platin følsomme versus platin resistente patientprøver viste, at de differentielt regulerede gener er mere tilbøjelige til at blive underexpressed i resistente sammenlignet med følsomme tumorer [29]. Taget sammen, vi hypotese, at cisplatin-induceret aktivering af EGFR bidrager til udviklingen af ​​platinmodstandstermometer i ovariecancerceller gennem regulering af DNMT aktivitet og DNA-methylering. Desuden foreslår vi, at inhibitorer med små molekyler til EGFR kan være nyttige at forhindre eller mindske erhvervelse af cisplatin modstand. For at teste hypotesen, vi evaluerede aktivering af EGFR, nedstrøms signalveje og DNA methyltransferase-aktivitet i ovariecancerceller som reaktion på fysiologisk relevante doser af cisplatin. Vi undersøgte også virkningerne af den lille molekyle inhibitor Erlotinib i en

in vitro

model af platin modstand. Vi fandt, at inhibering af EGFR dæmper cisplatin inducerede stigninger i DNMT aktivitet, forhindrer øget DNA-methylering og også formindsker platinmodstandstermometer i ovariecancerceller. Dette arbejde fremhæver en potentiel mekanisme og en medgørlig mål at reducere udviklingen af ​​platin resistens baseret på epigenetiske mekanismer.

Materialer og metoder

Cell kultur og medicinsk behandling

æggestokkene carcinom cellelinie OVCA 433 blev tilvejebragt af Dr. Robert Bast Jr., MD Anderson Cancer center, Houston TX [30] og dyrket i Minimum Essential Medium (MEME) (Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY) suppleret med 10% ( v /v) føtalt bovint serum (FBS) (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA), 1 mM natriumpyruvat (Sigma, St. Louis, MO), 0,5 enheder /ml penicillin-0,5 ug /ml streptomycin (Gibco, Life Technologies) , senere benævnt MEME vækstmedie. Alle celler blev holdt ved 37 ° C under 5% CO2 /95% luft. Akutte 10 uM cisplatin (Sigma-Aldrich) behandlinger blev udført i MEME vækstmedium for 0-6 timer. EGFR-inhibering blev udført ved hjælp af præinkubation af cellerne med 2 pM AG1478 (LC Laboratories, Woburn, MA) i 24 timer før cisplatin behandling. 10 nM EGF (Biomedical Technologies, Stoughton, MA) behandlinger for 15 minutter blev udført som en positiv kontrol for EGFR aktivering.

Cisplatin modstand paradigme

Som oprindelig påvist i [20], modstandsdygtighed over for cisplatin kan øges i æggestokkene cancerceller ved gentagne sekventielle behandlinger med cisplatin efterfulgt af narkotika gratis inddrivelse gange. Vores cisplatin modstand paradigme blev modelleret fra [20]. Kort fortalt blev OVCA 433 celler behandlet med cisplatin i 48 timer og fik derefter lov til at komme sig i mindst 48 timer efter lægemiddelbehandling. Celler fuldført tre cykler af hver koncentration af cisplatin efterfulgt af stoffri opsving gange før de udsættes for det næste højere dosis. Doserne af cisplatin anvendte var 3, 6 og 9 pM. Celler fuldender dette paradigme blev betegnet Cisplatin resistente (CPR) celler. Passage kontrolceller (ikke undergår cisplatin behandlinger) blev udført parallelt. EGFR blev inhiberet ved behandling af celler med 1 pM Erlotinib (Cell Signaling, Danvers, MA) i mindst 1 time før lægemiddelbehandlinger med cisplatin. Erlotinib blev opretholdt i dyrkningsmedier til 48 timer med cisplatin behandlinger og derefter celler fik lov til at komme sig fra al medicinsk behandling i MEME vækstmedier under narkotika gratis intervaller.

Immunoblotting

Celler blev vasket med PBS og høstet i cellelyse-buffer indeholdende 5 mM EDTA, 2 mM EGTA, 1 mM Na

3VO

4, leupeptin 10 mg /ml, pepstatin A 10 mg /ml, 1 mM PMSF i PBS og 1% SDS . Totale proteinkoncentrationer blev bestemt under anvendelse af BCA-proteinassay-kit (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). Ens mængder af totale cellelysater (30 ug) blev elektroforesebehandlet gennem 10% SDS-polyacrylamid, overført til 0,45 um nitrocellulose (Thermo Fisher Scientific) og blokeret med 3% BSA. Blots blev probet med kanin polyklonalt anti-phospho-EGFR (Tyr1068) (Cell Signaling) ved 1: 1000, kanin polyklonalt anti-total EGFR (Santa Cruz, Dallas, TX) ved 1: 500, kanin monoklonalt anti-phospho-JAK2 ( Abcam, Cambridge, MA) ved 1: 1000, kanin monoklonalt anti-total JAK2 (Cell Signaling) ved 1: 1000, kanin monoklonalt anti-phospho AKT (Cell Signaling) ved 1: 1000, muse-monoklonalt anti- samlede AKT (BD Transduktion laboratorier, Franklin Lakes, NJ) ved 1: 500, muse monoklonalt anti-phospho-STAT3 (ser727) (Cell Signaling) ved 1: 1000, kanin monoklonalt anti-total STAT3 (Cell Signaling) 1: 1000, kanin polyklonalt anti-phospho -ERK1 /2 (Cell Signaling) ved 1: 2000, kanin polyklonalt anti-total ERK1 /2 (Cell Signaling) ved 1: 2000, kanin polyklonalt anti-DNMT1 (New England Bio Labs, Ipswich, MA) ved 1: 750, kanin polyklonalt anti-DNMT3A (Cell Signaling) ved 1: 1000, kanin polyklonalt anti-DNMT3B (Abcam) ved 1: 1000, kanin polyklonalt anti-DNMT3L (Abcam) ved 1: 1000, polyklonalt kanin-pDNMT1 (Ser714) (Millipore, Billerica , MA) ved 1: 250 og et monoklonalt muse-anti-GAPDH-antistof (Millipore) ved 1: 1000, som blev anvendt som en loading kontrol. Blots blev derefter inkuberet i det passende sekundære antistof (Promega, Madison, WI), og de immunreaktive proteiner blev detekteret under anvendelse SuperSignal West Pico eller Femto Kemiluminescens (Thermo Fisher Scientific). Imaging af blots og densitometri blev opnået ved hjælp af Kodak Image Station 440 og tilhørende software (NEN Life Science Products, Boston, MA).

Monolagskulturer og flercellede Aggregate (MCA) cellekultur

Celler blev udpladet ved 2000 celler per brønd i 96 brønds fladbundede cellekulturplader (monolagskultur) og 96 godt Lipidure U bundplader (NOF America Corporation, White Plains, NY) (MCA kultur). Celler voksede natten over ved 37 ° C under 5% CO2 /95% luft. Billeder blev taget med Olympus IX70 udstyret med DP72 digitalkamera og imaging software.

Cell levedygtighed

Celler dyrkes i monolagskultur og som MUB blev behandlet med stigende doser af cisplatin [0-300 uM] i 48 timer. Cellelevedygtighed blev målt ved anvendelse PrestoBlue (Life Technologies) ifølge fabrikantens protokol. Kort beskrevet blev 10 pi PrestoBlue reagens tilsat pr 100 pi medier og inkuberet i 1 time (monolag) eller 24 timer (MCA’er). Efter de respektive inkubationstider, top-læse fluorescens (RFUs; excitation 555 nm emission 585 nm) blev målt under anvendelse SpectraMax M2 pladelæser og SoftMax Pro V5.4 software (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Beregninger af IC

50 værdier for cellelevedygtighedsassays blev bestemt ved anvendelse af GraphPad Prism Software 4.0 (San Diego, CA).

DNMT aktivitetsassay

Nukleare ekstrakter blev isoleret ved anvendelse af EpiQuik Nuclear Extraction kit (Epigentek, Farmingdale, NY) ifølge fabrikantens protokol. Proteinkoncentrationer for nukleare ekstrakter blev bestemt under anvendelse af BCA-proteinassay-kit (Thermo Fisher Scientific). Total DNMT aktivitet blev bestemt under anvendelse af 20 ug totalt protein og EpiQuik DNA methyltransferase (DNMT) Aktivitet /Inhibering Assay Kit (Epigentek) som anbefalet af producenten. Hver plade blev aflæst under anvendelse af en mikropladelæser ved 450 nm. Mængden af ​​methyleret substrat-DNA detekteres af kittet er proportional med DNMT enzymatiske aktivitet i vores prøver. DNMT aktivitet beregnes ved følgende ligning: Sample værdier blev normaliseret til værdier opnået for kontrol, ubehandlede OVCA 433 celler i samme eksperiment og udtrykkes i forhold til en

Global DNA methylering kvantificering

DNA. blev isoleret fra celler ved anvendelse af DNeasy blod og væv Kit ifølge producentens protokol (Qiagen, Valencia, CA). Global DNA-methylering blev vurderet ved anvendelse 250 ng DNA og MethylFlash Methyleret DNA Kvantificering Kit (Epigentek) ifølge fabrikantens protokol. Mængden af ​​5-methylcytosin i hver prøve bestemmes ved en kolorimetrisk assay, som detekteres af mikropladelæser ved 450 nm. Kvantificering af DNA methylering beregnes ved følgende ligning:. Sample værdier blev normaliseret til værdier opnået for kontrol, ubehandlede OVCA 433 celler i samme eksperiment og udtrykt som en procentvis stigning fra 100% (kontrol)

Graphing og statistisk analyse

Alle data blev evalueret i to eksemplarer mod ubehandlede passage kontrolceller og indsamlet fra mindst 4 uafhængige forsøg, medmindre andet er angivet. Data blev afbildet grafisk og analyseret under anvendelse af GraphPad Prism Software 4.0 (San Diego, CA) under anvendelse af envejs ANOVA eller to-vejs ANOVA og Tukeys, Dunnet post hoc analyse eller Bonferroni korrektion eventuelt. Standard uparret t-test også anvendes, når det er relevant.

Resultater

Akut cisplatin behandling initierer EGFR signalering

Flere

in vitro

undersøgelser til dato har brugt høj doser af cisplatin (50-100 uM) for at demonstrere øget aktivering af EGFR over korte behandlingstider [16-19]. Men undersøgelser ser på farmakokinetik hos patienter i behandling 75-120 mg /m

2 af cisplatin viste peak plasmakoncentrationer mellem 0,2 til 14 uM [31,32], og dermed antyder, at

in vitro

undersøgelser af 50-100 uM kan ikke være klinisk relevant. Her har vi bekræftet, at cisplatin behandling på et mere fysiologisk relevant dosis (10 uM) aktiverer EGFR. Signifikante stigninger i EGFR-phosphorylering (pEGFR) blev observeret i ovariecancerceller (OVCA 433) efter 30 min (0,5 time), 1 time og 2 timer behandling med 10 pM cisplatin uden ændringer total EGFR (fig 1A og 1B). Dataene blev også udtrykt som et forhold mellem aktiveret EGFR til total EGFR (Fig 1C) og fundet at øges væsentligt ved 2 timer efter cisplatin behandling. Specifik inhibering af EGFR-tyrosinkinaseaktivitet blev opnået under anvendelse AG1478 at fastlægge den rolle EGFR i cisplatin-induceret aktivering af downstream signalveje. Som forventet, AG1478 hæmmede både basal og cisplatin inducerede niveauer af pEFGR uden væsentlige ændringer i den samlede EGFR (Fig 2A). Funktionel aktivering af EGFR efter cisplatin-behandling blev vurderet ved evaluering af downstream receptormål efter behandling med cisplatin og AG1478 (Fig 2B). JAK2 og AKT aktivering var signifikant forhøjede i 4 h behandling tidspunkt sammenlignet med ubehandlede kontroller. Betydelige stigninger i ERK1 /2 eller STAT3-aktivering blev ikke observeret under disse betingelser (data ikke vist). Omvendt aktivering af JAK2 og AKT blev stærkt formindsket af AG1478 mens de samlede protein niveauer forblev relativt uændret, uanset behandling (Fig 2B-2D). Således akutte, fysiologisk relevante doser af cisplatin indleder EGFR-signalering og aktivering af JAK2 og AKT.

A) Repræsentative western blots af aktiverede eller phosphoryleret EGFR (pEGFR, tyr1068) i OVCA 433 celler givet 10 uM cisplatin i 0,5 , 1, 2, 4 og 6 timer sammenlignet med ubehandlede kontrolceller. 10 nM EGF gives til celler i 15 minutter som en positiv kontrol, der viser aktivering af receptoren. Total EGFR-blot og GAPDH repræsentative blots vist også. B) Graf over EGFR aktivering efter 10 pM cisplatin behandling i 0,5, 1, 2, 4 og 6 timer, n = 6. EGF data vist som en positiv kontrol. C) Graf, der viser forholdet mellem pEGFR til total EGFR (pEGFR /total EGFR-forhold) efter 10 uM cisplatin behandling i 0,5, 1, 2, 4 og 6 timer, n = 6. En-vejs ANOVA af data afslørede en signifikant virkning af cisplatin behandling og signifikante forskelle fra kontrol, som bestemt ved Dunnet post hoc analyse angivet med * p 0,05, ** p 0,01, *** p. 0,001

A) Repræsentative western blots af pEGFR, total EGFR og GAPDH af OVCA 433 celler – /+ 10 uM cisplatin i 1 time i nærvær og fravær af EGFR specifikke inhibitor AG1478 (2 uM, i 24 timer før inkubering). B) Repræsentative Western blots for pJAK2 (tyr1007 /1008), samlede JAK2, Pakt (Ser473), total AKT og GAPDH. OVCA 433 celler – /+ 10 uM cisplatin for 1-4 timer, og i nærværelse af AG1478. De data, der genereres for følgende grafer repræsenterer mindst 4 uafhængige forsøg dvs. ~ 4 forskellige behandling /indsamling grupper og ~ 4 forskellige immunblots. C) Ratio af JAK2 aktivering (pJAK2 /samlede JAK2) data opnået efter 10 uM cisplatin behandling for 1-4 timer, og i overværelse af AG1478, n = 4-6. Betydelige stigninger fra kontrolprøver observeret ved 4 timers cisplatin behandling. AG1478 forinkubering i 24 timer stumpe basale niveauer af aktiveret JAK2 samt cisplatin inducerede stigninger i JAK2 aktivering ved 4 timer (AG + 4). D) Forholdet mellem AKT aktivering (Pakt /samlede AKT) data opnået efter 10 uM cisplatin behandling for 1-4 timer, og i overværelse af AG1478, n = 4-7. Betydelige stigninger fra kontrolprøver observeret ved 4 timers cisplatin behandling. AG1478 forinkubering i 24 timer stumpe cisplatin inducerede stigninger i AKT aktivering ved 4 timer (AG + 4). En-vejs ANOVA viste en signifikant effekt af behandling og efter Dunnet indlæg hoc test signifikante forskelle fra kontroller er angivet med * p 0,05, ** p. 0,01

In vitro

køb af cisplatin modstand

for at vurdere betydningen af ​​EGFR aktivering i udviklingen af ​​platin modstand, vi designet en

in vitro

paradigme af platin modstand baseret på tidligere offentliggjorte arbejde [20] ( fig 3A). Cisplatin-resistente (CPR) celler dyrket under adhærerende (monolag) betingelser udviste morfologiske ændringer sammenlignet med kontrolceller (fig 3B). Litteraturen viser, at 3D-modeller, såsom flercellede aggregater MCA’er (), mere præcist afspejler æggestokkene kræftcelle

in vivo

svar [33], og kan være vigtigt i forståelsen resistens [34]. CPR MUB var synligt mere kompakt sammenlignet med passage kontrol MUB (Fig 3B). Dette er konsistent med vores tidligere resultater, der viser, at kompakte MUB er mere modstandsdygtige over for cisplatin [22]. Monolag cisplatin levedygtighed analyser viste en 5 gange stigning i IC

50 (kontrol IC

50 = 12,7 pM vs. CPR IC

50 = 72,9 uM) (fig 3C). To-vejs ANOVA viste en signifikant virkning af cisplatin, signifikant effekt af celletype (kontrol vs. CPR) og en signifikant interaktion. Levedygtighed assays for MUB viste, at CPR MUB var steget i IC

50 i forhold til passage kontrol MUB (styre MCA IC

50 = 44,0 pM vs. CPR MCA IC

50 = 79,5 uM) (Fig 3D) . Igen, to-vejs ANOVA viste en signifikant virkning af cisplatin, celletype og interaktion. Således er vores

in vitro

model af platin modstand viste sig at være et værdifuldt redskab i at undersøge de molekylære ændringer, der er involveret i udviklingen af ​​cisplatin resistens.

A) Skematisk af cisplatin modstand paradigme, som beskrevet i Materialer og metoder. B) repræsentant 10X billeder af OVCA 433 kontrol og cisplatin resistente (CPR) celler som et monolag og som multicellulære aggregater (MCA). Scale bar = 100 um. C) Cellelevedygtighed af monolag kontrol (sort linie), IC

50 = 12,7 uM, og CPR (grå linie) IC

50 = 72,9 pM, som respons på cisplatin behandling med doser [5, 10, 20, 50, 100 uM] i 48 timer. Data udtrykt i procent af ubehandlede kontrolceller, n = 8. To-vejs ANOVA viste en betydelig samlet væsentligste virkning af celletype (kontrol vs. CPR) [F (1,84) = 88,10, p 0,001], en signifikant virkning af cisplatin eksponering [F (5,84) = 61,87, p 0,001], samt en signifikant interaktion [F (5,84) = 4,353, p 0,01]. Signifikante forskelle i levedygtighed observeret ved 5, 10, 20, 50, 100 uM cisplatin i kontrolceller, ** p 0,01, *** p 0,001. D) Cellelevedygtighed af MUB kontrol (sort linie), IC

50 = 44,0 uM, og CPR (grå linie), IC

50 = 79,5 pM, som respons på cisplatin behandling med doser [5, 10, 20 , 50, 100 uM] i 48 timer. Data udtrykt i procent af ubehandlede kontrolceller, n = 7. To-ANOVA viste en betydelig samlet væsentligste virkning af celletype (kontrol vs. CPR) [F (1,72) = 30,41, p 0,001], en signifikant virkning af cisplatin eksponering [F (5,72) = 128,3, s 0,001], samt en signifikant interaktion [F (5,72) = 3,946, p 0,01]. Væsentlige forskelle i levedygtighed observeret ved 50, 100 uM cisplatin i kontrol celler, *** p. 0,001

Karakterisering af signalveje i CPR celler

CPR celler forblev resistente over for yderligere cisplatin behandling, selv i fravær af yderligere udsættelse for cisplatin viser en vedvarende ændring i CPR celler i forhold til deres passage kontrol. Mens andre rapporterede, at hyperaktivitet af EGFR er associeret med platinmodstandstermometer [20], observerede vi ingen forskel i basale niveauer af pEGFR i CPR-celler sammenlignet med kontrolceller (fig 4A). Desuden fandt vi, at CPR celler ikke vise betydelige stigninger i basale niveauer af EGFR nedstrøms signalveje såsom JAK2, AKT, STAT3, ERK1 /2 (S1 Fig). Imidlertid CPR celler forblev modtagelige for cisplatin-induceret aktivering af EGFR ved re- udsættelse for lægemidlet i 1 time, uden samtidige ændringer i total EGFR niveauer (Fig 4A). CPR-celler viste en betydelig stigning i EGFR aktivering (forholdet pEGFR /total EGFR), når cellerne blev igen eksponeret for cisplatin (fig 4B). I overensstemmelse med vores observationer i figur 1, viser vi en betydelig stigning i EGFR-aktivering, når kontrol celler blev behandlet med cisplatin, men der var ingen signifikante forskelle observeret mellem kontrol- og CPR celler i fravær af cisplatin.

A) repræsentative western blots af pEGFR, Total EGFR og GAPDH til kontrol og CPR celler – /+ 10 uM cisplatin (re-eksponering) i 1 time. B) afbildet data for forholdet mellem EGFR aktivering (pEGFR /total EGFR) i kontrol- og CPR celler efter cisplatin re-eksponering. Envejs ANOVA efterfulgt af Tukey post hoc afslørede signifikante stigninger i EGFR-aktivering i kontrolceller behandlet med cisplatin og i CPR celler behandlet med cisplatin sammenlignet med deres ubehandlede modstykker, men CPR-celler var ikke signifikant anderledes end kontrolceller i fravær af cisplatin. * P. 0,05, ** p, 0,01

Akut cisplatin behandling øger DNMT aktivitet og denne effekt er afhængig af EGFR aktivering

Fordi EGFR aktivering øger DNMT aktivitet og DNA methylering og der er en etableret forbindelse mellem DNA-methylering og platinmodstandstermometer (27-32), evaluerede vi virkningerne af akut cisplatin eksponering på DNMT aktivitet. OVCA 433 celler behandlet med cisplatin udviste signifikant forøget DNMT aktivitet ved 1 time, når sammenlignet med kontroller (Fig 5A). EGF-behandling blev anvendt som en positiv kontrol i disse undersøgelser som vi tidligere viste forøget DNMT aktivitet under disse betingelser [11]. Derudover inhibering af EGFR med AG1478 forhindrede cisplatin inducerede stigning i DNMT aktivitet efter 1 time (figur 5B), hvilket viser, at denne stigning i DNMT aktivitet er afhængig af cisplatins aktivering af EGFR. Der var ingen signifikante forskelle observeret mellem kontrolprøver og AG1478 alene behandlede prøver, heller ikke var der en signifikant forskel mellem AG1478 alene og AG1478 + cisplatin grupper.

A) Normalized DNMT aktivitet efter behandling med 10 pM cisplatin for 0- 4 timer, n = 4. 10 nM EGF-behandling i 15 minutter blev anvendt som en positiv kontrol. Envejs ANOVA viste en signifikant virkning af cisplatin behandling og signifikante forskelle fra kontrol som bestemt ved Dunnet post hoc-analyse er angivet med * p 0,05. B) Normaliseret DNMT aktivitet efter behandling med 10 pM cisplatin i 1 time i nærvær og fravær af 2 uM AG1478 (24-timers præinkubation), n = 5. En-vejs ANOVA efterfulgt af Tukey post hoc analyse viste, at EGFR specifikke inhibitor AG1478 betydeligt svækket cisplatin inducerede effekter på DNMT aktivitet. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001

DNMT aktivitet og global DNA methylering øges i CPR celler, men EGFR hæmning mindsker denne ændring

CPR-celler viste en betydelig stigning i DNMT aktivitet sammenlignet med passage kontrolceller (fig 6A). Så vi udnyttede EGFR inhibitor, Erlotinib, at undersøge, om DNMT aktivitet kunne forhindres under cisplatin behandling. Erlotinib behandlinger alene påvirkede ikke DNMT aktivitet imidlertid erotinib co-behandling med cisplatin under platinmodstandstermometer paradigme (Erlotinib CPR) svækkede cisplatin inducerede stigning i DNMT aktivitet. For at vurdere konsekvenserne af øget DNMT aktivitet, vi så målte globale DNA methylering (total 5-methyl-cytosin indhold) i de eksperimentelle grupper (Fig 6B). Data blev normaliseret til værdier opnået for kontrolceller og plottes som en procentdel af kontrollen. I alt 5-methyl-cytosin indhold blev øget betydeligt i CPR celler, men denne stigning blev svækket i celler under EGFR hæmning under platin modstand paradigme. Disse undersøgelser bekræfter, at cisplatin inducerede ændringer til DNMT aktivitet og DNA-methylering er afhængige af EGFR aktivering. Denne stigning i DNMT aktivitet og DNA-methylering i CPR-celler kunne ikke forklares ved forøgede niveauer af DNMTs stede i disse celler. Faktisk analyse af DNMT niveauer i i kontrol- og CPR-celler viste, at DNMT1 og en phosphoryleret form af DNMT1 i serin 714 (pDNMT1) tidligere knyttet til EGFR aktivering [35] er begge faldt betydeligt i CPR celler (S2 Fig). DNMT3A, DNMT3B og DNMT3L alle viste ingen signifikante forskelle i CPR celler sammenlignet med kontroller.

A) Normalized DNMT aktivitet i kontrol, CPR celler samt celler, der har modtaget EGFR inhibitor Erlotinib kun eller Erlotinib + cisplatin under cisplatin resistens paradigme, n = 4. En-vejs ANOVA efterfulgt af Dunnet post hoc viste, at Erlotinib samtidig behandling med cisplatin i cisplatin modstand paradigme svækkede forøgelsen i DNMT aktivitet observeret i CPR-celler. B) Normaliseret procent 5-methylcytosin (5mC) eller DNA global methylering til styring, CPR-celler samt celler, der modtog EGFR-inhibitor Erlotinib kun eller Erlotinib + cisplatin i cisplatin modstand paradigme, n = 4-6. Envejs-ANOVA efterfulgt af Tukey post hoc afslørede en signifikant stigning i den globale DNA-methylering i CPR-celler, men ikke i celler, der modtog Erlotinib * p. 0,05

EGFR inhibition reducerer omfanget af resistens observeret i in vitro-model af platin modstand

i betragtning af den dokumentation for, at bruge DNMT hæmmere vender platin modstand [6-10] samt vores observationer, at EGFR-hæmning svækket DNMT aktivitet og DNA methylering i CPR celler, vi testede, om dette resulterede i en ændring i platin følsomhed. Som oprindeligt påvist i figur 3, fandt vi i et separat sæt eksperimenter, CPR celler er markant mere resistent deres passage kontrol modstykker dyrket som monolag (kontrol IC

50 = 15,8 pM vs. HLR IC

50 større end 100 pM) (fig 7B) og MUB (kontrol IC

50 = 28 pM vs. HLR IC

50 større end 100 pM) (fig 7C). Hæmning af Erlotinib alene ikke påvirker følsomheden over for cisplatin; monolag (Erlotinib IC

50 = 12 uM) og MUB (Erlotinib IC

50 = 32 uM). EGFR-hæmning med Erlotinib under platin modstand paradigme reducerer graden af ​​modstand observeret i CPR celler til både monolag (CPR IC

50 større end 100 pM vs. Erlotinib CPR IC

50 = 59 uM) og MUB (CPR IC

50 større end 100 pM vs. Erlotinib CPR IC

50 = 86 uM). To-vejs ANOVA viste en signifikant effekt af celletype (kontrol vs. Erlotinib vs. CPR vs Erlotinib CPR), en signifikant effekt af cisplatin behandling og en signifikant interaktion. En post-hoc analyse viste signifikante forskelle mellem CPR og Erlotinib på 50 uM og 100 uM. Tilsammen antyder dette, at EGFR spiller en rolle i udviklingen af ​​platinmodstandstermometer som EGFR inhibering formindsket mængden af ​​modstand, som blev opnået ved vores model for platinmodstandstermometer.

A) repræsentant 10X billeder af OVCA 433 kontrol , Erlotinib behandlet, cisplatin resistente (CPR) og celler, der fik Erlotinib og cisplatin i platin resistente paradigme (Erlotinib CPR) som et monolag og som flercellede aggregater (MCA). Scale bar = 100 um. B) Cell levedygtighed monolag kontrol (sort linje), IC

50 = 15,8 uM, CPR (grå linie) IC

50 100 uM, Erlotinib alene (stiplede sorte linie), IC

50 = 12 uM, og Erlotinib CPR (punkteret grå linie) IC

50 = 59 uM, som respons på cisplatin behandling med doser [5, 10, 20, 50, 100 uM] for 48hrs. Data udtrykt i procent af ubehandlede kontrolceller, n = 4. To-vejs ANOVA viste en betydelig samlet væsentligste virkning af celletype (kontrol vs. Erlotinib vs. CPR vs Erlotinib CPR) [F (3,72) = 65,88, p 0,001], samt en signifikant interaktion [F (15,72) = 3,468, p 0,001].