PLoS ONE: Differential rolle for Human Cholin kinase α og p Enzymer i Lipid Metabolism: Konsekvenser i Cancer Onset og behandling

Abstrakt

Baggrund

Kennedy vej genererer phosphocoline og phosphoethano gennem sine to grene. Cholin kinase (Chok) er det første enzym af Kennedy gren af ​​syntese af phosphocholin, hovedkomponenten af ​​plasmamembranen. Chok-familien af ​​proteiner er sammensat af ChoKα og ChoKβ isoformer, den første med to forskellige varianter af splejsning. Senest ChoKα er blevet impliceret i den carcinogene proces, da det er overudtrykt i en række humane cancere. Imidlertid har ingen beviser for en rolle ChoKβ i carcinogenese blevet rapporteret.

Metode /vigtigste resultater

Her vi sammenligner

in vitro

in vivo

egenskaber ChoKα1 og ChoKβ i lipidmetabolisme, og deres potentielle rolle i carcinogenese. Både ChoKα1 og ChoKβ viste cholin og ethanolamin kinase aktiviteter, når analyseret i celleekstrakter, dog med forskellig affinitet for deres substrater. Men de opfører sig forskelligt ved overekspression i hele celler. Betragtninger ChoKβ vise en ethanolamin kinase rolle, ChoKα1 præsentere en dobbelt cholin /ethanolamin kinase rolle, hvilket tyder på at inddrage de enkelte Chok isoform i distinkte biokemiske veje under

in vivo

betingelser. Derudover, medens overekspression af ChoKα1 er onkogen ved overekspression i HEK293T eller MDCK-celler, ChoKβ overekspression er ikke tilstrækkelig til at fremkalde

in vitro

celletransformation eller

in vivo

tumorvækst. Endvidere blev en signifikant opregulering af ChoKα1 mRNA-niveauer i et panel af bryst- og lungekræft cellelinier fundet, men ingen ændringer i ChoKβ mRNA-niveauer blev observeret. Endelig MN58b, en tidligere beskrevet potent inhibitor af Chok med

in vivo

antitumoraktivitet, viser mere end 20 gange højere effektivitet mod ChoKα1 end ChoKβ.

Konklusion /Betydning

Denne undersøgelse er den første bevis på den klare metaboliske rolle ChoKα og ChoKβ isoformer, hvilket tyder på forskellige fysiologiske roller og konsekvenser i menneskelig carcinogenese. Disse resultater udgør et skridt fremad i udformningen af ​​en antitumoral strategi baseret på Chok hæmning

Henvisning:. Gallego-Ortega D, Ramirez de Molina A, Ramos MA, Valdes-Mora F, Barderas MG, Sarmentero-Estrada J et al. (2009) Differential rolle for Human Cholin kinase α og p Enzymer i Lipid Metabolism: Konsekvenser i Cancer Onset og behandling. PLoS ONE 4 (11): e7819. doi: 10,1371 /journal.pone.0007819

Redaktør: Suzannah Rutherford, Fred Hutchinson Cancer Research Center, USA

Modtaget: Juni 22, 2009; Accepteret: 7. oktober 2009. I Udgivet: November 12, 2009

Copyright: © 2009 Gallego-Ortega et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er blevet støttet af tilskud til JCL fra Comunidad de Madrid (GR-SAL-0821-2004), Ministerio de Ciencia e Innovación (SAF2008-03750, RD06 /0020/0016), Fundación Mutua Madrileña, og af en bevilling til ARM fra Fundación Mutua Madrileña. DGO var en kollega fra Comunidad de Madrid. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Menneskelig cholin kinase alpha (ChoKα) og beta (ChoKβ) er medlemmer af cholin kinase familien. I pattedyr denne familie er kodet af to separate gener,

CHKA

og

CHKB

, hvilket resulterer i tre forskellige proteiner med en cholin /ethanolamin kinase (Chok /ETNK) domæne: ChoKα1 (NP_001268), ChoKα2 (NP_997634) og ChoKβ1 (NP_005189) [1]. ChoKα1 afviger fra ChoKα2 i kun en ekstra strækning på 18 aminosyrer, mens ChoKβ afviger fra ChoKα1 og ChoKα2 hos ca. 40%. Tilstedeværelsen af ​​Chok /ETNK domæne bibringer evnen til at katalysere phosphoryleringen af ​​cholin (Cho) til phosphocholin (PCho) [1]. Dette udgør det første trin i biosyntesevejen af ​​phosphatidylcholin (PC) [2]. PC er den største phospholipid i eukaryote membraner og spiller en kritisk rolle i membranen struktur og også i cellesignalering [2]. Chok enzymer kunne også impliceret i syntesen af ​​phosphatidylethanolamin (PE), idet der som substrat ethanolamin at gøre phosphoethanolamin (PETN) [1], [3] – [5]

Tidligere undersøgelser tyder på, at Chok fungerer som. et dimert protein [6], [7] og er blevet foreslået at andelen af ​​de forskellige homo- eller hetero- dimer population at være vævsspecifik [8]. Desuden kombinationen mellem cholin kinase isoformer resulterer i et andet niveau af Chok aktivitet

in vitro

under cellefrie systemer betingelser. Den α /α-homodimeren er således den mest aktive cholin kinase form er β /β-homodimer de mindre aktive, og α /β heterodimeren har en mellemliggende fænotype [8].

specifik phospholipase D-drevet hydrolyse af PC genererer cholin og signaltransduktion metabolitter, såsom PA (phosphatidsyre), og dens derivater LPA (lysophosphatidsyre) og DAG (diacylglycerol), der er vigtige i mitogenese og cellulær transformation [9] – [11]. Cholin bliver yderligere konverteret af Chok til PCho, en stabil metabolit stand til at inducere mitogenese i murine fibroblaster [12]. Desuden flere onkogener såsom

RAS

eller

RhoA

stigning ChoKα aktivitet resulterer i højere intracellulære niveauer af PCho [13] – [16]. Magnetisk resonans spektroskopi (MRS) undersøgelser har afsløret unormal phospholipidmetabolisme i cancerceller [17], [18]. Endvidere høje PCho er blevet fundet i tumorceller såvel som i tumorprøver kræftpatienter sammenlignet med den normale modstykker i bryst-, prostata-, hjerne- og ovariecancer [19], – [25]. Stigningen i phosphoethano er også rapporteret i transformerede celler eller tumor prøver ved hjælp af MRS, selv om det bidrager til en langt mindre grad, sammenlignet med stigningen i PCho, til phosphomonoester peak [26].

Implikationen af ChoKα i cellevækst, proliferation, initiering og progression af cancer er veldokumenteret. ChoKα overudtrykkes i nogle af de mest almindelige cancerformer, såsom bryst-, lunge-, tyktarms-, prostata- [27] – [30] og blære (upublicerede observationer). Desuden har onkogen aktivitet ved overekspression i humane celler [15]. Øgede ChoKα mRNA niveauer er for nylig blevet beskrevet som en uafhængig prognostisk markør i ikke små patienter celle lungekræft [30]. Også, humane brystcancercellelinier viser opregulering af ChoKα men ikke ChoKβ, når man sammenligner med normale mammaepitelceller [21]. I den forstand er det for nylig blevet rapporteret, at i prostata tumor musemodel (TRAMP) ved anvendelse IHQ immunodetektering af ChoKβ, et lavt niveau ekspression af ChoKβ blev fundet i tumorale prøver sammenlignet med vildtype væv [31].

Implikationen af ​​medlemmer af Rho GTPase familien i kræft debut og progression er blevet grundigt beskrevet [32] – [35]. Bevis for, at Chok er involveret i malign transformation sammen med Ras og RhoA er givet [14], [15], [36]. Desuden er aktiviteten af ​​ChoKα moduleres af kendte effektorer af både Ras og RhoA [15], [29].

Farmakologisk hæmning af ChoKα er blevet foreslået som en hidtil ukendt antitumoral [2] strategi. En stærk støtte til denne strategi er baseret på anvendelsen af ​​MN58b, en velkarakteriseret ChoKα inhibitor, som viser en potent antiproliferativ virkning i flere tumorale cellelinier in vitro, og en kraftig reduktion af tumorvækst i nøgne mus xenotransplantater [14], [37] – [40]

Vi har sammenlignet de biokemiske og biologiske egenskaber af ChoKα og ChoKβ, og viser, at ud over deres homologi, sidstnævnte ikke er i stand til at inducere celletransformation i HEK293T eller MDCK-celler.. Desuden foreslår vi forskellen adfærd mellem a- og p-isoformer i fosfolipider stofskifte. Endelig kan antitumorale egenskaber MN58b tilskrives dets specifikke hæmning af ChoKα. Konsekvenserne af disse resultater diskuteres.

Resultater

Karakterisering af enzymatiske egenskaber ChoKα1 og ChoKβ isoformer

Aktiviteten af ​​både cholin kinase isoformer, ChoKα1 og ChoKβ, har været tidligere beskrevet i forskellige pattedyrvæv, men deres cholin kinase og /eller ethanolamin kinaseaktiviteter er ikke fuldt karakteriseret [1], [4], [41] – [43]. Således har vi først foretaget en sammenlignende analyse af

in vitro

kinase aktiviteten af ​​de to menneskelige ChoKα1 og ChoKβ isoformer, med hensyn til deres evne til at phosphorylere cholin og ethanolamin. HEK293T celler blev transficeret med passende ekspressionsvektorer, der bærer de humane CHKA eller CHKB gener eller en tom vektor, og testet for Chok og ETNK aktivitet. Ekspressionsniveauer opnået blev kontrolleret ved Western blot (figur 1a) og den relative enzymaktivitet fra celleekstrakter anslået. Både ChoKα1 og ChoKβ viste cholin og ethanolamin kinase aktiviteter under disse eksperimentelle betingelser, men den omregningskurs var tilsyneladende anderledes (figur 1b).

HEK293T celler blev transficeret med eukaryote ekspressionsvektorer af humant ChoKα1 og ChoKβ1 gen. pCDNA3b tom vektor blev anvendt som kontrol. A) Overekspression af ChoKα1 og ChoKβ1 i HEK293T celler opdaget af Western Blot. GAPDH detektion blev anvendt som kontrol af ekspression niveau. B, C) In vitro Chok (B) og ETNK (C) aktivitet af cholin kinase α1 og p1 isoformer i cellefrie ekstrakter af HEK293T transficerede celler. Procentdel af konvertering af

14C-cholin eller

14C-ethanolamin til det phosphorylerede produkt er repræsenteret. Eksperimentet blev udført i dobbeltprøver, gentages 4 gange, og gennemsnit ± SEM værdier fra alle eksperimenter estimerede.

Vi analyserer Chok og ETNK kinetiske aktiviteter for ChoKα1 og ChoKβ isoformer under anvendelse af de rekombinante enzymer yderligere. DH5a

Escherichia coli

blev transformeret med det gen, der koder for den menneskelige ChoKα1 eller ChoKβ og en enzymatisk

in vitro

assay til enten Chok eller ETNK aktiviteter udføres. Michaelis konstanter (Km) for hver isoform for de forskellige substrater blev opnået (tabel 1). ChoKβ viste en kilometer for cholin 2,8 gange højere end ChoKα1. Derimod kilometer af ChoKβ for ethanolamin var lavere end ChoKα1. Disse resultater tyder på, at cholin i cellefrie systemer er en bedre substrat for ChoKα1 (2,85 gange) end ChoKβ, mens ethanolamin er en bedre substrat for ChoKβ (5,83 gange) end ChoKα1.

Chok isoformer er differentielt reguleret af Ras og Rho GTPaser Salg

Da Ras og RhoA GTPaser er opstrøms regulatorer af ChoKα1 [15], [28], nogle af de mest undersøgte proteiner af lille GTPase-familien, herunder H-Ras, og Rho -Family medlemmer RhoA og Cdc42 blev testet som potentielle opstrøms modulatorer af ChoKβ. Med henblik herpå blev en

in vitro

Chok og ETNK aktivitet assay udført i HEK293T celler transficeret med de konstitutive aktive mutanter af hver GTPase (fig. 2a) og enten ChoKα1 og ChoKβ. Som vist i figur 2, ingen af ​​de testede GTPaser kunne øge cholin eller ethanolamin kinaseaktiviteten af ​​ChoKβ. Derimod under lignende betingelser, Ras og RhoA var i stand til at inducere en statistisk signifikant ændring i aktiveringen af ​​både Chok og ETNK aktiviteter ChoKα1 (fig. 2b og 2c).

Cholin kinase-isoformer blev udtrykt alene eller i kombination med de angivne Ras og Rho GTPaser og

in vitro

Chok-aktivitet bestemmes. A) Analyse af ektopisk ekspression med Western Blot i HEK293T transficerede celleekstrakter af ChoKα1 (52 kDa), ChoKβ1 (45 kDa), RhoA-QL (22 kDa), Cdc42-QL (25 kDa) og H-RASV12 (23 kDa) . Tomme vektorer blev brugt som kontrol for de endogene niveauer, og GAPDH som lastning kontrol. B) og C)

In vitro

cholin kinaseaktiviteten af ​​ChoKα1 eller ChoKβ1 i nærvær af forøget ekspression af konstitutive aktive former af RhoA, Cdc42 eller H-Ras. D) og E)

In vitro

ethanolamin kinaseaktiviteten af ​​ChoKα eller ChoKβ i nærvær af hver angivet konstitutiv aktiv form af GTPase. Resultaterne er repræsenteret som fold induktion af omdannelse til den tilsvarende phosphoryleret metabolit bestemt som total cpm /ug hele cellulære ekstrakt, og normaliseret til de tomme vektor transfekterede celler som kontrol. De viste data repræsenterer middelværdier ± SEM for 3 uafhængige eksperimenter, hver udført med dobbelte prøver. Statistisk signifikans (p ≤ 0,05) er markeret med en stjerne sammenligne med den aktivitet, opnås, når ChoKα1 eller ChoKβ1 eventuelt transficeres alene.

Differential rolle mellem Chok isoformer i celle transformation og tumorigenese

Implikationen af ​​ChoKα1 i celletransformation og human carcinogenese er blevet grundigt undersøgt, og det har vist sig at vise onkogen aktivitet [15], [36]. På grund af sin omfattende homologi, undersøgte vi, om ChoKβ kunne fremkalde cellulær transformation når overudtrykt i ikke-tumorigene celler. Først blev evnen hos ChoKβ-transficerede celler til at fremme forankringsuafhængig cellevækst bestemt under anvendelse cellelinien HEK293T. Som tidligere rapporteret, ChoKα1 inducerede en signifikant stigning i antallet af blød agar kolonier [15]. Derimod under lignende betingelser, ChoKβ overekspression havde ingen signifikant effekt på antallet eller størrelsen af ​​kolonierne i forhold til dem, der genereres af kontrol, tom vektor transficerede HEK293T celler (Fig. 3). Disse resultater blev bekræftet ved anvendelse af en anden ikke-tumorigen cellelinie fra en anden art, såsom MDCK, opnå lignende resultater på trods af det lavere niveau af overekspression af både Chok isoformer sammenlignet med HEK293T celler. Den differentielle niveau af ekspression opnået skyldtes den temmelig forskellige effektivitet i transfektion for hver cellelinier (data ikke vist).

A) og B)

In vitro

Chok aktivitet af cellefri ekstrakter fra transficerede celler på det tidspunkt, plating, bestemt som konvertering af

14C-mærket cholin til PCho. C) Fotografier af et repræsentativt eksperiment af blød agar-assay. I alt 10

5 celler blev udpladet pr 60 mm skål, og antallet af kolonier kvantificeret efter 5-8 ugers inkubation. D) og E) Computer-baseret automatisk kvantificering af antallet af kolonier, middelværdier ± SEM er repræsenteret. Analysen udførtes 3 uafhængige gange med tredobbelte prøver opnå lignende resultater. Statistisk signifikans (p ≤ 0,05) er markeret med en stjerne.

evne ChoKβ at fremkalde tumorvækst blev også undersøgt. Både ChoKα1- og ChoKβ-transficerede HEK293T eller MDCK-celler blev subkutant inokuleret i athymiske mus. Som vist i fig. 4, overekspressionen af ​​ChoKα1 var tilstrækkelig til at inducere tumorvækst hos immunsupprimerede mus i begge cellesystemer analyseres. Derimod celler, der overudtrykker ChoKβ var ikke i stand til at inducere tumorvækst under lignende betingelser. Som angivet ovenfor er sammenligningen i tumorvæksthastigheder mellem begge cellelinier relateret til forskelligartede effektivitet transfektion, meget højere i HEK293T (aproxm. 80-90%) end MDCK (aproxm. 15-20%). Disse resultater er i overensstemmelse med dem, der opnås i de bløde-agar eksperimenter, og kraftigt tyder på, at overekspression af ChoKβ ikke er tilstrækkelig til at inducere tumorvækst under betingelser, hvor ChoKα1 gør.

xenotransplantater blev indført ved s.c. injektion af transficerede HEK293T eller MDCK-celler i athymiske nu /nu nøgne mus. A) og B) Western blot-analyse af ektopisk ekspression af cholin kinase-isoformer i transficerede HEK293T eller MDCK-celler, henholdsvis før mus inokulering. C) og D) Analyse af cholin kinaseaktivitet i ChoKα1 eller β1 transficerede HEK293T eller MDCK-celler-fri ekstrakter forud mus inokulering. E) og F) Volumen af ​​tumorer frembragt ved subkutan injektion af 10

6 transficerede celler. Tumoral volumen blev beregnet efter formlen:

Vol = [D * d

2] /2

, hvor D og d er større og mindre tumordiametre hhv. Dataene fra HEK293T repræsenterer middelværdier ± SEM fra to uafhængige forsøg (n

1 = 12, n

2 = 16), MDCK eksperiment svarer til et tilsvarende eksperiment med n = 12.

ChoKβ isoform viser fortrinsret ETNK aktivitet

in vivo

Vi næste undersøgt, om der var nogen forskel i den enzymatiske aktivitet af både Chok isoformer under

in vivo

forhold, kunne forklare deres differential biologisk aktivitet. Således blev aktiviteten af ​​ChoKα1 og ChoKβ som Chok og /eller ETNK i en hel-celle-system testet. Intracellulære lipider af human HEK293T overudtrykker ChoKα1, ChoKβ eller transficeret med en tom vektor, blev ekstraheret en analyseret. Begge blev den uopløselige lipid fraktion, der indeholder hydrofobe lipider og samlede proteinindhold anvendt som ladningskontrol opnå lignende resultater. Som vist i figur 5A, blev de intracellulære phosphoethanolamin niveauer steg i et lignende omfang i ChoKα1- eller ChoKβ-transficerede celler. Men de intracellulære phosphocholin niveauer af ChoKβ-transficerede celler var ikke signifikant afviger fra kontrolceller, mens ChoKα1-transficerede celler viste en forøget intracellulær PCho niveauer (figur 5B). Lignende resultater blev opnået under anvendelse af epitelceller med forskellig oprindelse: human brystadenokarcinomceller SK-Br-3 (fig 5C, D.) Eller det humane ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) cellelinie H1299 (fig 5E, F.). Desuden i alle cellelinjer analyseret, proteinekspression blev også bestemt ved Western blot-analyse (fig. 5G).

HEK293T blev SK-BR-3 eller H1299-celler transficeret med eukaryote ekspressionsvektorer af humant ChoKα1 og ChoKβ1 gen eller pCDNA3b tom vektor anvendt som kontrol. A), C) og E) Intracellulær ETNK aktivitet af cholin kinase a1 og p1 isoformer i hele celler i HEK293T, H1299 og SK-BR-3-celler henholdsvis. B), D) og F) Intracellulær Chok aktivitet af ChoKα og ChoKβ isoformer i hele celler i HEK293T, H1299 og SK-BR-3-celler henholdsvis. Mængden af ​​

14C-PCho og

14C-PETN blev ekstraheret og kvantificeret som beskrevet i Materialer og Metoder. Eksperimentet blev udført i tredobbelte prøver, gentaget 3 gange, og middelværdier ± SEM fra alle eksperimenter estimerede. Statistisk signifikans (p ≤ 0,05) er markeret med en stjerne. Et typisk radio-mærkning eksperimentresultaterne i ca. 70% af radioaktivt stof inkorporering i cellerne. G) repræsentant Western Blot for ektopisk ChoKα1 eller ChoKβ1 ekspression i hver cellelinie. Basislinjeværdierne valgt som 1-fold i graferne for hver cellelinje repræsenterer: HEK293T celler (PCho: 1153 cpm; PETN: 1231 cpm); H1299 celler (PCho: 22821 cpm; PETN: 13339 cpm)., Og SK-BR-3-celler (PCho: 18620 cpm, PETN: 3151 cpm)

Således forskellen enzymatiske aktivitet af ChoKα1 og ChoKβ fundet i HEK293T ikke cellelinie specifikke. Disse resultater indikerer, at ChoKα1 men ikke ChoKβ, er i stand til at inducere forøgede intracellulære niveauer af PCho under

in vivo

betingelser. Men under de samme betingelser begge enzymer er i stand til at generere phophorylethanolamine. Selv om ChoKβ viser både Chok og ETNK aktivitet under

in vitro

forhold, det viser fortrinsret ETNK aktivitet

in vivo

.

Øget ChoKα mRNA, men ikke ChoKβ i tumor-afledte cellelinjer

for yderligere at undersøge relevansen af ​​hver Chok isoenzym i tumorogenesis, vi bestemt niveauerne af både ChoKα og ChoKβ mRNA i et panel af humane tumor-afledte cellelinjer ved kvantitativ PCR-teknologi . Et panel af bryst- og lungekræft cellelinier blev sammenlignet med det primære, senescent, ikke-tumoral cellelinie HMEC (Human mammaepitelceller) eller de immortaliserede, ikke-tumorigene MCF10A celler som kontrol bryst cellelinier og primære bronchieepithelceller Cells ( BEC) som kontrol lunge cellelinie. Alle tumor cellelinier testet væsentligt overekspression ChoKα mRNA i forhold til de normale cellelinjer, hvorimod der ikke blev fundet nogen ændringer for ChoKβ mRNA-niveauer (fig. 6). Disse resultater viser, at ChoKβ ikke er specifikt opreguleret i bryst- eller lungecancerceller, hvilket antyder, at høje niveauer af ChoKβ ikke er nødvendige for fremme af kræft.

Q-PCR blev udført for at bestemme niveauet af ekspression af mRNA i ikke-tumorigene mammary cellelinjer (HMEC, MCF10A), brystcancercellelinier (MDA-MB435, MDA-MB468, T47D, MCF7), ikke-tumorigene lungeceller (BEC) og lungekræft cellelinier (H510, H82). Dataene blev normaliseret med den endogene 18S ribosomalt RNA. Til sammenligning mellem tumorale og ikke-tumor cellelinier blev 2

-ΔΔCt anvendte metode og log

10 RQ er repræsenteret. Bemærk, at dataene henvises til de humane mammae epithelceller (HMEC) mRNA-niveauer i bryst cellelinjer og ingen signifikant forskel i niveauet af både Chok isoformer mRNA blev fundet med den normale MCF10A cellelinie. Referencen for lungekræft celler var de primære bronchieepithelceller Cells (BEC).

MN58b er en specifik hæmmer af ChoKα isoform

Implikationen af ​​ChoKα i human carcinogenese er blevet brugt til design af specifikke inhibitorer af dette enzym som en ny anticancer strategi [2], [14], [37]. MN58b er den førende forbindelse til at støtte denne roman strategi, da det har vist en potent antitumoraktivitet under

in vivo

betingelser versus menneskelige kolon, lunge, bryst og blære tumormodeller [15], [37].

Den primære struktur af pattedyr ChoKβ viser en samlet 60% homologi med den af ​​ChoKα1 [1]. Den højere grad af homologi ligger inden for cholin /ethanolamin kinasedomænet. Denne homologi kan gøre den modtagelig over for en lignende inhibering for både ChoKα1 og ChoKβ med de samme inhibitorer. Således har vi undersøgt specificiteten af ​​MN58b af disse to Chok isoenzymer for at verificere, om dets antitumor virkning specifikt er relateret til inhibering af alfa isoform, der er den ene impliceret i tumorudvikling, eller lægemidlet ligeledes påvirker både isoformer. Brug af menneskelige ChoKα1 og ChoKβ rekombinante proteiner, vi udførte en

in vitro

Chok-aktivitet inhiberingsassay under anvendelse af stigende MN58b koncentrationer bestemme IC

50 for hvert enzym. Som forventet, trods den høje lighed vises mellem Chok isoformer viste MN58b en meget højere specificitet mod ChoKα1 (IC

50 = 5 uM) end mod ChoKβ (IC

50 = 107,5 uM). Således MN58b er 21,5 gange mere potent mod ChoKα1 end ChoKβ isoform.

Diskussion

Familien af ​​menneskelige cholin /ethanolamin kinaser omfatter to gener,

CHKA

og

CHKB

der kodificerer for tre enzymer, ChoKα1 (52 kDa), ChoKα2 (50 kDa) og ChoKβ1 (45 kDa). ChoKα1 og ChoKα2 er næsten identiske, bortset fra en strækning af 18 ekstra aminosyrer i ChoKα1, som de følger af forskellen splejsning fra det samme gen,

CHKA

. Mens konsekvenserne af ChoKα1 i reguleringen af ​​cellevækst og cancer er blevet grundigt demonstreret [13], [15], [27], [28], [37], [38], [44], foreløbige beviser tyder på, at ChoKβ må ikke være involveret i carcinogenese, da det ikke er overudtrykt i brystkræft cellelinjer [21] eller i TRAMP mus prostatakræft model [31].

En tydelig menneskelige gen familie er blevet beskrevet, der koder for ETNK aktivitet [45], hvilket tyder på, at EtnK1 er det vigtigste enzym involveret i PE homeostase. Den Chok /ETNK domænenavn giver til ChoKα og ChoKβ evnen til at fungere som både Chok og ETNK aktivitet under cellefrie betingelser [1], [3] – [5], men det er stadig uvist, om disse tidligere karakteriserede enzymer viste nogen selektivitet til hver gren af ​​Kennedy-vejen i

de novo

syntese af PC eller PE. Det er for nylig blevet beskrevet forskellige specificitet mod Cho og Etn af de to isoformer af Cho /ETNK af

Tripanosoma brucei

. Ud fra følgende betragtninger

Tb

Cho /Etn1 viser kun ETNK aktivitet,

Tb

Cho /Etn2 viser både Chok og ETNK aktiviteter

in vitro

[46]. Disse resultater er i overensstemmelse med dem, der er beskrevet for murine EtnK1 der er Etn specifikke og EtnK2, der viser en dobbelt Chok /ETNK funktion [45], [47]. På den anden side, mens murine Pcyt1α og Pcyt1β er involveret i PC biosyntese, er Pcyt2 fokuseret til PE kun [48].

Men det er endnu ikke fuldt forstået som Chok isoform, eventuelle bidrager

in vivo

i hver pathway at opretholde den normale homøostase af både PC og PE i biologiske membraner. De viste resultater bekræfter, at begge enzymer har evnen til at phosphorylere cholin og ethanolamin under cellefrie betingelser, enten som rekombinante proteiner fremstillet i

E. coli

, eller i celleekstrakter fra pattedyrceller. Vi fandt imidlertid, at ChoKα1 under hele celler betingelser har evnen til at fungere som både Chok og ETNK, men ChoKβ påvirker kun produktionen af ​​PETN. Disse resultater af forskellige roller for a- og p-isoformer er i overensstemmelse med oplysningerne fra den nyligt genererede Knock Out (KO) mus for ChoKα og ChoKβ gener [49], [50]. Således ChoKβ KO-mus (

RMD

mus) er levedygtige, men udvikler en rostrocaudal muskeldystrofi, mens normal PC lipidniveauer findes i de fleste analyserede væv undtagen i bagbenet skeletmuskel [49]. Derfor ChoKα er tilstrækkelig til at opretholde normal PC niveauer i de fleste væv. Derimod er mangel på ChoKα resulterer i embryonisk dødelighed, og ChoKα

+/- heterozygote mus viser en ophobning af Cho og en reduktion i PCho i lever og testis, hvilket antyder, at der ikke er nogen ChoKβ kompensation for PC biosyntese

in vivo

. Disse resultater tyder på forskellige roller

in vivo

for både ChoKα og ChoKβ isoformer. Endvidere er de svækkede niveauer i PE fundet i ChoKα

+/- heterozygote mus tyder på inddragelsen af ​​ChoKα ikke kun i biosyntesen af ​​PC, men også i PE-vejen. Dette er også i overensstemmelse med det faktum, at i ChoKβ KO mus, PE niveauer er upåvirkede, hvilket indikerer, at PE homeostase er fuldt vedligeholdt med EtnK1 og ChoKα proteiner intakte.

Den gruppe af Ishidate har givet værdifulde oplysninger om

in vitro

aktiviteten af ​​Chok fra forskellige musevæv, og de har postuleret, at den mest aktive form for cholin kinaseaktivitet er α /α homodimer efterfulgt af α /p heterodimerer, er den β /β-homodimer de mindst aktive form [8].

in vivo

resultater vises her, er delvist i overensstemmelse med denne hypotese.

in vivo

aktiviteten af ​​ChoKβ er fokuseret i PE biosyntese og viser højere km til cholin end ChoKα, kan dette være grunden til, at beta /β dimerer viser lav chok aktivitet. Da ChoKβ blev overudtrykt observerede vi en stigning i de intracellulære niveauer af PETN, men ikke af PCho. Men fandtes ingen forskelle mellem de to isoformer til generering af PETN, da begge vise lignende ETNK aktivitet.

PCho er blevet foreslået at fremme mitogenese i pattedyrceller [12]. I tråd med dette har magnetisk resonans spektroskopi teknikker afsløret højere niveauer af phosphomonoesthers i tumorale prøver i forhold til deres normale modparter [19] – [24]. Desuden overekspression af ChoKα1 er onkogen [15], og forbedret ChoKα aktivitet er en hyppig funktion i tumorale prøver sammenlignet med normale væv [27], [28]. Tilsammen alle disse resultater kraftigt indikerer, at ChoKα1 aktivitet og PCho niveauer har en stærk konsekvenser i kræft. Endvidere overekspression af ChoKα1 resulterer i en stigning i ETNK aktivitet og PETN niveauer. Men den sidstnævnte virkning i sig selv ikke tilstrækkelig til at inducere celletransformation, da overekspression af ChoKβ inducerer forstærket kolonidannelse i blød-agar eller tumorvækst i nøgne mus. Disse resultater er konsistente med den hypotese, at det er produktionen af ​​PCho hvad er knyttet til celleproliferation og transformation medieret af Chok, og at produktionen af ​​PETN ikke kan være tilstrækkelig eller relevant i denne proces.

Ovenstående resultater antyder, at de to Chok isoformer undersøgt, udover deres lighed i deres primære sekvenser, er impliceret i forskellige metaboliske veje. Således mens ChoKα1 rammer ind i både PC og PE-syntese, ChoKβ påvirker kun PE-syntese. Desuden omdannelsen kapacitet synes at være eksklusivt til ChoKα isoformen. Men da i den menneskelige HEK293T, Sk-Br-3 og H1299 cellelinjer, ChoKα1 overekspression producerer forhøjede niveauer af både PCho og PETN, mens lignende ChoKβ overekspression kun medfører højere niveauer af PETN, men normale niveauer af PCho, kan vi ikke udelukke den mulighed, at celletransformation kræver både Chok og ETNK aktiviteter.

i overensstemmelse med den idé, der forbinder onkogen aktivitet til funktionen af ​​ChoKα, men ikke ChoKβ, den antiproliferative og antitumoraktivitet af MN58b blev først forbundet med aktiviteten af ChoKα. Som tidligere rapporteret,

in vivo

behandling med MN58b resulterer i en specifik reduktion af PCho niveauer i tumorerne, men ingen signifikant effekt på niveauerne af PETN [51]. Tidligere resultater fra vores gruppe har vist, at MN58b hæmmer også cholin transport [38]. Men denne effekt har en lille indflydelse på den antiproliferative og antitumor aktiviteten af ​​lægemidlet siden HC-3, en langt mere potent inhibitor af cholin transportører, er langt mindre potent som et antiproliferativt middel end MN58b [2]. Endvidere MN58b har en differentiel effekt på enten normale eller tumorceller, en stærk demonstration af en differentiel aktivitet på grund af Chok inhibering [38] – [40]. Disse resultater er også i overensstemmelse med den observation, at ChoKα men ikke ChoKβ er en nedstrømsmål af onkogene molekyler, såsom Ras og RhoA. Således, mens Ras aktiverer ChoKα gennem Ral-GDS og PI3K [29], og RhoA aktiverer ChoKα gennem ROCK [15], ingen af ​​disse onkogene GTPaser påvirker ChoKβ aktivitet under lignende forhold. Igen viser disse resultater, at selv om begge Chok enzymer er i stand til at phosphorylere både cholin og ethanolamin under cellefrie systemer betingelser, de udviser forskellige affiniteter for disse substrater, og i hel-celleassays betingelser, de er underlagt forskellige regulatoriske pathways.

Endelig er undersøgt inddragelsen af ​​ChoKβ i bryst- og lungecancer, ChoKα og p-mRNA-niveauer blev bestemt ved Q-PCR. Alle tumorafledte cellelinjer analyseret væsentligt overudtrykker ChoKα mRNA, mens fandtes ingen ændringer i ekspressionen af ​​ChoKβ. Lignende resultater er for nylig blevet rapporteret under anvendelse af semi-kvantitativ PCR i brystcancercellelinier [21].