PLoS ONE: Mutationsanalyse Profilering af kinaser i Human Tumorer i bugspytkirtlen Origin Identificerer Candidate Cancer Gener i Ductal og ampulla af Vater Carcinomer

Abstrakt

Baggrund

Proteinkinaser er vigtige regulatorer af cellulære processer (såsom spredning, apoptose og invasion), der ofte er liberaliseret i humane kræftformer. Følgelig har kinase gener været de første til systematisk analyseret i humane tumorer, der fører til den opdagelse, at mange onkogener svarer til muterede kinaser. I de fleste tilfælde genetiske ændringer oversætter i konstitutivt aktive kinase proteiner, som Domstolen af ​​terapeutisk målretning. Tumorer i bugspytkirtlen er aggressive neoplasmer for hvilke der ikke effektiv terapeutisk strategi er tilgængeligt i øjeblikket.

Metode /vigtigste resultater

Vi har udført en DNA-sekvens analyse af et udvalgt sæt af 35 kinase gener i en panel af 52 pancreatisk exokrin neoplasmer, herunder 36 pancreas ductus adenocarcinom, og 16 ampulla Vateri cancer. Blandt andre ændringer fandt vi somatiske mutationer i

ATM

,

EGFR, EPHA3, EPHB2

, og

KIT

, hvoraf ingen er tidligere beskrevet i kræft.

konklusioner /betydning

Selvom ændringerne identificeret kræver yderligere eksperimentel evaluering, lokalisering inden for definerede proteindomæner indikerer funktionel relevans for de fleste af dem. Nogle af de muterede gener, herunder tyrosinkinaser

EPHA3

EPHB2

, klart modtagelig for farmakologisk intervention og kunne repræsentere nye terapeutiske mål for disse uhelbredelige kræftformer.

Henvisning : Corbo V, Ritelli R, Barbi S, Funel N, Campani D, Bardelli A, et al. (2010) Mutationsanalyse Profilering af kinaser i Human Tumorer af pancreas Origin Identificerer Candidate Cancer Gener i Ductal og ampulla af Vater Carcinomer. PLoS ONE 5 (9): e12653. doi: 10,1371 /journal.pone.0012653

Redaktør: Hana Algül, Technische Universität München, Tyskland

Modtaget: May 20, 2010; Accepteret: August 12, 2010; Udgivet: 8 September, 2010

Copyright: © 2010 Corbo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Associazione Italiana Ricerca Cancro (AIRC, https://www.airc.it/), Fondazione CariParo (www.fondazionecariparo.it), Fondazione Monte dei Paschi di Siena (https://www.fondazionemps.it /); Italienske sundhedsministerium, Rom, Italien (https://www.salute.gov.it/); Europæiske Fællesskab FP VI Program Grant PL018771 (MolDiagPaca, https://www.moldiagpaca.eu/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Proteinkinaser er vigtige regulatorer af forskellige og komplekse cellulære processer, såsom cellecyklus, differentiering, apoptose og invasion [1] – [4]. Proteinet kinase komplement (defineret som “kinome”) udgør en betydelig del af det humane genom, og for nylig Manning

et al

. organiseret det til en dendogram indeholdende ni brede grupper af gener [5]. Ændringer i en kinase gen kan føre til en afvigende proteinaktivitet, som kan have en rolle i cancer initiering og progression [6], [7]. Disse ændringer, herunder punktmutationer og deletioner i konserverede domæner, resulterer ofte i konstitutivt aktiverede kinaser, som er potentielle terapeutiske mål for kræftbehandling. Faktisk er der flere småmolekylære inhibitorer er i brug eller evalueres i kliniske forsøg [8] – [10]. Mutationer i en kinase gen kan også resultere i dets inaktivering, som for gener involveret i opretholdelsen af ​​genomstabilitet [11], [12] eller kontrol celle-celle-kommunikation [13]. I de senere år har omfattende sekvensanalyse af tumor genomer og især af kinase genfamilie blevet udført i forskellige epiteliale tumorer fører til identifikation af forskellige somatiske mutationer [14] – [22]. Disse værker peger på en delmængde af kinase gener med kendt eller potentiel forbindelse med fast tumor udvikling, som de udviser en relativt høj frekvens af mutationer.

For at bestemme tilstedeværelsen af ​​mutationer potentielt relevante som terapeutiske mål, gennemførte vi en DNA-sekvensanalyse af et udvalgt sæt af kinase gener i et panel af to forskellige pancreas neoplasmer, herunder pancreas ductal adenocarcinom (PDAC), og ampulla Vateri cancer (AVC). For disse tumortyper ingen effektive terapeutiske midler er i øjeblikket tilgængelige [23], [24]. F.eks PDAC er meget aggressiv og modstandsdygtig over for konventionelle og målrettede terapeutiske midler, hvilket resulterer en sløj 5-års overlevelsesrate på 3% til 5% [24]. Her præsenterer vi mutations profil 35 gener, der tilhører de kinase gen familier i PDAC og AVC. Konkret fandt vi ikke-synonyme mutationer i følgende gener:

ATM, BRAF, EGFR, EPHA3, EPHB2, ERBB2, FGFR2, KIT

, og

PIK3CA

. Blandt disse ændringer, der var både velkarakteriserede mutationer og mutationer påvirker aminosyre ikke tidligere fundet at være muteret i humane kræftformer.

Materialer og metoder

Etik Statement

Al forskning omfatter menneskelige deltagere blev godkendt af universitetet og Hospital Elsparefondens Institutional Board. Informeret samtykke blev opnået skriftligt fra levende patienter eller pårørende til alle væv, der anvendes i denne undersøgelse.

Prøver

Panelet af 52 pancreas cancer prøver blev opnået fra tumoren bank vedligeholdes af Department of Patologi, afdeling for Anatomisk Patologi, University of Verona (Verona, Italien), med undtagelse af seks af pancreas adenocarcinom prøver, som Dr. Daniela Campani (universitetet i Pisa). Prøverne blev indsamlet i henhold til de etiske krav og regler i de fornyede bestyrelserne i både universitetet i Verona (Verona, Italien) og universitetet i Pisa (Pisa, Italien). Dette panel omfattede 36 PDAC og 16 AVC (se supplerende tabel S1 til detaljeret klinisk information prøver kræft). De 23 PDAC tumorer blev passeret in vitro som cellelinier eller i nøgne mus som xenotransplantater at fjerne kontaminerende ikke neoplastiske celler [25]. Cellelinjer blev høstet efter højst seks

in vitro

passager for nukleinsyre forberedelse. Tretten PDAC prøver blev beskrevet tidligere humane pancreas tumor cellelinier [26] (se supplerende tabel S2 for detaljer). Vævsprøver vurderes at indeholde mere end 80% af tumorcellerne blev anvendt. Genomisk DNA blev isoleret ved hjælp DNeasy blod og væv (Qiagen, Milano, Italien). Matchet normal DNA blev anvendt til at bestemme, om de identificerede mutationer var somatisk eller kimcellelinje. Nr matchede normale prøve var tilgængelig for de 13 etablerede cellelinier inkluderet i undersøgelsen. Genomisk DNA blev yderligere isoleret efter kryostat berigelse fra frosne væv af primær PDAC at bekræfte mutationerne sidst identificeret i de tilsvarende xenotransplanterede tumorer.

Gener, PCR og sekventering

Femogtredive gener tilhører proteinkinase-genfamilien blev valgt på grundlag af deres høje frekvens af mutationer i andre end pancreas humane cancere som vurderet i tidligere værker [14] – [22]. Disse gener var:

AKT2, ATM, ATR, AURKC, BRAF, BRD2, DDR1, DYRK2, EGFR, EPHA3, EPHA5, EPHB6, EPHB2, ERBB2, ErbB4, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FLT1, FLT3, FRAP1 , KDR, KIT, MAP2K4, MET, NTRK2, NTRK3, PAK4, PDGFRA, PDPK1, PI3KCA, RPS6KC1, STK11, TGFBR2

. Primere til amplifikation og sekventering af DNA blev designet ved hjælp af Primer3 programmet (https://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi) og henviser til National Center for Biotechnology Information (NCBI, http: //www.ncbi.nlm.nih.gov) henvisning sekvens filer med Gene og Transcript ID (RefSeq), forudsat i supplerende tabel S3. PCR-primere blev udformet til at opformere de valgte exoner og de flankerende intronsekvenser, herunder splejsning donor og acceptor-regioner. PCR-produkter blev ~400 bp i længde, med flere overlappende amplimerer til større exoner. PCR betingelser, rensning og direkte sekventering er tidligere blevet beskrevet [14].

Dataanalyse

Sekvensforskelle til NCBI henvisningen sekvens blev identificeret via manuel inspektion af tilpasset elektroferogrammer bistået af Mutation Surveyor softwarepakke (SoftGenetics, State College, PA). Den genetiske ændring identificeret blev krydshenvisning til variant oplysninger fra NCBI SNP databasen Ensemble Genome Browser (https://www.ensembl.org), The Swiss-Prot (https://ca.expasy.org) og GeneBank databaser https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank), den COSMIC database (https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic), og litteratur. Ud over ikke-synonyme genetiske ændringer, vi har registreret talrige tavse sekvensvariationer, der blev analyseret under anvendelse af ASSP (https://www.es.embnet.org/~mwang/assp.html) sekvensanalyse værktøj til at udelukke, at kryptiske splejsninger sites kan aktiveres. Disse tavse mutationer er ikke præsenteret og analyseret yderligere her. Alle nye sekvens data er blevet deponeret i GenBank.

Resultater og Diskussion

Vi udførte en mutations profilering af 35 kinase gener i et panel af 36 PDAC og 16 AVC, herunder primære tumorer, xenografter og cellelinier. For hvert gen blev alle exoner, hvor somatisk mutation var blevet tidligere identificerede analyseret. Exon specifikke primere blev udformet til amplifikation og sekvensen den kodende region, og mindst 15 intron baser ved både 5′- og 3′-enderne, herunder splejsning og -acceptorsteder. I alt 8.321 PCR-produkter, der spænder over 3 MB tumor genomisk DNA, blev dannet og udsat for direkte sekventering. Af de 147 exoner ekstraherede, 92% indrettede god sekvens spor (dvs. mere end 90% af baser i målområdet havde en Phred score (defineret som -10 [log

10 (rå per-basen fejl)]) af mindst 20 i mindst tre fjerdedele af de analyserede prøver), og derfor blev analyseret søger efter specifikke mutationer. Ændringer tidligere er beskrevet som enkelte nukleotid polymorfier (SNP), blev udelukket fra yderligere analyse. For at sikre, at de til sidst observerede mutationer blev ikke PCR eller sekventering artefakter, ampliconer blev uafhængigt re-amplificeret og re-sekventeret i de tilsvarende tumorer. Alle verificerede ændringer blev resequenced parallelt med den matchende normalt DNA, til at skelne mellem somatiske mutationer og SNP’er ikke tidligere beskrevet.

Denne fremgangsmåde førte til identifikation af i alt 10 forskellige ikke-synonyme mutationer (tabel 1) . Blandt disse mutationer, 9 var missense; den ene var en lille indsættelse, mens ingen mutationer blev fundet i splejsning sites eller UTR regioner (tabel 1).

Med hensyn til PDAC vi analyserede i alt 36 prøver, hvoraf de 13 var etableret celle linjer. I alt 7 forskellige missense mutationer påvirker følgende gener blev fundet:

BRAF, EGFR, EPHA3, EPHB2, FGFR2, KIT, PIK3CA

(tabel 1). Af disse mutationer

FGFR2

P582L

og

PIK3CA

H1047R blev identificeret i adenocarcinom cellelinier (PT45 og GER henholdsvis) for hvilke der ikke matchede normal prøve var tilgængelig. Derfor kunne den somatiske status af disse mutationer ikke konstateres.

PIK3CA

H1047R mutation har tidligere været forbundet med kræft og grundigt karakteriseret [27] – [30]. Selvom mutationer af

FGFR2

tidligere er blevet fundet i humane kræftformer [16], [31], [32], er blevet rapporteret nogen mutationer af dette gen at være forbundet med pancreascancer til dato. Vores karakterisering af etablerede pankreatiske tumorcellelinier med hensyn til genetiske ændringer i denne cancerpotentiale destinationsserie endelig indeholder egnede cellesystemer til datafortolkning, målvalidering samt prækliniske modeller for udviklingen af ​​hidtil ukendte målrettet cancerlægemidler.

BRAF

G464V har tidligere været forbundet med kræft og karakteriseret [33]. Fundet af en

BRAF

mutation i PDAC er en eller anden måde forventes da dens tilhørende sti ændres i næsten alle bugspytkirtlen adenocarcinomer [34], selv om individuelle

BRAF

mutationer er ret sjældne i denne type kræft og generelt forekomme i tumorer, der mangler

KRAS

mutationer [35], [36]. Interessant mutationen vi fandt var i homozygot tilstand (figur 1 B), som ikke forventes for et protein, der fungerer i en dominerende måde. De samme missense somatiske mutationer af

EPHB2

(D283H) blev fundet i to forskellige PDAC prøver (figur 1A), hvoraf den ene også vises en missense mutation i

EPHA3

(K207N). De mutationer identificeret i

BRAF

EPHB2

blev re-analyseret i de tilsvarende primære tumorer (Supplerende figur S1) for yderligere at bekræfte tilstedeværelsen af ​​mutationer og dermed udelukke, at de genetiske ændringer kunne være konsekvensen af ​​implantatet i nøgne mus. Især til sekvensanalyse af den primære cancer, der svarer xenograft 377 (tabel 1) bekræftede også homozygotiske tilstand af mutationen identificeret i

BRAF

gen. Eph-receptorer repræsenterer den største underfamilien af ​​transmembrane tyrosinkinasereceptorer og er den primære involveret i processen med celleadhæsion og migrering under udvikling, homeostase og sygdom [13], [37]. I denne undersøgelse, rapporterer vi det mutations profil af fire medlemmer af denne familie (

EPHA3

,

EPHA7

,

EPHB2

, og

EPHB6

), som er blevet fundet hyppigt muteret eller tavshed i tidligere undersøgelse om menneskelige kræftformer [13]. For eksempel har mutationer af EPHB2 der formentlig føre til tab af aktivitet blevet fundet i colorektal og prostatacancer [38], [39], mens mutationer i

EPHA3

er blevet beskrevet i melanom, lunge- og tarmkræft [14] – [16], [19]. Hidtil ingen mutationer af

EPHB2

er blevet rapporteret at være forbundet med kræft i bugspytkirtlen. Ellers en meget nyere arbejde, der dybt analyserede protein-kodende gener i pancreas adenocarcinomer rapporterede forekomsten af ​​et intronisk punkt mutation af

EPHA3

[34]. Mutationerne af

EPHB2

EPHA3

vi fundet i denne undersøgelse lokaliseret i den evolutionære konserverede Cys-rige ekstracellulære domæne, som menes at være involveret i bestemmelse af bindingsaffinitet til deres ligander samt den tetrameriseringsdomæne af aktiverede receptorer [40]. Faktisk kan disse aminosyre ændringer (D283H og K207N) påvirker bindingen af ​​receptorerne til deres ligander og dermed muligvis forstyrre den normale signaleringskaskade. Endvidere stigende tegn tyder på en rolle ephrin receptor /ephrin system invasivitet i kræft samt dens potentielle relevans terapeutisk målretning [41]. Mutationer af EGFR (L815F) påvirker kinasedomænet blev næret i kun én af de PDAC prøver i henhold til den lave forekomst af EGFR somatiske ændringer fundet i bugspytkirtelkræft af andre [42], [43]. Endelig rapporterer vi for første gang en somatisk mutation i kinasedomænet af KIT (R740K) i PDAC cancer.

KIT

, også betegnet som

CD117

, ofte påvirket af aktiverende mutationer i mave-tarm stromale tumorer [44], [45], hvilket repræsenterer en logisk terapeutisk mål for denne malignitet [46 ]. Selv om flere undersøgelser tyder en involvering af KIT i pancreas carcinogenese, har ingen somatiske mutationer er tidligere blevet fundet [47] – [49]

Bund

, kromatogram af sekvensen af ​​en tumorprøve.;

top

, kromatogram af den matchede normale. Pile angiver placeringen af ​​missense mutation. Nummer over sekvensen spor er del af softwaren output. Den nukleotidnummerering bruger A for ATG translationsinitiering startsted som nukleotid +1, baseret på referenceværdier sekvenserne tilvejebragt i supplerende Tabel S3. En mutation i PDAC; B, mutation i PDAC; C, mutation i AVC.

Forkortelser:.

G, genomisk sekvens; s., protein sekvens.

Med hensyn AVC vi analyserede i alt 16 prøver, herunder 15 primære tumorer og én cellelinje. Vi fandt i alt fire forskellige somatiske mutationer, hvoraf tre var missense og et var en lille indføring, der påvirker følgende gener (Tabel 1):

ATM, EGFR, EPHA3

, og

ERBB2

. Den somatiske mutation

ERBB2

V777L tidligere er blevet fundet i humane kræftformer [50], [51]. Desuden en omhyggelig analyse af

ERBB2

sekvens elektroferogram viste, at den top, der svarer til mutationen var mindre i forhold til sin vildtype modstykke (figur 1C). Dette tyder forekomsten af ​​denne variant kun en subpopulation af tumorceller af prøverne. Et af de mest interessante ændringer vi fandt var indsættelsen forekommer i exon 22 af EGFR, der fører til et for tidligt stop-codon ved aminosyre 896 i det katalytiske domæne af proteinet. Denne mutation dog brug for yderligere evaluering for at bestemme dens funktionelle betydning. Interessant,

EPHA3

K207N mutation er også blevet påvist i en PDAC prøve. Dette tyder muligvis en delvis overlappende spektrum af genmodifikation bag disse forskellige bugspytkirtelkræft undertyper, medmindre disse er mutationer, der forekommer ved en tilfældighed.

Som konklusion i denne undersøgelse identificerede vi 10 forskellige mutationer påvirker 9 kinase gener i bugspytkirtlen duktalt adenokarcinom og ampulla Vateri cancere. Ingen bestemt mønster af somatiske mutationer blev identificeret for hver tumortyper og kun én ændring (

EPHA3

K207N) viste overlap mellem tumortyper analyserede. I overensstemmelse med resultaterne fra tidligere undersøgelser observerede vi en lav frekvens af specifikke somatiske mutationer i kinase gener [15], [16], [18] – [22], [34]. Bortset fra

FGFR2

PIK3CA

mutationer, der er ramt humane tumorcellelinjer, de resterende 8 mutationer blev fundet i prøver afledt af primære tumorer og var somatiske oprindelse som vurderet af sekventering af matchet normal DNA (data ikke vist). Med hensyn til PDAC nylig Jones

et al.

Udført en omfattende genetisk analyse føre til identifikation af et defineret sæt af delvist overlappende signalveje, der blev ændret, på trods af at ændringerne påvirker den enkelte komponent varierede meget mellem individuelle tumorer [34]. Heller ingen af ​​de somatiske mutationer beskrevet af Jones

et al

blev fundet i vores analyser og omvendt. Vores og tidligere resultater tyder således at en dyb genetisk analyse for hvert gen kan udføres i en større serie af pankreatiske duktale adenocarcinom prøver at optrævle bidrag et specifikt gen til pancreas tumorgenese.

Endelig ingen af ​​ændringer vi fandt i primære tumorer blev beskrevet tidligere i kræft. Disse ændringer kræver yderligere eksperimentel evaluering for at bestemme deres funktionelle relevans og i nogle tilfælde kan vise sig at repræsentere passager frem for førerens mutationer. På den anden side, lokalisering inden for definerede proteindomæner indikerer funktionel relevans af de fleste af de genetiske ændringer identificeret. Endvidere mutationerne påvirke gener, som er potentielt relevante som mål for farmakologisk intervention for disse cancertyper. Det er tilfældet med de mest lovende ændringer vi fandt påvirker

EPHA3

EPHB2

gener i pancreas adenocarcinom og AVC prøver i betragtning af deres spirende rolle som attraktiv terapeutisk mål i kræft [41].

Støtte Information

Figur S1. Salg Eksempler på somatiske mutationer identificeret i primære PDAC prøver. Kromatogrammerne henviser til sekvensen af ​​tumorprøver. A, homozygot mutation i BRAF (g.143148 G T, p.G464V). B, heterozygot mutation i EPHB2 (g.152108 G C, p.D283H). Pile angiver placeringen af ​​missense mutation. Numre over sekvensen spor er del af softwaren output. Nucleotid nummerering bruger A i ATG translationsinitiering startsted som nukleotid 1, baseret på reference- sekvenser, der er fastsat i supplerende tabel S3

doi:. 10.1371 /journal.pone.0012653.s001

(1,35 MB TIF)

tabel S1.

Klinisk oplysninger om pancreas tumorer inkluderet i undersøgelsen

doi:. 10,1371 /journal.pone.0012653.s002

(0,06 MB DOC)

tabel S2.

pancreas tumor cellelinier inkluderet i denne undersøgelse

doi:. 10,1371 /journal.pone.0012653.s003

(0,03 MB DOC)

tabel S3. Salg Protein kinase gener og primere anvendt til PCR-amplifikation og sekventering

doi:. 10,1371 /journal.pone.0012653.s004

(0,24 MB DOC)