PLoS ONE: Kombineret Analyse af Plasma Amphiregulin og Heregulin forudser Reaktion på Cetuximab i metastatisk kolorektal cancer

abstrakt

Baggrund

Amphiregulin, en ligand af epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), er forbundet med effektiviteten af ​​cetuximab, et antistof mod EGFR, som behandling for kolorektal cancer ( CRC). I modsætning hertil HER3 ligand heregulin korrelerer med cetuximab modstand. I denne undersøgelse, vi vurderet, hvordan de kombinerede niveauer af cirkulerende amphiregulin og heregulin påvirker kliniske resultater hos patienter, der får cetuximab som terapi mod avancerede CRC.

Metoder

Plasma niveauer af amphiregulin og heregulin blev målt ved enzymbundet immunosorbentassay i 50 patienter med CRC i en uddannelse kohorte, og i 10 patienter i en validering kohorte. Den kombinerede udtryk blev derefter vurderet med kliniske resultat efter receiver driftsegenskaber analyse.

Resultater

Samlet responsrate var 26%, og den mediane progressionsfri overlevelse var 110 dage i uddannelsen kohorte. Patienter med høj amphiregulin og lav heregulin havde signifikant højere objektiv responsrate på 58% og signifikant længere progressionsfri overlevelse af 216 dage. Dette resultat blev bekræftet i valideringen kohorten

Konklusion

En undergruppe af CRC patienter med forhøjet amphiregulin og lav heregulin reagerer på cetuximab bedre end andre patienter

Citation..: Yonesaka K, Takegawa N, Satoh T, Ueda H, Yoshida T, Takeda M, et al. (2015) kombineret analyse af plasma Amphiregulin og Heregulin forudser Reaktion på Cetuximab i metastatisk kolorektal cancer. PLoS ONE 10 (11): e0143132. doi: 10,1371 /journal.pone.0143132

Redaktør: Mariko Okada (Hatakeyama), Riken Center for Integrative Medical Sciences, JAPAN

Modtaget: Juni 6, 2015; Accepteret: 30 oktober 2015; Udgivet: November 16, 2015

Copyright: © 2015 Yonesaka et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

finansiering:.. forfatterne modtaget nogen specifik finansiering til dette arbejde

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Indledning

tarmkræft (CRC) ofte overudtrykke epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), som er forbundet med tumorprogression og dårlig prognose [1]. Således EGFR er et terapeutisk mål, ikke blot mod CRC, men også mod andre cancertyper, hvor den er rigeligt udtrykt. Terapeutiske midler, der er målrettet EGFR er enten EGFR-tyrosinkinaseinhibitorer eller monoklonale antistoffer [2]. Kinaseinhibitorer såsom gefitinib og erlotinib er meget effektive mod ikke-småcellet lungekræft med konstitutivt aktive EGFR-mutationer [3]. På den anden side, monoklonale antistoffer, såsom cetuximab og panitumumab forbedre prognosen hos patienter med CRC og hoved og hals pladecellekarcinom, som udtrykker vildtype-EGFR [4-7].

Prækliniske studier viser, at nogle kræftformer følsomme til anti-EGFR-behandling også rigeligt udtrykke EGFR-ligander, især amphiregulin [8]. Som følge heraf er EGFR konstitutivt aktiveret i disse celler ved autokrin måde. Især patienter med CRC’er der rigeligt udtrykkelig amphiregulin erfaring betydeligt bedre resultater med cetuximab end patienter med lav CRC udtryk for amphiregulin [9, 10]. Faktisk er niveauer af amphiregulin i plasmaet forbundet med cetuximab virkning [11].

heregulin også ligand af HER3, er ligeledes højt udtrykt i nogle CRCs, og i nogle lunge, hoved og halscancer [12 -15]. Fysiologisk, heregulin binder til HER3 og udløser heterodimerisering mellem HER2 og HER3, en begivenhed, der aktiverer både receptorer [16, 17]. Til gengæld, HER3 aktiverer AKT, og derved forhindrer apoptose. Publicerede data viser, at overekspression af heregulin forårsager cetuximab resistens i CRC, selv simultane hæmning af HER2 og HER3 overvinder denne modstand [13, 18]. Desuden er plasma heregulin negativt korreleret med progressionsfri overlevelse og samlet overlevelse i CRC patienter, der gennemgår cetuximab.

Det er klart, amphiregulin og heregulin væsentligt påvirke prognosen for CRC patienter behandlet med cetuximab. Imidlertid er kliniske resultater ikke altid forklares med én faktor eller den anden. Nogle CRC patienter rigeligt udtrykker amphiregulin samt andre med lave niveauer af heregulin, ikke reagerer på cetuximab [11, 13]. En mulig årsag kan være, at disse molekyler interagerer. Faktisk tidligere undersøgelser viser, at mens CRC cellelinien Difi rigeligt udtrykker amphiregulin og er følsom over for cetuximab, stabil transfektion med heregulin forårsager resistens [18]. Derfor undersøgte vi, om det samlede niveau af cirkulerende amphiregulin og heregulin mere pålideligt kunne forudsige kliniske resultater af cetuximab i CRC patienter.

Materialer og Metoder

Patienter og behandling

undersøgelsen omfattede patienter, der behandles for metastatisk CRC på Kinki University School of Medicine i perioden september 2010 til august 2015. patienterne havde modtaget FOLFIRI (leucovorin, 5-fluorouracil, og irinotecan) eller FOLFOX (leucovorin, 5-fluorouracil, og oxaliplatin) som første- eller second-line kemoterapi. De fleste patienter havde desuden fået bevacizumab, men ikke antistoffer mod EGFR. Som tredje-line kemoterapi, blev patienterne behandlet hver anden uge med cetuximab, alene eller i kombination med irinotecan. Medmindre justeres af den behandlende læge, blev cetuximab givet med en initialdosis på 400 mg /m

2 og derefter ved 250 mg /m

2 ugentligt. Undersøgelsen blev godkendt af Institutional Review Board of Kinki University School of Medicine. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter. Patienterne blev delt i en uddannelse kohorte af 50, og en validering kohorte af 10.

Måling af plasma amphiregulin og heregulin

Plasmaprøver blev trukket fra patienter før behandling med anti-EGFR. Amphiregulin og heregulin-niveauer blev målt ved anvendelse af kommercielt tilgængelig enzymbundet immunosorbentassay kits (Humant amphiregulin og Heregulin Quantikine ELISA kits, R 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Statistiske analyser og visualisering blev udført i GraphPad Prism v.5.0 til Windows (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA).

Resultater

Patient karakteristika

Patient karakteristika er sammenfattet i tabel 1. Alle patienter havde vildtype

KRAS

. Af de 50 patienter analyseret, 39 modtaget cetuximab og irinotecan som tredje-line kemoterapi. Men alle andre patienter fik cetuximab alene på grund af dårlig generelle sundhed eller væskeretention. Tretten patienter oplevede partiel respons på cetuximab. Således er den samlede responsrate var 26%. Atten patienter havde stabil tumorer i mere end 8 uger, mens 19 patienter havde kortsigtet cancer progression. Den samlede sygdomskontrolrate var 62%. Median progressionsfri og samlet overlevelse var 110 dage og 201 dage. Behandlingen blev afbrudt for alle patienter på grund af kræft progression, med undtagelse af tre patienter, der flyttede til en anden hospital. Toksicitet var ikke tydelig. Der var ingen signifikante forskelle i svarprocenten, når patienterne blev stratificeret ved for hver variabel, herunder alder, køn, primær tumor site, ECOG PS, og regime (Fishers eksakte test,

s

0,05, S1 Table) .

Cirkulerende amphiregulin og heregulin

amphiregulin og heregulin koncentrationer i plasmaet er vist i fig 1A og 1B, med median 11,5 pg /ml (interval 0-327 pg /ml) og 1,357.5 pg /ml (interval 0-18,045 pg /ml), hhv. Sammenhæng mellem koncentrationerne af disse molekyler blev ikke observeret (Pearson korrelation r = 0,067), og niveauet var ikke signifikant korreleret med patientens karakteristika, herunder køn, alder, primær tumor site, performance status, og behandlingsregime (tabel 2,

t

test, p 0,05). Amphiregulin niveau tendens til at være højere i Cetuximabs-responderende patienter, hvorimod heregulin niveau er betydelig lavere i resistente patienter (

t

test,

s

= 0,001). Således udførte vi ROC analyser til bestemmelse cutoff punkter, hvor amphiregulin og heregulin har optimal følsomhed og specificitet til at forudsige respons eller non-respons på cetuximab, (fig 1C og 1D). Ved 16,8 pg /ml, amphiregulin havde sensitivitet 76,9% (95% CI: 46,2% -95,0%) og specificitet 67,6% (95% CI: 50,2% -82,0%). Brug af denne cutoff point, 22 patienter (44%) blev betragtet amphiregulin positivt til forudsigelse respons med responsrate 45% (10/22). På den anden side, heregulin ekspression på 1292 pg /ml havde sensitivitet 62,2% (95% CI: 44,8% -77,5%) og specificitet 69,2% (95% CI: 38,6% -90,9%). Baseret på denne cutoff punkt blev 27 patienter (54%) betragtes heregulin positivt til forudsigelse af ikke-svar med responsrate 15% (4/27).

Plasma amphiregulin (A) og heregulin (B) var målt ved enzymkoblet immunosorbentassay. Hver søjle repræsenterer en enkelt patient. Modtager opererer karakteristik (ROC) kurver er vist for evne amphiregulin (C) og heregulin (D) til at forudsige respons og non-respons på cetuximab.

Foreningen af ​​amphiregulin og heregulin med cetuximab respons

Vi undersøgte, om det samlede niveau af plasma amphiregulin og heregulin var forbundet med respons på anti-EGFR-behandling (tabel 3). Vi kategoriseret patienter i fire klasser afhængigt af, om ekspression af hvert molekyle var høj eller lav, med cutoff-værdier, som ROC-analyse (fig 2). Således blev 15 patienter anset for at have lav amphiregulin og høj heregulin, mens 13 blev anset for at have lave niveauer af begge. Af de resterende patienter, 10 blev kategoriseret som har høje niveauer af både, og 12 blev beskrevet som havende høj amphiregulin og lav heregulin. Objektive responsrate blev vurderet i hver klasse. Hos patienter, der rigeligt udtrykker amphiregulin men ikke heregulin, den objektive responsrate var 58%. Især denne svarprocent er signifikant forskellige (

s

= 0,0069, Fishers eksakte test) fra svarprocenten i andre patienter 16% (n = 38). Desuden var responsraten 7% hos patienter med lavt amphiregulin og høj heregulin, 15% hos patienter med lavt amphiregulin og lav heregulin, og 30% hos patienter, som udtrykker både ligander rigeligt.

Patienter blev kategoriseret i fire grupper baseret på median niveauer af amphiregulin (16,8 pg /ml) eller heregulin (1.292 pg /ml). Røde prikker er patienter, som responderede på anti-EGFR-behandling.

Foreningen af ​​plasma amphiregulin og heregulin med overlevelse

Vi analyserede virkningen af ​​amphiregulin og heregulin niveauer på progressionsfri fri og samlet overlevelse. I overensstemmelse med bedre svarprocenter, patienter, der rigeligt udtrykkelig amphiregulin men ikke heregulin oplevet signifikant længere progressionsfri overlevelse end andre patienter (log-rank test,

s

0,05), med median 216 dage og 81 dage, (fig 3). Patienter, som udtrykker begge molekyler ved høje niveauer oplevet en median på 65 progressionsfri dage, mens de, der udtrykker både på et lavt niveau havde median progressionsfri overlevelse på 119 dage. Endelig patienter lav amphiregulin og høj heregulin havde median 76 progressionsfri dage (Fig A i S1 File).

Plasma niveauer af amphiregulin og heregulin blev målt ved ELISA. Patienterne inddeles i undergrupper baseret på amphiregulin (AR) eller heregulin (HRG) overflod, som vist i fig 2. Den røde kurve viser overlevelse hos patienter med høj amphiregulin og lav heregulin (n = 12), og den grønne linie repræsenterer overlevelse i alle andre patienter (n = 38).

Disse tendenser afspejles i den samlede overlevelse. Således patienter med høje niveauer af amphiregulin og lave niveauer af heregulin tendens til at opleve længere samlet overlevelse end andre patienter med mediane 356 dage (Fig 4). Dem med lave eller høje niveauer af begge molekyler overlevede en median på 231 og 164 dage. Endelig patienter, der udtrykker heregulin overflod, men ikke amphiregulin havde median samlet overlevelse på 150 dage (Fig B i S1 File).

Plasma niveauer af amphiregulin og heregulin blev målt ved ELISA. Patienterne inddeles i undergrupper baseret på amphiregulin (AR) eller heregulin (HRG) overflod, som vist i fig 2. overlevelse hos patienter med høj amphiregulin og lav heregulin (n = 12) er afbildet i rødt. Overlevelse i alle andre patienter (n = 38) er afbildet i grøn.

Plasma amphiregulin, heregulin, og cetuximab respons i en validering kohorte

Vi valideret foreningen af ​​de to ligander med cetuximab reaktion ved hjælp af en uafhængig sæt af 10 patienter. Tre af disse patienter havde høj amphiregulin og lav heregulin, mens tre havde lav amphiregulin og høj heregulin. Af de resterende patienter, tre udtrykte begge ligander på et lavt niveau, og man udtrykte begge rigeligt (Fig C i S1 File). Tre patienter var lydhøre over for anti-EGFR-behandling, som alle havde høj amphiregulin men ikke heregulin (tabel 4).

Diskussion

Vi og andre har tidligere rapporteret, at EGFR-ligander, især amphiregulin, er forbundet med cetuximab virkningsfuldhed [8-10]. I modsætning hertil blev HER3 ligand heregulin signifikant korreleret med cetuximab modstand [13, 18]. Denne undersøgelse er den første til at undersøge, om den kombinerede udtryk for amphiregulin og heregulin påvirker resultatet af anti-EGFR-behandling i CRC patienter. Vi fandt, at patienter med høje niveauer af amphiregulin og lave niveauer af heregulin reagere væsentligt bedre at cetuximab, med 58% objektiv responsrate og 216 dage median progressionsfri overlevelse. Svaret er især bedre end den offentliggjorte samlede respons i den generelle CRC befolkning [4, 20, 21]. Disse resultater blev valideret i en mindre, men uafhængig kohorte, og foreslå, at vurderingen af ​​både amphiregulin og heregulin i plasma kan mere præcist at forudsige cetuximab resultat, og kan således danne grundlag for optimering af CRC-behandlinger.

I modsætning patienter der rigeligt udtrykker både amphiregulin og heregulin erfaring dårlige resultater. Dette kliniske observation er i overensstemmelse med laboratorieforsøg under anvendelse af CRC-cellelinien Difi [18]. Faktisk har Difi celler med høje niveauer af amphiregulin øget følsomhed over for cetuximab, mens celle overekspression heregulin er resistente over for cetuximab

in vitro

i muse-xenotransplantater. Derfor kan patienter med disse karakteristika kræve yderligere, nye eller alternative behandlinger for at overvinde modstand. For eksempel er det blevet påvist, at celler, der overudtrykker heregulin er følsomme over for en kombination af cetuximab og patritumab, et antistof mod HER3, selv om hvert antistof i sig selv er ineffektiv [18]. Alternativt kombinerer cetuximab med en nedstrøms inhibitor af HER3 kan vise sig også vise sig effektiv. Sådanne forbindelser indbefatter inhibitorer af PI3K og AKT.

Især tre patienter med lave niveauer af amphiregulin reagerede også på cetixumab, hvilket antyder, at EGFR aktiveres af andre ligander i en lille gruppe patienter. Faktisk er EGFR kendt for at binde seks forskellige ligander, herunder EGF, transformerende vækstfaktor-α, amphiregulin, betacelluline, heparinbindende EGF, eller epiregulin [8]. Heraf har epiregulin ekspression i tumorer vist sig at korrelerer også med cetuximab effekt [9, 10]. I sidste ende kan alle EGFR-ligander skal evalueres til at forudsige cetuximab respons.

Men denne undersøgelse er begrænset af små stikprøvestørrelser, og den tilbagevirkende kraft af analysen. For at løse disse begrænsninger, er vi nu gennemføre en prospektiv randomiseret klinisk forsøg med anti-EGFR-behandling i avancerede CRC patienter, hvor vi måler kliniske resultat som en funktion af plasma amphiregulin og heregulin. Vi forventer, at dette forsøg vil give flere beviser på brugen af ​​amphiregulin og heregulin som biomarkører.

Støtte Information

S1 datasæt. Fuld datasæt

doi:. 10,1371 /journal.pone.0143132.s001

(XLSX)

S1 fil. Kaplan-Meier progressionsfri overlevelsesrater kurver (figur A). Kaplan-Meier samlet overlevelse kurver (figur B). Scatter diagram af plasma amphiregulin og heregulin i validering kohorte herunder 10 patienter med kolorektal cancer (Fig C)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0143132.s002

(PDF)

S1 tabel. Svarprocent når patienterne blev stratificeret efter for hver variabel

doi:. 10,1371 /journal.pone.0143132.s003

(PPTX)

Tak

Vi takker alle patienter, der var indskrevet i denne undersøgelse.