PLoS ONE: Somatostatin derivat (smsDX) dæmper TAM-stimuleret spredning, migration og invasion af prostatakræft via NF-KB-forordningen

Abstrakt

Tumor udvikling og progression er påvirket af makrofager over det omkringliggende mikromiljø. For at undersøge de påvirkninger af en inflammatorisk tumormikromiljøet på væksten og metastaser af prostatacancer, den foreliggende undersøgelse anvendes en co-kultur model af prostatacancer (PSA) celler med tumor-associeret makrofag (TAM) -konditioneret medium (MCM). MCM fremmes PCa celle (LNCaP, DU145 og PC-3) vækst, og en xenograftmodel i nøgne mus konsekvent vist, at MCM kan fremme tumorvækst. MCM stimuleret også migration og invasion

in vitro

. Somatostatin derivat (smsDX) signifikant svækket TAM-stimuleret proliferation, migration og invasion af prostatacancer. Immunhistokemi afslørede, at NF-KB var overudtrykt i PCa og BPH med kronisk inflammatorisk vævsprøver og var positivt korreleret med makrofag infiltration. Yderligere undersøgelse af underliggende mekanisme afslørede, at NF-KB spiller en vigtig rolle i makrofaginfiltration. SmsDX hæmmede parakrin loop mellem TAM og PCA celler og kan udgøre en potentiel terapeutisk middel til PCa

Henvisning:. Guo Z, Xing Z, Cheng X, Fang Z, Jiang C, Su J, et al. (2015) Somatostatin derivat (smsDX) dæmper TAM-stimuleret spredning, migration og invasion af prostatakræft via NF-KB forordning. PLoS ONE 10 (5): e0124292. doi: 10,1371 /journal.pone.0124292

Academic Redaktør: Fabrizio Mattei, Istituto Superiore di Sanità, ITALIEN

Modtaget: 30 august, 2014 Accepteret: 12 Marts 2015; Udgivet: May 26, 2015

Copyright: © 2015 Guo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 30.772.294). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er den mest almindelige kræftform påvirker mænd og repræsenterer den næststørste årsag til kræft dødelighed i den vestlige verden [1]. Størstedelen af ​​prostatacancer skrider fra prostata intraepitelialneoplasi gennem lokalt invasiv adenokarcinom til kastrationsresistent prostatacancer (CRPC) [2], hvilket fører til den høje dødelighed og lidt behandling er tilstrækkelig. På trods af en masse forskning, den iboende mekanisme om CRPC er stadig uklart. For nylig, Zhu et al fandt, at cytokiner, herunder IL-1β produceres af makrofager bidraget til udviklingen af ​​CRPC [3].

Makrofager er normalt den mest rigelige immun stede i tumoren mikromiljø [4-6 ]. For nylig har to forskellige tilstande af polariserede makrofager blevet identificeret: den “klassisk” aktiveret (M1) og »alternativt« aktiverede (M2) makrofager. Og det er nu generelt accepteret, at TAM har en M2 fænotype og kunne producere en række cytokiner /kemokiner i den lokale tumor mikromiljø, der kan være forbundet med fremme af tumorvækst, angiogenese, og metastase i prostatacancer [7-10]. Men den detaljerede mekanisme fortsat ukendt.

Nuclear faktor-KB (NF-KB) er et medlem af en familie af ubikvitært udtrykte transkriptionsfaktorer, der deltager i inflammation, immunitet og onkogenese [11,12]. Det er almindeligt til stede i de fleste (hvis ikke alle) celler, herunder makrofager. Og dens afvigende aktivering er også blevet observeret i de fleste tumorer. For nylig har flere undersøgelser vist, at cytokiner (fx IL-1 og TNF) produceret af TAM kunne fremme aktiveringen af ​​NF-KB [13,14], derefter fremme tumorcelleproliferation, tumorigenese, migration og invasion [15,16]. Desuden kunne aktivering af NF-KB i makrofager forværre insulin ufølsomhed og påvirke glucosemetabolisme og involverer i metaboliske lidelser, herunder fedme, insulinresistens, type 2-diabetes og aterosklerose [17-19]. Det menes, at NF-kB fremmer cellevækst og onkogenese, i det mindste delvist, ved omlægning metaboliske kredsløbssystemer.

Somatostatin (SMS) er en sur polypeptid, som er vidt udbredt i centralnervesystemet, forskellige perifere væv og organer. Det har en bred vifte af biologiske aktiviteter i endokrine, betændelse og tumor. Sms derivat (smsDX) er baseret på naturlige sms14, og kunne binde sig til alle fem somatostatinreceptorundertyper (SSTR) [20]. Vores tidligere forskning har fundet smsDX kunne fremme apoptose, undertrykke proliferation, migration og invasion af prostata kræftceller [21]. Og adskillige undersøgelser viste somatostatinreceptor var til stede i makrofager, sms og dets analoge kan modulere funktionen af ​​makrofager [22-24]. Men mekanismen forbliver uklar. Somatostatin og dens analoge er blevet rapporteret i flere undersøgelser for at undertrykke aktiviteten af ​​NF-KB [25,26]. Imidlertid, om smsDX kan regulere NF-KB i prostatacancer fortsat ukendt.

Den foreliggende undersøgelse vurderede korrelation mellem NF-KB-ekspression og TAM infiltration i prostatacancer (PSA), benign prostatahyperplasi (BPH) og BPH med kronisk inflammation prøver via immunhistokemi. For at simulere tumor mikromiljø, en co-kultur model af PCA-celler (LNCaP, DU145 og PC-3) med TAM-medium (MCM) blev etableret

in vitro

. MCM fremmet proliferation, migration og invasion af PCA-celler, og denne simulering kunne inhiberes af smsDX. Yderligere undersøgelser viste, at NF-KB spillet en afgørende rolle i denne proces, og kan være involveret i en autokrin /parakrin loop mellem TAM’er og PCA celler. Vores resultater tyder på, at en inflammatorisk mikromiljø fremmer PCa progression, og at smsDX kan repræsentere en ekstra lægemiddel for prostatakræft grund af dens potentiale antiinflammatorisk rolle.

Resultater Salg

P65-ekspression er positivt korreleret med makrofag rekruttering i humane prostata væv

Immunoreaktivt farvning til P65 underenheden af ​​NF-KB blev vurderet i prøven af ​​24 PCa, 12 BPH med kronisk inflammation og 33 BPH prøver. Når omfanget af farvning i alle vævsprøverne blev kvantificeret på 0-3 + skala, observerede vi en gradueret stigning blandt BPH væv, BPH med kronisk inflammation prøver og PSA. Ingen af ​​BPH væv farvet som 3+, og 87,8% udviste 0+ eller 1+ farvning. Mængden af ​​farvning i BPH med kronisk inflammation prøver var mellemliggende, med 75% af prøver udviser 1+ eller 2+ farvning og 25% udviser 3+. I modsætning hertil alle cancer prøver var 2+ til 3+ (37,5 og 62,5%, henholdsvis) som vist i tabel 1. Endvidere blev svag P65 farvning observeret i cytoplasmaet i BPH væv blev P65-farvning observeret i både cytoplasmaet og kernen i tumor og inflammatoriske celler.

for yderligere at vurdere forholdet mellem P65 og makrofag infiltration i humane prostata væv, ufarvede sektioner blev immunolabeled med CD68. Som vist i figur 1, blev CD68-positive celler og P65 koordineret udtrykt ved moderate til høje niveauer i BPH med kronisk inflammation og prostatakræft læsioner. I modsætning hertil var minimal CD68 farvning observeret for BPH. Desuden ser de fleste af de CD68-positive celler udviste morfologiske træk ved makrofager. Derfor blev P65-ekspression positivt korreleret med makrofag densitet.

(A) Stærk farvning af NF-KB i cytoplasmaet og kernen af ​​PSA. (B) Moderat infiltration af makrofager i PSA. (C) Moderat farvning af NF-KB i cytoplasmaet og kernen af ​​prostatitis. (D) Høj infiltration af makrofager i kronisk prostatitis. (E) svag farvning af NF-KB i cytoplasmaet i BPH. (F) Mild infiltration af makrofager i BPH. Alle billeder er repræsentative billeder.

SmsDX hæmmede MCM-forfremmet proliferation og kolonidannelse af prostatacancerceller

For at studere virkningerne af MCM og smsDX om spredning af PCA celler, LNCaP, DU145 og PC-3-celler blev separat udsat for MCM og smsDX i 24, 48 og 72 timer hos en CCK-8 assay. Følgelig MCM fremmes signifikant spredning af LNCaP, DU145 og PC-3-celler i en tidsafhængig måde, hvorimod smsDX kunne svække virkningerne af MCM på celleproliferation (figur 2). Levedygtighed LNCaP, DU145 og PC-3-celler steg til 51,7%, 44,3% og 57,6%, henholdsvis efter udsættelse for MCM i 72 timer, dog levedygtighed faldt til 44,8%, 44,1% og 41,6%, henholdsvis på smsDX behandling.

virkningen af ​​MCM og /eller smsDX på cellelevedygtigheden blev målt via CCK-8 assay. (A) LNCaP-celler, (B) DU145-celler og (C) PC-3-celler blev co-dyrket med MCM og /eller behandles med smsDX i 24, 48 og 96 timer. Co-kultur med MCM fremmes signifikant proliferationen af ​​PCA-celler i en tidsafhængig måde, hvorimod smsdx væsentlige kunne dæmpe denne påvirkning. (D) Effekten af ​​MCM og smsDX på kolonidannelse. (E) Antallet af kolonier, definerede asclusters på mindst 50 celler, blev talt under mikroskop. Resultaterne repræsenterer middelværdier ± SD af tre uafhængige forsøg. Data er præsenteret som det middel ± SD, * p 0,05, ** p. 0,01

Vi yderligere undersøgt virkningerne af MCM og smsDX på koloni dannelsen af ​​PCA celler. MCM dramatisk lettet koloni dannelsen af ​​LNCaP, DU145 og PC-3 celler. Imidlertid blev kolonien nummer faldt betydeligt efter behandling med smsDX som vist i figur 2 (* P 0,05, ** P 0,01).

Virkninger af MCM og smsDX på celle migration og invasion

i vitro

Skrab analyser blev udført for at vurdere virkningerne af MCM og smsDX for migration af PCA celler. Migrationen kapaciteter LNCaP, DU145 og PC-3 blev markant forøget efter co-kultur med MCM i 24 timer (Fig 3). For yderligere at teste indflydelsen af ​​MCM og smsDX på celle migration og invasion, blev transwell assay udført. Vores resultater viste, at antallet af migrerende og invasive celler passerer gennem filteret væsentligt større, når makrofager blev dyrket i det nedre kammer (fig 3) (# P 0,05, ## P 0,01). Imidlertid kunne smsDX (10 nM) dramatisk inhiberer migration og invasion af PCA-celler.

(A, C, E) co-kultur med MCM forøgede cellevandring af LNCaP, DU145 og PC-3-celler. SmsDX undertrykt virkningen af ​​MCM. (B, D, F) Ændringen migration er præsenteret som den procentdel af den oprindelige afstand mellem de to kanter. (G, I, L) Transwell migration og invasion assay af LNCaP, DU145 og PC-3 celler behandlet med MCM og /eller smsDX. (H, J, M) The LNCaP, DU145 og PC-3 celler, der med succes migreret og invaderet blev talt. Data er præsenteret som den middel ± SD af tre uafhængige forsøg. Data er præsenteret som gennemsnit ± SD, * p 0,05, ** p 0,01, # p 0,05, ## p. 0,01

SmsDX inhiberer MCM-afhængig tumorvækst i en xenograft model

Efter at demonstrere effekten af ​​smsDX hæmme PCa celle levedygtighed og invasion

in vitro

, vi yderligere undersøgt dets potentielle antitumor effekt i mus. PC-3-celler (5 x 10

6) injiceret subkutant i hver flanke af nøgne mus. Behandling med MCM forøgede signifikant gennemsnitlige tumorvolumen. Imidlertid blev tumorvækst inhiberet efter behandling med smsDX ved 1 mg /kg /d (figur 4) (* P 0,05, ** P 0,01). Endvidere blev ingen signifikant toksicitet observeret i mus behandlet med MCM og smsDX (1 mg /kg /d) som vurderet ved hjælp af vægten af ​​hvert enkelt dyr i de 3 grupper (figur 4). For at undersøge ekspressionen af ​​NF-KB samt makrofaginfiltration

in vivo

, immunohistokemi blev udført på paraffinsnit af PC-3-tumorxenotransplantater fra nøgne mus. NF-KB og CD68 blev højt udtrykt i mus behandlet med MCM, og var positivt associeret med tumorvolumen (figur 4).

Billeder af den nøgne mus (A) og de udskårne tumorer (C) blev taget fra forskellige grupper. (B) Kropsvægt kurve af nøgne mus der bærer PC-3 tumorer i forskellige grupper. (D) Grafer repræsenterer de gennemsnitlige tumorvolumener af PC-3 xenotransplantater behandlet med MCM og /eller smsDX. (E) Sammenhængen mellem CD68 og NF-KB i PCA tumorxenoplantater. Data er præsenteret som gennemsnit ± SD, * p 0,05, ** p 0,01

SmsDX hæmmer nuklear translokation og aktivering af NF-KB induceret via makrofag-konditioneret medium i PCA celler

NF-KB kan repræsentere en kritisk mekanistisk forbindelse mellem betændelse og cancer, og dens afvigende aktivering kan fremme tumorcelleproliferation, tumorigenese, migration og invasion [15,16]. Vi først observeret ekspressionen af ​​phosphoryleret P65, som modulerer NF-KB transkription aktivitet [27,28]. Som vist i figur 5, co-kultur med MCM signifikant opreguleret phosphoryleret P65 i LNCaP-celler, som var stærkest udtrykt når disse celler blev inkuberet med MCM i 30 minutter. Efterfølgende undersøgte vi virkningen af ​​smsDX på phosphoryleringen af ​​P65. De opreguleret phosphoryleringsniveauerne af P65 sekundært til MCM behandling blev effektivt undertrykt via smsDX i tre PCA cellelinier (fig 5).

(A) Niveauerne af phosphoryleret NF-KB i LNCaP celler efter udsættelse for MCM for forskellig varighed. (B-D) De niveauer phosphory og total NF-KB blev analyseret via western blotting. Kvantificering af p-NF-KB /NF-KB-forholdet blev bestemt via densitometrianalyse.

For yderligere at vurdere virkningerne af MCM og smsDX på translokation af NF-KB, cytosol og nukleare proteiner blev ekstraheret henholdsvis. Western blot-analyse afslørede, at MCM reducerede overflod af P65 i cytoplasmaet i LNCaP-celler (figur 6). Desuden blev forøgede niveauer af P65 observeret i kernen (figur 6), hvilket viser, at NF-KB blev aktiveret. Men behandling med smsDX i 24 timer dramatisk inhiberede virkningen af ​​MCM på NF-KB-aktivering. Lignende resultater blev opnået i DU145 (Fig 6) og PC-3-cellelinjer (Fig 6). Immunofluorescens resultater i figur 7 bekræftede yderligere, at i lighed med western blot-assay, en væsentlig forøgelse i den nukleare akkumulering af P65 blev observeret efter samdyrkning med MCM i LNCaP-celler, og at smsDX dramatisk inhiberede P65 translokation. Lignende resultater blev observeret i DU145 og PC-3 cellelinier (figur 7).

(A, C, E) Udtrykket af p65 i cytoplasmaet blev reduceret efter co-kultur med MCM, smsDX svækket dette effekt i LNCaP, DU145 og PC-3 celler. A-tubulin blev valgt som det cytosoliske protein loading kontrol. (B, D, F) co-kultur med MCM øgede ekspression af nuklear p65, og behandling med smsDX svækket virkningen af ​​MCM. Histoner blev valgt som et kerneprotein loading kontrol. Kvantificeringen af ​​C-p65 /a-tubulin og N-p65 /histon-forhold blev udført som densitometrianalyse.

(A) co-kultur med MCM fremmes signifikant den nukleare akkumulering af p65 i LNCaP celler. Behandling med smsDX inhiberede p65 nuklear translokation. (B og C) Udtrykket og translokation af p65 efter udsættelse for MCM og behandling med smsDX i DU145 og PC-3 celler, henholdsvis blev analyseret via immunofluorescens.

Diskussion

tilstedeværelsen af ​​leukocytter i tumorer blev først observeret i det 19. århundrede af Rudolf Virchow, denne observation forudsat den første indikation af en sammenhæng mellem betændelse og kræft [29]. Epidemiologiske undersøgelser har for nylig vist, at makrofager udgør en vigtig del af værten leukocyt infiltrat i de fleste maligne tumorer [30]. den kliniske betydning af TAM infiltrerer Men i prostatakræft stadig kontroversielt. Kiran el al rapporterede, at det gennemsnitlige antal TAMer var højere i prostatakræft end i godartet væv [31], mens Norio et al rapporterede det modsatte resultat [32]. I den foreliggende undersøgelse, observerede vi øget makrofaginfiltration i prostatakræft og BPH med kronisk inflammation sammenlignet med godartet væv. Øget TAM infiltration er også blevet rapporteret at være associeret med dårlig PCa progression [33]. Derfor kan TAM’er udgør en potentiel indikator for prostatakræft. Nogle tidligere undersøgelser har også vist, at M2-polariserede THP-1 makrofager kan fremme tumorvækst, invasion og metastase [34,35]. I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at TAM-lignende M2-type makrofager øget migration og invasion af prostatacancerceller. Derudover MCM fremmet tumorigeniciteten af ​​PC-3-celler i en xenograft model i nøgne mus. Desuden administrationen af ​​smsDX svækket den vandrende og invasive potentiale prostata kræftceller, der blev stimuleret af M2-typen makrofager.

Vi observerede også, at NF-KB udtryk i PCa og BPH med kronisk inflammation prøver var signifikant højere end den, BPH, var dette udtryk positivt korreleret med makrofaginfiltration. Derfor fokuserede vi på rollen af ​​NF-KB i denne proces. Nuklear faktor-KB (NF-KB) er en inducerbar dimert transkriptionsfaktor, der hører til Rel /NF-KB-familien. Over-ekspression af gener kodende for RelA /NF-KB faktorer er blevet observeret i mange tumorer [36-39], og dysregulering af NF-KB menes at fremme celleproliferation, motilitet, invasion og metastase i de fleste tumorer, herunder prostata cancer [40,41]. NF-KB anses for at være en væsentlig molekylær producent af inflammation og kan fremme immunitet ved at styre ekspressionen af ​​gener involveret i inflammation [42]. Den foreliggende undersøgelse viste, at makrofager aktiveret NF-KB i PSA. Dette førte til udviklingen af ​​prostatacancerceller efter co-kultur med MCM. I tumormikromiljøet, kunne cytokiner fra TAM’er aktivere NF-KB i tumorceller og dermed fremme tumorigenese. Tumorceller til gengæld udtrykker CSF-1 og kan yderligere stimulere og rekruttere makrofager [43]. Der er derfor en parakrin løkke inden TAM-forstærket tumorprogression. Og NF-KB spiller en vigtig rolle i den sag af denne løkke.

Somatostatin og dets analoger er neuroendokrine hormoner og udgør vigtige mediatorer mellem nervøse og immunforsvar. Vores og andre grupper har fundet, at disse hormoner kan hæmme proliferation og invasion af flere tumortyper [21,44]. For nylig er betydelige eksperimentelle data viste, at SMS-analoger udviser anti-inflammatorisk aktivitet på grund af deres inhiberende virkning på sekretionen af ​​TNF-α, IL-8 og IL-1β [45,46]. Men til vor bedste viden, der har været nogen undersøgelser af virkningen af ​​sms analoger på ekspression af NF-KB og biologisk adfærd PCA celler i en inflammatorisk mikromiljø. I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at smsDX væsentligt svækket makrofagen-medierede stimulering af PCa celleproliferation og invasion ved inhibering af ekspressionen og aktiviteten af ​​NF-KB

in vitro

in vivo

. Somatostatinreceptorundertyper 1 og 2 er blevet påvist i humane makrofager [22], og immunoreaktive somatostatin er blevet påvist i cytoplasmaet i makrofager. Derfor er vi spekulere at smsDX kunne binde med SSTR1 eller to på overfladen af ​​makrofager og bryde parakrin loop mellem tumor og den inflammatoriske mikromiljø og derved lindre makrofag-stimulerede progression af PSA.

For nylig, stofskiftesygdomme herunder fedme, type 2 diabetes og aterosklerose er blevet histologisk set som kronisk low-grade inflammation med signifikant makrofaginfiltration [47,48]. Makrofager er blevet observeret at være i tæt nærhed med metaboliske celler og blev observeret at have en omfattende transkriptionel signatur, der reguleres metabolismen af ​​adipocytessuch som pyruvatcarboxylase, PPAR-γ, apolipoprotein C1 osv [18]. I overvægtige personer, kan energioverskud eller produkter fra makrofager aktivere NF-KB, yderligere udløser makrofag rekruttering, aktivering og indledningen og vedligeholdelse af en inflammatorisk reaktion, som i sidste ende resulterer i insulinresistens [18]. Ud over at forværre perifer insulin ufølsomhed, kan NF-KB også påvirke glucosemetabolisme og mitokondriel respiration, hvilket er vigtigt for cellevækst og onkogenese [49]. Vores tidligere undersøgelse rapporterede, at smsDX kan påvirke cellulær metabolisme og den mitokondrielle funktion af PSA-celler. Derfor er vi spekulere, at smsDX kan svække effekten af ​​MCM på PCA celler via handling på cellulær metabolisme foruden anti-inflammation.

Samlet set vores undersøgelse viser, at TAM kan fremme udviklingen og progressionen af ​​PCa, og at smsDX dæmper denne effekt ved at nedregulere NF-KB. Disse resultater indikerer, at smsDX kan være et lovende terapeutisk lægemiddel til patienter med prostatacancer.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Alle humane prøver blev opnået under terapeutisk kirurgi. Denne undersøgelse blev udført ved anvendelse af prøverne i løbet hylderne efter patologisk diagnose. Vi ringede alle patienter og opnået verbalt informeret samtykke. Dette er specielt godkendt af Qilu Hospital Komité Shan Dong University for Menneskelige Eksperimenter. Alle dyr pleje og forsøgsprotokoller overholdt Animal Management Regler for Sundhedsministeriet i Folkerepublikken Kina (dokument nr 55, 2001). Alle dyr blev fastholdt på Key Laboratory af kardiovaskulær Remodeling og Funktion Forskning ved Qilu Hospital i Shandong University. Denne undersøgelse blev godkendt af Qilu Hospital Komité Shan Dong University for Menneskelige Eksperimenter og af Animal Care udvalg Shandong University.

Patienter og prøver

I alt 24 patienter diagnosticeret med PCa og 45 patienter diagnosticeret med BPH behandlet på Institut for Urology Surgery blev Qilu Hospital i Shandong University mellem oktober 2010 og juli 2012 indskrevet i denne undersøgelse. Indvirkning herpå, seksten i PSA patienterne gennemgik transrektal prostata biopsi, og 8 patienter gennemgik transuretral resektion af prostata. Tolv af 45 benign prostatahyperplasi (BPH) patienter blev diagnosticeret med histologisk kronisk prostata inflammation. De kliniske parametre og patologiske klassificeringer præsenteres og opsummeret i tabel 1. Ingen af ​​patienterne havde fået præoperativ adjuverende behandling. Diagnosen hvert tilfælde blev bekræftet af to patologer.

PCA cellelinjer og cellekultur

Menneskelig PCA cellelinjer (LNCaP, DU145 og PC-3) og THP-1-celler blev købt fra Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences. Alle celler blev dyrket i RPMI-1640 medium (Hyclone, Logan, UT) indeholdende 10% føtalt kalveserum ved 37 ° C i en CO 5%

2 incubator. Becasue TAM repræsenterer en klar M2-polariseret makrofag population [50], blev THP-1-monocytter differentieret til makrofager i RPMI-medium indeholdende 5 ng /ml phorbol 12-myristat 13-acetat (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) i 48 timer efter i forvejen etablerede protokoller [51]. Derefter Kultursupernatanter blev filtersteriliseret og opbevaret ved -20 ° C indtil den skal bruges.

Immunohistokemisk analyse

Immunhistokemi blev udført som tidligere beskrevet [52]. Kort paraffinindstøbte væv blev afparaffineres og rehydreret. Efter antigen-genvinding, blev alle prøver udsat for primært antistof (CD68 1:50 P65 1: 100) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) natten over ved 4 ° C, og derefter inkuberet med biotin-konjugeret sekundære antistoffer i 30 minutter ved 37 ° C, efterfulgt af avidin-biotinyleret peroxidase-kompleks i 20 min ved 37 ° C. Farvning blev henrettet med 3,3N-diaminobenzidin tertrahydrochloride og hæmatin. Proteinet ekspressionsniveau blev vurderet ifølge den procent af positivt farvede tumorceller og farvningsintensiteten ved to patologer som tidligere [53] beskrevne. Kort fortalt blev procentdelen af ​​positiv farvning bedømt som 0 (0-9%, negativ), 1 (10% -25%, sporadisk), 2 (26% -50%, fokal) eller 3 (51% -100%, diffuse), og intensiteten som 0 (ingen farvning), 1 (svag farvning, synlige ved stor forstørrelse), 2 (moderat farvning, synlige ved lav forstørrelse) og 3 (mørk farvning, påfaldende positiv ved lav forstørrelse). Den samlede immunfarvning score blev beregnet med værdien af ​​procent positivitet score × farvningsintensitet score, der varierede fra 0 til 9. proteinekspression niveau blev defineret som følgende: “0+” (negativ, score 0), “1+” ( svagt positiv, score 1-3), “2+” (positiv, score 4-6), og “3+” (stærkt positiv, score7-9).

Cell levedygtighed assay

Cellelevedygtighed blev bestemt via CCK8 assay. Kort fortalt, LNCaP (6 × 10

3 celler /brønd), DU145 (4 × 10

3 celler /brønd) og PC-3 (4 × 10

3 celler /brønd) celler i 200 pi medium blev podet i plader med 96 brønde. Efter 12 timer for vedhæftning, blev mediet erstattet af konditioneret medium fra makrofager med /uden smsDX (10 nM). Efter 24-72 timer blev de dyrkede celler behandlet med 20 pi Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Japan) og inkuberet ved 37 ° C i yderligere 4 timer i henhold til instruktionerne i fremstillingen. Absorbansen blev bestemt ved 450 nm.

Klon dannelse assay

LNCaP, DU145 og PC-3 celler ved en densitet på 1 × 10

3 celler /brønd blev podet i 6- brønds plader. Efter inkubering natten over konditioneret medium med /uden smsDX (10 nM) blev tilsat til mediet, og cellerne blev inkuberet ved 5% CO

2 og 37 ° C i to til tre uger. Når synlige kloner dannet på pladerne, blev cellerne vasket klonerne med PBS og fikseret med forafkølet methanol og farvet med 0,1% krystalviolet i 20 minutter. De kolonier indeholdende mere end 50 celler blev talt under et mikroskop. Klonen dannede mængde = (klonen nummer /antallet af celleinokulering) × 100%.

In vitro

ridse assay Salg

PCA-celler blev podet i 24-brønds plader. Efter inkubation i 24 timer blev hver brønd manuelt ridset med en 200 pi pipettespids, vasket med PBS tre gange og inkuberet med konditioneret medium med /uden 10 nM smsDX. Billeder blev taget igen efter den 24. time. Afstanden mellem to celler kanter blev analyseret under anvendelse ImageJ software.

Transwell invasion assay

Transwell invasion assay blev udført som tidligere [54] beskrevne. Kort fortalt, i alt 5 × 10

4 celler suspenderet i 100 pi serumfrit medium blev tilsat til de øvre kamre i trans-brønd-system (24 brønde, 8 mm porestørrelse; Corning Costar, Lowell, MA, USA) coatet med 2 mg /ml Matrigel (BD Biosciences). TAM-konditioneret medium med /uden 10 nM smsDX blev derefter tilsat til det nederste kammer. Efter 24 timer blev de ikke-besatte celler i det øverste kammer forsigtigt fjernes med en vatpind henviser cellerne knyttet til den nedre overflade blev fikseret med forafkølet methanol og farvet med 1% eosin. Mindst ti områder af hvert kammer blev tilfældigt udvalgt, og cellerne blev talt under mikroskop.

I migration assay blev cellerne udsået i de øvre kamre uden overtrukket Matrigel. Resten af ​​assayet blev udført som Transwell invasion assay. Efter 24 timer blev cellerne på den nedre overflade også talt i mindst ti tilfældigt felter, så celletallet blev analyseret statistisk.

immunofluorescensbestemmelse

PCA-celler blev udpladet på fibronectin-coatede glas dækglas. Efter 24 timers inkubation blev cellerne skyllet med PBS, fikseret i forvejen afkølet methanol og permeabiliseret med 0,2% Triton X-100. De fikserede celler blev præinkuberet i 1,5% normalt gedeserum og yderligere inkuberet natten over med et primært antistof mod P65 (1: 100 fortynding) ved 4 ° C. Efter inkubation med fluorescein-konjugeret gede-anti-kanin IgG-antistof ved 37 ° C, dækglassene var monteret på objektglas med PermaFluor Vandig. Fluorescens blev observeret ved anvendelse af et Zeiss Axioplan Universal mikroskop.

Western blotting

Cellerne blev lyseret i RIPA-buffer indeholdende 1% proteaseinhibitorer. For at isolere cytoplasmatisk komponent fra nuklear én blev PCA celler behandlet med en nuklear protein udvinding kit (Beyotime Biotechnology, Wuhan, Kina) og centrifugeres ved 3400 rpm i 10 minutter ved 4 ° C. De cytoplasmiske og nukleare bestanddele blev derefter underkastet Western blotting. Lige store mængder proteiner fra hver prøve blev separeret via SDS-PAGE og overført til en PVDF-membran under anvendelse af en våd overførsel apparat (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Membranerne blev blokeret med 5% fedtfri mælk i 2 timer ved stuetemperatur og inkuberet med de primære antistoffer natten over ved 4 ° C. Membranerne blev derefter udsat for de peberrodsperoxidasemærket sekundære antistoffer (1: 2.000) i 1 time ved stuetemperatur, og reaktivitet blev påvist ved anvendelse af et forøget kemiluminescens påvisningssystem (Amersham, Pittsburg, PA). Proteinniveauer blev analyseret under anvendelse ImageJ software.

Tumor xenograft model

patogenfrie 4-5 uger gamle BALB /c nøgne mus (der vejer 19 ± 2 g, SPF kvalitet, certifikat SCXK2011 -0012) blev købt fra Institut for Laboratory Animal Science på Peking University (Beijing, Kina). I alt 5 × 10

6 af PC-3-celler blev opsamlet, blandet med Matrigel og injiceret subkutant i flanken af ​​nøgne mus. Musene blev tilfældigt inddelt i tre grupper (5 pr gruppe). Musene blev givet af MCM med eller uden smsDX i en dosis på 1 mg /kg /d via intraperitoneal injektion i 4 uger med ugentlig overvågning af tumorstørrelse og legemsvægt, mens kontrolmusene fik det samme volumen normalt saltvand. Alle musene blev aflivet ved anvendelse af natriumpentobarbital 8 uger efter inokulering af kræftceller og tumorerne blev opsamlet.

Statistisk analyse

Data meste præsenteret som middelværdi ± SD. SPSS softwarepakke (version 13,0; SPSS, Chicago, IL) blev anvendt til alle statistiske analyser. Signifikante forskelle mellem behandlingsgrupper og kontrolværdier blev analyseret under anvendelse af Students to-halet t-test eller envejs variansanalyse hvor det er hensigtsmæssigt. Forskelle blev betragtet som statistisk signifikant, når p 0,05. Hver variabel blev testet to gange, og eksperimentet blev gentaget tre gange.

Tak

American Journal Eksperter redigere dette manuskript.