PLoS ONE: Cancer Stem Cell-Like Side Befolkning Celler i Clear celle renalcellecarcinom cellelinje 769P

Abstrakt

Selvom kræft er almindeligt anset for at blive vedligeholdt af stamceller, eksistensen af ​​stamceller i renal celle carcinoma (RCC) er sjældent blevet rapporteret, delvis på grund af manglen af ​​unikke overflademarkører. Vi her identificeret cancer stamcellelignende celler med side befolkning (SP) fænotype i fem humane RCC-cellelinjer. Flowcytometri-analyse afslørede, at 769P, en human clear cell RCC-cellelinie, indeholdt den største mængde af SP-celler i forhold til andre fire cellelinier. Disse 769P SP celler besad karakteristika spredning, selvfornyelse, og differentiering, samt stærk modstand til kemoterapi og strålebehandling, der var muligvis relateret til ABCB1 transporteren.

In vivo

eksperimenter med seriel tumor transplantation i mus viste også, at 769P SP celler dannede tumorer i NOD /SCID-mus. Tilsammen indikerer disse resultater, at 769P SP celler har egenskaberne af cancer stamceller, som kan spille en vigtig rolle i tumorigenese og terapi-modstand RCC

Henvisning:. Huang B, Huang YJ, Yao ZJ, Chen X, Guo SJ, Mao XP, et al. (2013) Cancer Stem Cell-Like Side Befolkning Celler i Clear celle renalcellecarcinom cellelinje 769P. PLoS ONE 8 (7): e68293. doi: 10,1371 /journal.pone.0068293

Redaktør: Neil A. Bhowmick, Cedars Sinai Medical Center, USA

Modtaget: Marts 1, 2013; Accepteret: 28. maj 2013; Udgivet: 11. juli 2013 |

Copyright: © 2013 Huang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation (No. 81.272.809, No. 80.202.011, No. 81.202.013, nr 30.872.584); Guangdong Natural Science Foundation (nr 8251008901000018, No. S2012040007557); Sun Yat-sen Innovative talenter Dyrkning Program for Excellent Underviserne (nr 80.000 til 3.126.205); Videnskab og Teknologi Planlægning Projekt i Guangdong-provinsen, Kina (nr 2011B050400021, No. 2012B090600021, No. 445323198311050317); og Guangdong Key Laboratory of Urology, den første tilknyttet Hospital i Guangzhou Medical University (nr 2010A060801016). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Nedsat kræft er en vigtig sundhedsproblem, der forårsager mere end 15.000 dødsfald i Nordamerika årligt. Nedsat cancer med metastaser eller fremskredent stadium i voksne er resistent over for konventionelle kemoterapeutiske stoffer [1]. Belyse tilblivelsen af ​​denne kræft vil hjælpe tidlig diagnose og behandling, og derved forbedre prognosen.

Solide tumorer er sammensat af forskellige typer af celler med forskellig kapacitet af proliferation. Kun en lille population af disse celler kan danne tumorer i immunsvækkede mus [2]. Denne iagttagelse har ført til begrebet cancer stamceller (CSCS), såkaldte tumor-initierende celler eller stamceller-lignende cancerceller [3], [4], [5], [6], som er blevet tænkt stand prolifererende, selvfornyende, og differentiere til flere slægter, hvorved spiller en væsentlig rolle i både udviklingen og behandlingen af ​​tumorer [2], [3]. Selvom CSCS er blevet isoleret fra flere typer af humane tumorer, herunder hæmatologiske cancere [7], ovariecancer [8], prostatacancer [9], brystcancer [10], og hjernetumorer [11], den manglende CSC-specifik celleoverfladeantigen markører har afgrænset yderligere undersøgelser om dette emne [12]. Side befolkning (SP) er en flowcytometri (FCM) udtryk for at definere celleklynger med stærk evne til at udstrømning DNA farvestof Hoechst 33342 via ABC transportører. Side population celler forsvinder efter behandling med enten calciumantagonister eller inhibitorer af ABC transportører, såsom verapamil og rapamycin [13] .Dette aktivitet fører til den “side” (lav fluorescens) fænotype af befolkningen og menes at være en grundlæggende self -protective funktion og dermed en universel kendetegnende for stamceller [14], [15]. Da det først blev introduceret af Goodell et al. i 1996 [16], har SP celler blevet bredt rapporteret at være beriget med forskellige ondartede væv som brystkræft [17], gastrointestinale system tumor [18], og små-cellet lungekræft [19] og fra cellelinier, såsom nasopharyngeal carcinoma [20], hepatocellulær carcinoma [21], og blære cancercellelinier [22]. SP-celler, med stemness potentialer, kan danne xenotransplantattumorer hos dyr og er resistente over for kemoterapi og strålebehandling, bidrager til tumortilbagefald [23].

RCC, den tredje mest almindelige cancer i urinvejene, tegner sig for ca. 3% af alle menneskelige maligniteter. RCCS er klassificeret som klar celle, papillær, kromofobt, indsamling kanalen, og uklassificerede RCC, med klare celle RCC (CCRCC) som den mest udbredte type. Det tegner sig for 82% af RCCS. Behandlingen af ​​metastatisk CCRCC fortsat at være en stor udfordring for klinikere og forårsager ca. 35% af RCC dødelighed [24]. RCC tilfælde har været støt stigende i årtier [25]. Desuden har de fleste patienter, der allerede har enten metastatisk sygdom ved den første diagnose eller fjernmetastaser efter primær tumor resektion [26]. Prognosen for RCC dels ringe på grund af modstanden af ​​metastatisk RCC til de fleste nuværende terapier, såsom kemoterapi og strålebehandling. Målrettet terapi mod CSCS kan bringe nyt håb for at forbedre prognosen for patienter med RCC.

Selv om der er gjort betydelige fremskridt med SP forskning, forbliver den rolle SP celler i RCC at være fuldt bestemmes [27], [28 ], [29], [30]. Addla et al. [29] har rapporteret, at både normale og maligne renale epitelceller indeholdt en del af SP-celler, som var berige med nogle stamcellelignende egenskaber. For nylig Nishizawa et al. [30] har fundet, at SP celler afledt fra RCC celler viste højere tumorfremkaldende evne end NSP-celler. Derfor vi hypotese, at SP-celler er en beriget brøkdel af cancer stamceller.

Den foreliggende undersøgelse blev gennemført for at identificere de SP celler fra etablerede humane RCC-cellelinjer og at bestemme deres egenskaber og roller i tumorigenese og behandling af RCC. Her har vi isoleret SP-celler fra 769P celler, en human CCRCC cellelinie, af Hoechst-farvning og flowcytometri. Vores in vitro og in vivo forsøg viste, at SP celler besad de velkendte CSC karakteristika spredning, selvfornyelse, og differentiering, samt stærk modstand til kemoterapi og strålebehandling, der var muligvis relateret til ABCB1 transporteren. Disse resultater kan give ny indsigt til fremtidig CSC forskning og klinisk anti-cancer terapi.

Materialer og Metoder

Cell Kultur

Fem humane RCC-cellelinjer 769P, 786-O , OS-RC-2, SN12C, og SKRC39 blev anvendt i denne undersøgelse. Cellelinier 769P og 786-O blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA); OS-RC-2, SN12C, og SKRC39 blev venligt begavet af Dr. Zhuowei Liu (Department of Urology, Sun Yat-sen University Cancer Center), der opnåede disse cellelinjer fra Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina) [31], [32], [33]. 769P, 786-O, OS-RC-2, og SKRC39 celler blev dyrket i RPMI-1640 (Gibco, Carlsbad, Californien, USA), hvorimod SN12C celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM, Gibco) ved 37 ° C i en CO 5%

2 atmosfære. Begge medier indeholdt 10% føtalt kalveserum (FCS, Gibco), 1% (v /v) penicillin og 100 ug /ml streptomycin.

Side Population Analyse og Celle Sortering

Side befolkning analyse og cellesortering blev udført som beskrevet tidligere af Goodell et al. [16] med modifikation. Kort beskrevet blev celler trypsiniseret, suspenderes ved 1 x 10

6 celler /ml i forvarmet RPMI-1640 indeholdende 2% FBS og 10 mmol /l HEPES (Gibco), derefter inkuberet med 5 ug /ml Hoechst 33342 (Sigma , St. Louis, MO, USA) enten alene eller i kombination med 50 pmol /L verapamil (Sigma), en ABC transporter inhibitor, i mørke i 90 minutter i 37 ° C vandbad med intermitterende blanding. Ved udgangen af ​​farvning blev cellerne spundet ned og resuspenderet i kold HBSS (Gibco) indeholdende 2% FBS og 10 mmol /l HEPES. FCM-analyse og cellesortering blev derefter udført direkte på EPICS ALTRA Flow Cytosorter (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA). Hoechst 33342 var ophidset med 100 mW UV laser og blev påvist med 450 BP filter til blå fluorescens og 675 BP filter til rød fluorescens. En 610-

nm dikroisk spejl kort

–

passere

(DMSP) filter blev anvendt til at adskille emissionsbølgelængder. En polygonal levende port i FS-HO blå plot blev skabt for at udelukke snavs og døde celler. SP celler og ikke-SP (NSP) celler blev sorteret for de følgende analyser.

Klon Dannelse og Langsigtet Differentiering Analyser

Under autoclone sortering tilstand, hver 500 769P celler af SP eller NSP fænotype blev sorteret direkte i en 6 cm dyrkningsskål og dyrket med RPMI-1640 komplet dyrkningsmedium i 10 dage. Efter de fleste cellekloner havde udvidet til mere end 50 celler, blev de vasket to gange med PBS, fikseret i 75% methanol i 15 minutter, og farves med krystalviolet i 15 minutter ved stuetemperatur. Efter inkubering blev retter skyllet og antallet af kloner, som indeholdt mere end 50 celler blev talt under et fasekontrastmikroskop. Klonen dannelse effektivitet var forholdet mellem antallet af kloner til antallet af podede celler. Klon formation assays blev gentaget tre gange.

Den langsigtede differentiering blev udført 10 dage efter cellesortering, ifølge protokollen af ​​side population analyse, for at bestemme differentiering evne SP og NSP-celler.

Afsløring mRNA ekspression af ABC familiemedlemmer i Sorteret 769P SP celler ved RT-PCR

Total RNA blev ekstraheret fra SP og NSP celler separat bruger Trizol reagens (Invitrogen, San Diego, CA). Ekspressionen af ​​ABCB1, ABCC1, og ABCG2 blev påvist ved hjælp af PrimeScript

TMRT-PCR Kit (Takara, Otsu, Japan) ifølge producentens instruktioner. Primerne (tabel 1) blev designet og syntetiseret ved Invitrogen. GAPDH blev anvendt som en intern reference. PCR-betingelserne var denaturering ved 94 ° C i 4 min efterfulgt af 40 cyklusser af annealing ved 94 ° C i 45 s, 58 ° C i 30 s og 72 ° C i 45 s, med forlængelse ved 72 ° C i 8 minutter . PCR produkterne blev analyseret ved elektroforese på 1,5% agarose for mRNA ekspressionen af ​​ABC familiemedlemmer.

Afsløring Protein Expression af ABC familiemedlemmer i Sorteret 769P SP Celler ved Western Blotting

Total proteiner blev ekstraheret fra SP og NSP-celler separat og denatureret i natriumdodecylsulfat (SDS) prøvebuffer, derefter ligeligt fyldt på 8% polyacrylamidgel. Efter elektroforese blev proteinerne overført til en polyvinylidendifluoridmembran. Blots blev inkuberet med angivne primære antistoffer natten over ved 4 ° C, derefter inkuberet med peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof, og endelig blev påvist under anvendelse af forøget kemiluminescens Western blotting påvisningsreagenser (GE Healthcare, UK). Musen ABCG2 (kl 1:1,000 fortynding), ABCB1 (1:1,000), og ABCC1 (1:5,000) monoklonale antistoffer fra Abcam Inc. (Cambridge, UK) samt anti-GAPDH (1:2,000) fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) blev anvendt til at bestemme relative proteinniveauer.

stråling og lægemiddelfølsomhed Assays Salg

for at bestemme følsomheden af ​​celler for stråling, frisk sorteret SP og NSP-celler var udsået i 6-brønds plader (500 celler /brønd), og blev udsat for 5 Gy røntgen (500 cGy /min, under anvendelse af en 12 cm x 6 cm bestrålingsfeltet) med eller uden 30 minutters præ-inkubering med verapamil (50 pmol /L) dagen efter sortering. Når de fleste cellekloner havde mere end 50 celler, blev de farvet med krystalviolet til bestemmelse af antallet af overlevelse celler.

For at bestemme følsomheden af ​​celler til narkotika, blev SP og NSP-celler podet i 96-brønds plader (500 celler /brønd) og dyrket med mitoxantron (MTX, en topoisomerase II-hæmmer antineoplastisk middel, Sigma), 5-fluorouracil (5-FU, Sigma), eller sunitinib (en tyrosinkinasehæmmer, Sutent, Pfizer, New York, USA ) den følgende dag i en koncentrationsgradient, med eller uden 30 minutters præinkubation med 50 pmol /ml verapamil som chemosensitizer til mitoxantron. Ubehandlede celler blev anvendt som kontrol. Fire parallelle brønde blev sat for hver gruppe. Efter 3 dage, absorbansen af ​​hver brønd ved en bølgelængde på 570 nm (

En

570) blev målt. Cell overlevelse blev beregnet ved hjælp af formlen: overlevelse = (gennemsnitlig

En

570 af testbrøndene /betyder

En

570 af kontrol- brønde) × 100% . Inhibition blev beregnet ved hjælp af formlen:. Hæmning sats = 100% – overlevelsesrate

xenograft tumordannelse Assay

Dyreforsøg blev udført i nøje overensstemmelse med vejledning om pasning og anvendelse af Laboratorium Dyr af Sun Yat-sen University. Protokollen blev godkendt af Udvalget for den etiske af dyreforsøg i First Affiliated Sygehus af Sun Yat-sen University. I alt 54 5- til 7 uger gamle nonobese diabetiske (NOD) /alvorlige kombinerede immundefekte (SCID) hunmus blev opnået fra Experimental Animal Center of Sun Yat-sen University. Musene blev inddelt i 6 grupper, med 9 mus i hver gruppe. Angivne mængde frisk sorteret SP og NSP celler blev suspenderet i 200 pi PBS, separat og inokuleret subkutant i axillære fossa af NOD /SCID-mus umiddelbart efter sorteringen. Musene blev overvåget to gange om ugen for dannelsen af ​​tydelige tumorer. Ved 6 uger efter inokulering blev musene aflivet for at vurdere tumordannelse. Tumorer blev målt med en skydelære, vejet og fotograferet. En portion af hver subkutane tumor blev opsamlet, fikseret i 10% formaldehyd, og indlejret i paraffin for patologisk vurdering efter H 0,5 mM fragmenter og alle synlige klumper blev fjernet, derefter fordøjet med 1 mg /ml collagenase type II (Sigma) og 1,2 mg /ml Dispase (Sigma) i 45 til 90 min ved 37 ° C. Lejlighedsvis blev 0,2 ug /ml trypsin (Invitrogen), der anvendes i 10 min for at sikre dissociering i enkeltceller. Cellerne blev filtreret gennem fortløbende 70-um celle sier at fjerne de sidste klumper. Opsamlede celler blev suspenderet i PBS suppleret med 1% FCS. Mindst 100.000 høstede celler blev farvet for SP-analyse. Tyve 5- til 6 uger gamle SDIC hunmus blev opdelt ligeligt i 4 grupper for seriel transplantation assay. Hver 5.000 celler adskilles fra en xenograft tumor, som blev dannet med 2.000 SP celler, 20.000 SP celler, 20.000 NSP celler eller 200.000 NSP celler, blev re-inokuleret i en NOD /SCID mus. Tumor vurdering dannelse og patologisk undersøgelse blev udført 6 uger senere.

Statistisk analyse

Data er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse (SD) fra mindst tre uafhængige forsøg. Microsoft Office Excel 2007 og SPSS13.0 software blev anvendt til databehandling. Statistisk signifikans blev bestemt med Students

t

test. En

P

værdi 0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

Eksistensen af ​​SP Celler i RCC cellelinier

Fem RCC-cellelinjer blev analyseret for. deres SP fænotyper. R2 gate viser, at andelen af ​​SP-celler, med dim Hoechst 33342 fluorescens, faldt fra 4,82% blandt 769P celler uden verapamil behandling til 0,02% blandt 769P celler med verapamil præinkubation (fig. 1A). Genprøvning af sorterede celler viste en renhed på 96,61% for SP celler og 99,89% for NSP-celler (fig. 1B). For de øvrige fire RCC-cellelinjer, forholdene mellem SP-celler i 786-O og OS-RC-2 celler var 0,1% og 0,2%, hvilket var for lavt for de følgende eksperimenter; påvistes ingen SP celler blandt SN12C og SKRC39 celler (Fig. S1). Derfor blev SP og NSP celler sorteret fra 769P celler til efterfølgende eksperimenter.

A, SP sortering hjælp Hoechst 33342. En polygonal levende port blev oprettet for at udelukke snavs og døde celler. Mindst 50.000 celler blev erhvervet for at analysere SP fænotype hver prøve. Procentdelen af ​​SP-celler faldt da 769P celler blev præ-inkuberet med verapamil at blokere ATP transporteren. B, renheden af ​​frisk sorteret 769P SP og ikke-SP (NSP) celler var 96,61% og 99,89% (1-0,11%).

Klon Dannelse og Differentiering af Sorteret 769P SP og NSP Cells

Efter 7 dages dyrkning fleste kloner indeholdt mere end 50 celler. Vi talte antallet af kloner og fandt, at den gennemsnitlige klon dannelse effektiviteten af ​​SP-celler var signifikant højere end den for NSP-celler [(56,4 ± 1,3)% vs. (22,7 ± 1,5)%,

P

0,001; Fig. 2A).

A, clone formation assays afslører, at klonen dannelse effektiviteten af ​​frisk sorteret SP-celler var højere end den for NSP-celler. **,

P

0,01. B, 10 dage efter sortering, er andelen af ​​SP-celler (angivet med R2 gate) blandt sorteret SP-celler og sorteret NSP-celler blev målt. Andelen af ​​SP-celler blandt sorterede SP-celler er kun 19,51%, hvilket tyder på, at de fleste sorterede SP-celler differentieret i NSP-celler. Andelen af ​​SP celler blandt sorterede NSP celler er kun 2,39%, hvilket tyder på, at sorterede NSP cellerne ikke kan differentiere i SP celler.

Efter 10 dages kultur, mest sorteres 769P SP celler differentierede i NSP celler, hvorimod der ikke blev opdaget kun en lille del af SP celler blandt sorteret 769P NSP-celler (fig. 2B), hvilket tyder evne SP celler til selv at forny og differentierer til NSP celler.

Angivelse af ABC familiemedlemmer i Sorteret 769P SP og NSP Celler

udtryk for ABCB1 blev ABCG2, og ABCC1 påvist ved RT-PCR og Western blotting. Begge forsøg viste, at ABCB1 blev udtrykt på et højt niveau i sorterede SP celler, men på et ganske lavt niveau i sorterede NSP celler, mens ABCC1 og ABCG2 var målbart i enten sorterede SP eller NSP celler (Fig. 3).

A, revers transkription-polymerasekædereaktion. B, Western blotting. Bane 1, sorteret NSP-celler; bane 2, sorteret SP-celler. GAPDH blev anvendt som den interne kontrol. Begge eksperimenter viser, at ABCB1 udtryk er stærkere i SP end i NSP celler, og at ABCG2 og ABCC1 ikke udtrykkes i SP og NSP celler.

følsomhed Sorteret 769P SP og NSP Celler til Stråling og narkotika

Vi målte følsomhed sorteres 769P SP og NSP-celler for stråling ved klon dannelse assay. Den klon dannelse effektivitet SP celler var signifikant højere end for NSP celler enten før eller efter bestråling (

P

0,05;. Figur 4A). I detaljer, har klon dannelse effektiviteten af ​​SP celler ikke ændre bemærkelsesværdigt efter stråling (

P

0,05), mens den for NSP celler faldet drastisk (

P

0,05), hvilket tyder at SP-celler var mere resistente over for røntgen- skade end NSP-celler.

A, klonen dannelse effektivitet sorteres 769P SP-celler er væsentlig højere end den for NSP-celler enten før eller efter 5 Gy røntgen bestråling. Klonen dannelse effektivitet af SP-celler er signifikant højere end den for NSP-celler efter bestråling (

P

0,01); klon dannelse effektiviteten af ​​ubestrålede NSP celler er betydeligt højere end for bestrålede NSP-celler (

P

0,05). B, nyligt sorteret 769P SP celler er mere modstandsdygtige over for mitoxantron end NSP-celler (

P

0,01), hvorimod vendes denne modstand med verapamil forbehandling. C, SP-celler er også mere modstandsdygtige over for 5-fluoruracil end NSP-celler (

P

0,05). Modstanden kunne også vendes med verapamil forbehandling. D, følsomheden af ​​SP celler til sunitinib er svarer til NSP-celler (

P

0,05)

Vi målte også følsomheden af ​​sorteres 769P SP og NSP celler. til MTX, 5-FU, og sunitinib. SP celler viste stærk modstand til MTX, mens NSP celler følsomme over for MTX (

P

0,001). Verapamil, en ABC transporter inhibitor, forstærkede den inhiberende virkning af MIX på SP-celler, med en spredning inhiberingshastighed svarende til den i NSP-celler under de samme betingelser (

P

0,05); dog verapamil undladt at øge virkningen af ​​MIX på NSP-celler (

P

0,05) (fig 4B.). Vi fandt også, at SP-celler var meget mere resistente over for 5-FU end NSP-celler (

P

0,05;. Figur 4C), men deres følsomhed over for sunitinib var ens (

P

.. figur 4D)

Tumor Dannelse af Sorteret 769P SP og NSP celler i NOD /SCID-mus

Sorteret 769P SP og NSP-celler blev podet i NOD /SCID-mus til at observere deres evne til at danne tumorer. En mus, der blev inokuleret med 20.000 NSP-celler og 1 med 200.000 NSP-celler døde efter inokulering. Ved 6 uger efter celle inokulation, 2 mus udviklede tumorer med kun 200 SP celler, mens det laveste beløb af NSP celler til at danne tumorer var 20.000 celler (Fig 5A;. Tabel 2). Patologisk undersøgelse bekræftede, at de dannet med SP og NSP celler tumorer viste de samme egenskaber som typiske RCC celler ligesom usorterede 769P celler (fig. 5B).

A og B, injektionssteder af NOD /SCID-mus på 6 uger efter inokulering med frisk sorteret SP eller NSP-celler. Tumorer observeres i alle mus inokuleret med 2.000 SP-celler, men ikke i mus inokuleret med 2.000 NSP-celler. C og D, Patologisk undersøgelse viser typisk renalcellecarcinom hos mus podet med enten 2.000 SP celler eller 200.000 NSP celler.

For at bekræfte den postulerede rolle SP celler i tumor dannelse, en tumor dannet med 200 SP-celler og en tumor dannet med 20.000 NSP-celler blev dissocieret til cellesuspensionen henholdsvis og blev farvet med Hoechst 33342. FCM-analyse viste, at andelen af ​​SP-celler var højere i SP-celle-formet tumor end i NSP celle-formet tumor . (. figur 6), hvilket tyder på in vivo selvfornyelse og NSP-differentiering af SP celler

A, celler adskilt fra tumoren dannet med 200 769P SP celler; B, celler blev dissocieret fra tumoren udformet med 20.000 769P NSP-celler. Andelen af ​​SP celler var højere i SP-celle-formet tumor end i NSP celle-formet tumor (1,5% vs. 0,2%).

For yderligere at bestemme tumordannelse evne andengenerations SP celler, vi inokuleret 5.000 SP-celler (fra 2-tumorer dannet med 20.000 og 2.000 SP-celler, henholdsvis) eller 5.000 NSP-celler (fra 2-tumorer dannet med 200.000 og 20.000 NSP-celler, henholdsvis) i NOD /SCID-mus. Alle mus udviklede tumorer 6 uger efter inokulering. De anden generation NSP tumorer var betydeligt mindre og lettere end den anden generation SP tumorer (

P

0,01;. Figur 7A og B). Alle er andengenerations-tumorer var histologisk identiske med primære xenotransplantattumorer (fig. 7C). Disse resultater indikerede, at SP-celler var i stand til at generere tumorer serielt.

A, NOD /SCID-mus blev inokuleret med 5.000 andengenerations SP-celler fra en tumor dannet med 2.000 SP-celler eller med 5.000 andengenerations NSP-celler fra en tumor dannet med 200.000 NSP-celler. Tumorer blev fjernet fra musene 6 uger efter inokulering. B, anden generation SP tumorer er betydeligt tungere end andengenerations NSP tumorer (**

P

0,01). C, Patologisk undersøgelse viser, at både den anden generation SP tumor og anden generation af NSP tumor er histologisk identisk med primære xenotransplantattumorer.

Diskussion

I de seneste år, forsker på CSCS i solide tumorer har vist bemærkelsesværdige resultater. I denne undersøgelse har vi isoleret SP-celler fra humane clear cell RCC-cellelinier for at bestemme biologiske egenskaber af denne cellepopulation.

Vi fandt, at 4,8% af RCC 769P celler blev SP-celler, som viste evnen hos selv- fornyelse og multi-slægt differentiering. En klon dannelse effektiviteten af ​​SP-celler højere end for NSP-celler blev observeret. Desuden SP celler viste tumordannelse evne mindst 100 gange højere end den for NSP-celler. Tumorer blev dannet i NOD /SCID-mus, som blev podet med kun 200 frisk sorteret SP celler, mens mindst 20.000 NSP celler var forpligtet til at danne tumorer i mus. Disse resultater giver direkte bevis for den høje tumorgenicitet af SP celler.

Selv-fornyelse og multi-slægt differentiering kapacitet er kendetegnende for stamceller. Serial transplantation af celler i dyremodeller, selv om ufuldkommen, kan bidrage til at evaluere stabiliteten af ​​SP-celler i biologiske adfærd. Vores SP omsorterings analyse efter seriel transplantation af SP-celler i mus viste, at andengenerations SP celler afledt af SP-celle xenotransplantattumorer opretholdt evne selvfornyelse og multi-slægt differentiering. Endvidere celler fra både SP og NSP xenotransplantattumorer opretholdt evnen til at danne tumorer i mus, men andengenerations SP tumorer var signifikant tungere end andengenerations NSP tumorer, hvilket antyder, at 769P SP celler er mere tumorigene end NSP-celler.

Cancer stamcelle anses stand til at undergå en asymmetrisk selvfornyende celledeling, opdeling i en stamcelle og en progenitorcelle, som kunne frembringe en række mere differentierede funktionelle celler, der omfatter hele tumor samfundet [35]. I vores undersøgelse, renheden af ​​sorteres 769P SP-celler var 96,61%, og af sorterede NSP-celler var 99,89%. Det er muligt, at få SP celler kan knyttes NSP celler og derfor blevet opsamlet sammen. Efter 10 dages kultur, de sorterede SP celler udviklet sig til et fællesskab, som indeholder 19,51% SP celler og omkring 80% NSP celler, mens de sorterede NSP celler udviklet sig til et fællesskab, der kun indeholder 2,39% SP celler, der kan opstå i nogle snigende-i SP celler under sortering. NSP celler kan danne et par mindre kolonier og også regenererede tumorer selv tumorerne var mindre. Taget resultaterne fra langsigtede differentiering og serielle transplantation eksperimenter sammen, det kraftigt antydet, at SP celler undergår asymmetriske division og er i stand til at differentiere i NSP celler og danner hovedparten af ​​tumor. Kapaciteten for NSP celler til at danne kolonier og tumorer, som var meget svagere end kapacitet SP celler, kan forklares ved den lille andel af snige-in SP celler blandt sorterede NSP celler.

SP fænotype er bestemt af status for ABC transportører ABCB1, ABCC1-5, og ABCG2 [36]. Således er SP-celler sorteres ved måling af den hurtige udstrømning af lipofile fluorescerende farvestoffer af ABC transportører [16]. De fleste tidligere undersøgelser har fokuseret på funktionen af ​​ABCG2, mens nødvendigheden af ​​pumpen funktion af ABCB1 i stamceller ekspansion var under forhandling [37]. I vores undersøgelse ekspressionen af ​​ABCB1 var høj i SP-celler, men lav i NSP-celler som påvist ved både RT-PCR og Western blotting. Interessant nok blev hverken ABCC1 eller ABCG2 udtrykt i SP og NSP-celler, hvilket antyder, at kun ABCB1 bidrager til funktionen af ​​SP fænotype i 769P celler.

Ifølge CSC teori, CSCS i faste tumorer er resistente over for kemoterapi og strålebehandling, og bosiddende CSCS der overlevede behandling kan reformere tumorer [38]. Vi har udført kemosensitivitet og radiosensitivitet assays for at sammenligne følsomheden af ​​SP og NSP-celler på konventionelle behandlinger. Vi fandt, at SP-celler var mere resistente over for stråling end NSP-celler. Desuden SP-celler var mere resistente over for MIX og 5-FU end NSP-celler, hvilket viser, at SP-celler er bredt resistente over for konventionelle kemoterapeutiske lægemidler. Imidlertid kunne denne resistens vendes ved forbehandling med verapamil, en ABC transporter-hæmmer, hvilket tyder på, at ABC transportører kan være ansvarlige for resistens [36], [37], [39].

Det kan konkluderes, vores undersøgelsen viste, at SP celler isoleret fra RCC 769P cellelinje besidder stamceller egenskaber gennem både

in vitro

og

in vivo

eksperimenter. Disse SP celler er kendetegnet ved en stærk spredning potentiale, selvfornyelse, differentiering, modstandsdygtighed over for kemoterapi og strålebehandling, og

in vivo

tumordannelse evne. ABCB1 har vist sig at bidrage til funktionen af ​​SP-celler. Forhåbentlig vil udvikle en terapi rettet mod denne celle population med til at forbedre prognosen for RCC.

Støtte Information

Figur S1.

SP cellesortering resulterer i human renal celle kræft cellelinjer 786-O, OS-RC-2, SN12C, og SKRC39 hjælp Hoechst 33342. blev kun opdaget nogle få SP celler blandt 786-O og OS-RC-2 celler , og procentdelen af ​​SP-celler faldt, når cellerne blev præinkuberet med verapamil i ca. 30 min. Ingen SP celler blev opdaget blandt SN12C og SKRC39 celler

doi:. 10,1371 /journal.pone.0068293.s001

(TIF)