PLoS ONE: androgendeprivation-induceret Ældning Fremmer udvækst af Androgen prostatacancer celler

Abstrakt

Androgen afsavn (AD) er en effektiv metode til at begynde at undertrykke prostatakræft (PC) progression. Imidlertid androgen-refraktære PC celler uundgåeligt komme ud af androgen-responsive tumor, hvilket fører til uhelbredelig sygdom. Nylige undersøgelser har vist AD inducerer cellulær aldring, et fænomen, der er celle-autonomt tumor-undertrykkende, men som giver tumorfremmende tilpasninger, der kan lette fremkomsten af ​​senescens-resistente maligne cellepopulationer. Fordi androgen-refraktær PC celler dukke klonalt fra den oprindeligt androgen-responsive tumor, søgte vi at undersøge, om AD-induceret aldring (ADIS) påvirker køb af androgen-refraktær adfærd i androgen-responsive LNCaP og LAPC4 prostata kræftceller. Vi finder, at gentagen eksponering af disse androgen-responsive celler til senescens-fremkaldende stimuli via cyklisk AD fører til den hurtige fremkomst af ADIS-resistente, androgen-refraktære celler fra størstedelen senescentcelle befolkning. Vores resultater viser, at ADIS fænotypen er associeret med tumorfremmende egenskaber, navnlig kemoresistens og forbedrede pro-overlevelse mekanismer såsom inhibering af p53-medieret celledød, der tilskynder persistens af senescentceller. Vi yderligere konstatere, at farmakologisk håndhævelse af p53 /Bax aktivering via Nutlin-3 før etableringen af ​​ADIS er forpligtet til at overvinde den tilhørende pro-overlevelse respons og fortrinsvis udløse omsiggribende celledød i stedet for ældning under AD. Således vores undersøgelse viser, at ADIS fremmer udvækst af androgen-refraktær PC celler og er derfor en suboptimal tumor-suppressor respons på AD

Henvisning:. Burton DGA, Giribaldi MG, Munoz A, Halvorsen K, Patel A, Jordá M, et al. (2013) androgendeprivation-induceret Ældning Fremmer udvækst af Androgen prostatacancer Cells. PLoS ONE 8 (6): e68003. doi: 10,1371 /journal.pone.0068003

Redaktør: Irina U. Agoulnik, Florida International University, USA

Modtaget: November 8, 2012; Accepteret: 28. maj 2013; Udgivet: 28 juni 2013

Copyright: © 2013 Burton et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af en Florida Biomed Bankhead Coley New Investigator Award, en University of Miami /Sylvester Comprehensive Cancer center Pap Corps Developmental Cancer Research Grant og en University of Miami /Stanley Glaser Foundation award (til PR). MGG blev delvist støttet af en Sylvester Comprehensive Cancer Center Summer Undergraduate Research Award. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PC) er en af ​​de mest almindelige maligne sygdomme hos mænd og en førende årsag til kræft-relaterede dødsfald. For fremskreden sygdom, androgen deprivation terapi er den vigtigste behandling regimen grundet den kritiske afhængighed af prostatavæv på androgener for proliferation og overlevelse [1]. Men den endelige fremkomsten af ​​androgen-refraktære tumorer, som ikke længere reagerer positivt på androgen tilbagetrækning reducerer patientens forventede levetid til mindre end to år, fordi disse tumorer er dårligt lydhøre over for yderligere behandlinger [2], [3]. De molekylære mekanismer, som giver anledning til disse androgen-refraktære tumorer er ikke godt forstået. Væsentlig forskning har fokuseret på androgen receptor (AR) signalering og implicerer AR-relaterede aberrationer herunder genamplifikation, ligand-uafhængig eller promiskuøse ligand-aktivering og ændret co-regulator udtryk [2], [4] – [7]. Ikke-AR veje menes at være involveret i androgen-refraktær proliferation indbefatter bypass af AR-baserede proliferation styring via onkogen aktivering eller tumor-suppressor nedregulering, ændret kromatin regulering af gentranskription, afbrydelse af cellecykluskontrol maskiner og forhøjet ekspression af steroidogene enzymer [8 ] – [14]

Men mange undersøgelser der undersøger disse mekanismer undersøge dem i forbindelse med fremskreden prostatacancer modeller, og ikke de tidligste forandringer er nødvendige for unddragelse af AD-induceret tumor undertrykkelse.. Det er et vigtigt problem, fordi, trods de høje indledende tumor-inhiberende virkning [15], AD ikke dræber alle androgen-responsive prostata cancerceller men snarere inducerer en proliferativ standsning i en signifikant subpopulation [16]. I betragtning af at androgen-refraktære cellepopulationer er kendetegnet ved erhvervelse eller forbedring af stress-beskyttende pro-tumorigene veje [8], [10], [17], egenskaberne af disse spredningsfølsomme anholdt celler vil sandsynligvis være vigtigt at forstå, hvordan androgen-refraktære subpopulationer opstår. Faktisk er det sandsynligt, at en delmængde af disse arresterede celler forlade proliferativ stasis og blive ikke-responsiv til AD. Til støtte for denne idé, er det blevet rapporteret, at prostata tumorer består af heterogene celle blandinger i form af androgen respons [18], og at der i høj androgen-refraktære celler som en udvalgt variant population fra forældrenes androgen-responsive celler [18], [19]. Endvidere i overensstemmelse med den kliniske fænotype, forlænget ( 6 måneder)

in vitro

androgen-ablaterede kultur af androgen-responsiv prostatacancer-cellelinier fører til den endelige udvækst af androgenfjernelse-resistente kloner fra den oprindeligt vækst -arrested befolkning [8], [20]. Derfor belyse de molekylære mekanismer, der ligger bag AD-induceret vækststandsning er kritisk for definitionen ætiologien af ​​androgen-refraktære PC.

De molekylære karakteristika af AD-induceret vækststandsning omfatter en G1 /S-blok, reduceret cyclin-afhængig kinase aktivitet, hypophosphoryleret Rb, og ophævelsen af ​​den standset fænotype via indførelsen af ​​oncoproteinet, SV40 stort T-antigen [21]. Disse træk er i overensstemmelse med AD-inducerede anholdelse er en form for cellulær aldring [22], og to nylige undersøgelser har rapporteret, at androgen-berøvet celler udvikler molekylære markører i overensstemmelse med ældning [23], [24]. Modeller af onkogen-drevne tumorigenese har vist, at onkogen-induceret aldring fører til selektive pres, der fremmer udvækst af senescens-resistente aggressive tumor cellesubpopulationer [25] – [27]. Men denne tumorfremmende aspekt af senescens har ikke, så vidt vi ved, er tidligere blevet udforsket for hormon tilbagetrækning-associeret senescens. Vi har designet derfor vores undersøgelse for at afgøre, om en lignende paradigme, nemlig unddragelse af AD-induceret aldring (ADIS), opererer i frembringelsen af ​​androgen-refraktær prostatacancer celler fra forældrenes androgen-responsive befolkning. Følgelig i denne undersøgelse, vi udnyttet LNCaP og LAPC4 PC cellelinier, der vides at besidde de store vigtigste træk ved androgen-responsive prostatatumorceller herunder robust androgenreceptor og prostataspecifikt antigen ekspression, forbedret proliferation som reaktion på androgener og proliferativ ophør ved androgenfjernelse, og manglende evne til at danne tumorer i kastrerede mus. Dyrkede vi disse celler i kul-strippet serum (CSS) -holdige medier at rekapitulere AD i kultur. Vores mål var at karakterisere de molekylære veje er forbundet med ADIS og at afgøre, om vi kunne isolere senescens-resistente varianter i stand til at formere sig under AD.

Vores resultater viser, at ADIS fører til erhvervelse af tumorfremmende egenskaber såsom forbedret pro-overlevelse mekanismer og kemoresistens. Betydeligt, vedvarende tilstedeværelse af senescens-inducerende stimuli via cyklisk AD letter udvidelse af ADIS-resistent androgen-refraktære LNCaP og LAPC4 varianter inden for en periode på uger. Disse varianter er delvist præget med senescens-associerede pro-overlevelse funktioner trods ADIS-resistente. Således er vores fund kollektivt støtte en rolle for alderdomssvækkede fænotype i optrapper ændringer, der fremmer fremkomsten af ​​androgen-refraktær tumorceller.

Materialer og metoder

Etik Statement

Al forskning med mennesket som forsøgsperson er blevet godkendt af University of Miami Institutional Review Board. Det IRB godkendte afkald på samtykke til denne protokol.

Cell Kultur

LNCaP og LAPC4 celler (ATCC) blev dyrket i RPMI-1640-medium (Gibco, Invitrogen) suppleret med 5% føtalt bovint serum (FBS; Gibco, Invitrogen) eller 5% trækul-strippet føtalt bovint serum (CSS, Gibco, Invitrogen) og 100 enheder /ml penicillin /streptomycin (Gibco, Invitrogen) ved 37 ° C i 21% oxygen /5% CO

2. For hvilende kulturer, celler dyrket som ovenfor, men i mangel af serum.

Switchback (SB) metode til at generere Androgen-refraktær ADIS-resistente LNCaP Varianter

LNCaP-celler blev podet ind i enten 10 cm skåle (3 × 10

5 celler) eller 15 cm skåle (1 × 10

6 celler) i RPMI 5% FBS i 36-48 timer, før de skiftede til RPMI 5% CSS. Medier blev udskiftet hver 3-4 dag i 14 dage, for at inducere ADIS, efter hvilken kulturerne blev gendannet til RPMI 5% FBS medier. Efter udvækst af synlige celle kolonier, blev cellerne trypsiniseret og udvidet til en eller to passager, før proceduren blev gentaget.

Oprettelse og Stabil transduktion af shRNA og fluorescerende protein-udtrykkende Konstruktioner

retroviral pWZL -blast GFP konstruktion var en gave fra Dr. Robert Weinberg laboratorium. De shRNA vektorer blev frembragt som tidligere beskrevet [28], [29]. Valideret eller stærkt nu kandidatsekvenser fra TRC Broad Consortium shRNA bibliotek (https://www.broadinstitute.org/genome_bio/trc/publicSearchForHairpinsForm.php) blev udvalgt og subklones ind i lentivirale pLKO.1 vektor med en puromycin modstand kassette. Oligonukleotider blev indkøbt fra Integrated DNA Technologies, blev Inc. Konstruktioner sekventeret for at sikre tilstedeværelsen af ​​insertet. Kontrol shRNA blev rettet mod GFP: 5′-GCAAGCTGACCCTGAAGTTCA-3 ‘. Følgende målsekvenser blev anvendt:

shp53: 5’GACTCCAGTGGTAATCTACTT 3 ‘,

shp16: 5’GCATGGAGCCTTCGGCTGACT 3′

Shar konstruere [30] var en gave fra Dr. Kerry Burnstein ved University of Miami og blev rettet mod følgende sekvens:. 5’GAAAGCACTGCTACTCTTCAGCATTATTC 3 ‘

Lentiviral eller retroviral produktion blev udført i HEK 293T-celler og infektion af target-celler blev udført som tidligere beskrevet [29]. Transducerede celler blev selekteret i 2 ug /ml puromycin-holdige eller 10 ug /ml blastocidin-holdige medier (for SB5 GFP-celler) i en periode på 5-7 dage (svarende til den tid, utransducerede celler minimum for at dø fuldstændigt i udvælgelsen medier). For shRNAs, blev protein knockdown verificeres via Western blotting. GFP-ekspression i de SB5 cellerne blev verificeret ved epifluorescerende billeddannelse og flowcytometrianalyse.

Western Blotting og Anvendte antistoffer

Celler blev høstet ved mekanisk skrabning på is og blev lyseret i en natriumfluorid (NAF ) puffer indeholdende natriumvanadat, PMSF, DTT og proteinase inhibitor. Proteinkoncentrationer blev målt under anvendelse af Bradford-reagens (Biorad). 30-50 ug totalt protein blev kørt på en 4-12% Bis-Tris pre-cast NuPage gel (Invitrogen) på Novex præfabrikerede gel-system og efterfølgende overført til en sektion af PVDF-membran (Immobilon, Millipore EMD) ved 30 V ved 4 ° C. Blots blev farvet i Ponceau reagens til bestemmelse selv lastning og overførsel, vasket i 0,1% TBST og derefter probet med antistoffer mod følgende proteiner: AR (sc-816, Santa Cruz Biotech), p53 (sc-126, Santa Cruz Biotech), p21 (sc-817, Santa Cruz Biotech) p16

INK4 (554.079, BD Biosciences), cyklin A (sc-751, Santa Cruz Biotech), GAPDH (AB9485, Abcam) Bcl-2 (sc-492, Santa Cruz Biotech), Bax (sc-493, Santa Cruz Biotech) Mcl-1 (sc-819, Santa Cruz Biotech), Bak (06-536, Millipore), phospho-Akt (4060, Cell Signaling) total Akt (9272, Cell signalering) spaltet-PARP (9541, Cell Signaling), survivin (71G4B7, Cell Signaling), TAp63 (618.902, BioLegend), p27 (sc-528, Santa Cruz Biotech), deltaNp63 (619.002, BioLegend). Efter inkubering med de passende sekundær peberrodsperoxidasekonjugeret antistoffer (Amersham), blev blots fremkaldt under anvendelse af ECL Plus (GE Healthcare) fremkalderopløsning. Efter immunblotting blev membraner farvet med Coomassie blåt farvestof (Sigma) for at normalisere for totalt protein lastning.

Cell Cycle Analysis

Ca. 1 x 10

6 celler blev høstet via trypsinbehandling. Celler blev vasket en gang i koldt serumholdigt medium, to gange i kold PBS og derefter resuspenderet i 200 pi PBS +2 mM EDTA. Ca. 600 pi kold 70% ethanol blev tilsat dråbevis til celler, mens vortexing dem ved middel hastighed. Celler blev holdt ved 4 ° C natten over til fiksering. Før analyse blev celler centrifugeret ned ved 4 ° C ved 1000 rpm i 5 minutter, og ethanolen omhyggeligt aspireret. De resulterende cellepellets blev resuspenderet i 0,5 ml PBS + 2 mM EDTA og 10 pi varmeinaktiveret RNase A (10 mg /ml, Sigma). Derefter 25 pi propidiumiodid (PI) (1 mg /ml, Sigma) blev tilsat til cellesuspensionen. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i et vandbad i 30 minutter og straks analyseret på en Accuri C6 flowcytometer (BD) ved anvendelse af PI excitation laser (FL2). Procentdelen af ​​celler i hver fase af cellecyklussen blev fastsat på CFlow Plus cytometeret software, CFlow Analyse 202,1, ved at måle arealet under det pågældende segment af profilen (som vist). Profiler blev relabeled i MS Excel til klarhed.

celledeling Målinger

For at bestemme celledeling satser LNCaP celler i både FBS og CSS holdige medier, 1 × 10

5 blev podet i 6 cm plader og celletal, der bruger et hæmocytometer, blev udført for hver 24 timer, i tre eksemplarer i løbet af en periode på seks dage ved hjælp af et hæmocytometer. Frisk medium blev tilsat hver 2-3 dage. For MOB eksperimenter i fig. 1D, celler blev podet i FBS medier i 24 timer, før der skiftes til CSS medier. Celler blev skiftet tilbage til FBS medier ved de angivne tidspunkter.

(A) Ældning associeret beta-galactosidase (SA-beta-gal) farvning under angivne betingelser og tidspunkter. FBS, føtal bovinserum indikerer androgen-fyldt kultur; CSS, kul-strippet serum indikerer androgen- berøvet kultur. 9D FBS post-SEN betegne LNCaP celler, der blev udsat for 14 dage CSS kultur og derefter skiftede til FBS medier i 9 dage. Kvantificering af positivt farvede celler præsenteres til højre for de repræsentative billeder. (B) Ki67 pan-spredning markør farvning er vist ved angivne betingelser og tidspunkter. DAPI farvning bruges til at markere cellekerner med henblik på optælling Ki67-positive celler. Procentdelen af ​​farvede celler tegnes til højre. (C) Propidiumiodid cellecyklusanalyse, ved angivne tidspunkter og dyrkningsbetingelser. Bemærk S-fasen fraktionen falder fra 15,6% i FBS til 0,4% ved 10d CSS og til 0,8% efter restaurering til FBS medier i 9 dage (9D FBS post-SEN). (D) Proliferation kurven for LNCaP celler dyrket i CSS for 3, 8 eller 14 dage, før de skiftede tilbage til FBS medier. (E) Måling af den samlede ROS-niveauer via flowcytometri i LNCaP-celler på dag 1, dag 4 og dag 7 af angivne dyrkningsbetingelser. Bemærk den højre forskudt top i rød svarende til stigende ROS-niveauer i CSS-dyrkede LNCaP-celler i forhold til FBS-dyrkede celler. (F) DNA dobbelt-strenget pause (DSB) foci opdaget via H2AX /53BP1 co-farvning (grøn = H2AX, rød = 53BP1) for LNCaP celler dyrket under de angivne betingelser. Repræsentative billeder af celler med de forskellige antal af optalte foci er vist. Bemærk, at procentdelen af ​​celler med 5+ foci stiger med varigheden af ​​CSS kultur.

Cell Co-kultur Eksperimenter og Analyse

For co-kultur eksperimenter, 1 × 10

5 LNCaP-SB5-GFP-celler (genereret fra SB0 LNCaP-celler stabilt transduceret med pWZL-blast GFP) blev udpladet i fire eksemplarer i en 10 cm skål, enten alene eller co-blandet med 1 x 10

5 umærket LNCaP SB0, SB5 eller LNAI celler. Celler blev indledningsvis udpladet i 5% FBS komplet medium (dag 0) og på dag 1, blev co-kulturer skiftet til 5% CSS medier og opretholdt i 7 dage, med en CSS mediumændring hver tredje dag. Repræsentative kulturer blev analyseret dobbelt ved flowcytometri på en Accuri C6 cytometer på dag 1 for at sikre relativt ækvivalente antal grønne og ikke-grønne celler blev overlevende i kultur. Brug af SB5-GFP-celler udpladet alene, blev gating gjort på FITC-kanalen for at adskille GFP-celler fra ikke-GFP-celler. Celler blev yderligere gated at udelukke lave FSC /SSC partikler til kun at sikre levende cellepopulationer analyseres. På dag 7, flowcytometri blev anvendt til bestemmelse af de relative procentdele af GFP-positive versus umærkede cellepopulationer såvel som det totale antal af GFP-positive (SB5) celler. Histogrammer og dot plots blev afsat ved hjælp af BD Accuri C6 Analyse software til Mac OSX. Alle målinger blev udført i to eksemplarer på mindst to uafhængige forsøg.

Ældning-associeret beta-galactosidase-aktivitet (SA-beta-gal)

SA-beta-gal-farvning blev udført som beskrevet andetsteds [31]. Kort fortalt blev cellerne vasket i PBS, fikseret i 0,2% glutaraldehyd i 5 minutter ved stuetemperatur, vasket en gang i PBS og inkuberet natten over i frisk gjort farvningsopløsning (1 mg /ml 5-brom-4-chlor-3-indolyl- β-galactosid (Sigma), 150 mM NaCl, 2 mM MgC

2, 5 mM K

3fe (CN)

6, 5 mM K

4Fe (CN)

6, 40 mM NaPi, pH 6,0). Den følgende dag blev celler inkuberet i yderligere en time ved 37 ° C for at intensivere farvning og derefter vasket og opbevaret i PBS ved 4 ° C. Til kvantificering positiv farvning, 100 celler blev talt for hver prøve i flere synsfelter for at opnå en standardafvigelse. Eksperimenter blev udført i mindst to eksemplarer, i to uafhængige forsøg.

Ki67 Farvning

Til påvisning af Ki67 farvning blev celler udpladet ved 2 × 10

4 celler pr kammer og venstre til 36-48 timer før enten skifte til CSS, bicalutamid behandling eller fiksering af FBS kun prøver. Celler blev fikseret i 4% paraformaldehyd (16% lager, elektronmikroskopi videnskaber) i 10 minutter ved stuetemperatur, efterfulgt af permeabilisering i 0,1% PBST (10 minutter ved stuetemperatur), og blokeret i 1 time i 0,1% Triton X, 15% FBS , i PBS ved stuetemperatur. Ki67-antistof (Santa Cruz) blev fortyndet 1:50 i blokerende puffer og inkuberet ved 4 ° C natten over. Celler blev vasket 5X, 10 minutter hver gang ved stuetemperatur i blokeringsopløsning på en ryster. Den passende fluorofor-konjugeret sekundært antistof (gede-anti-muse-FITC, Santa Cruz) blev tilsat i en 1:100 fortynding i blokeringspuffer og inkuberet i 1 time ved stuetemperatur i mørke. Celler blev vasket 5X i 0,1 Triton, 10 minutter hver gang på rysteapparat ved stuetemperatur i mørke. DAPI montering medier (Vectashield) tilsat inden montering dækglas. Immunfluorescerende billeder blev erhvervet på et Nikon kamera fastgjort til en opretstående Zeiss mikroskop.

H2AX /53BP1 Farvning

H2AX /53BP1 farvning blev udført som beskrevet andetsteds [28]. Kort fortalt blev 20.000 celler udsået pr kammer (BD Falcon, 4-chamber culture slides) i RPMI 5% FBS og skiftede til RPMI 5% CSS 24 timer senere. H2AX /53BP1 farvning blev udført på de angivne tidspunkter. Celler blev fotograferet under identiske erhvervelse betingelser på en Leica DMI 6000 B inverteret digital mikroskop med en vedhæftet DFC350 FX kamera og FW4000 I fluorescens-software. Kun co-lokaliserede H2AX /53BP1 foci blev talt som positive og mindst 100 celler blev scoret over flere felter.

Drug Behandling af LNCaP Celler

LNCaP celler blev dyrket i passende medier (5 % FBS eller CSS) indeholdende docetaxel (1 nM), flavopiridol (0,5 uM), eller bortezomib (1 uM) i 72 timer, og flydende og trypsinerede vedhæftede celler blev samlet og analyseret ved Trypan blåfarvning. LNCaP-SB0 og LNCaP-SB5 celler blev dyrket i medier (RPMI + 5% FBS) indeholdende docetaxel (1 nM) i 72 timer og analyseret ved Trypan blåfarvning. Mindst 3 uafhængige forsøg blev udført i to eksemplarer og statistiske forskelle mellem lægemiddelbehandlede celler blev bestemt ved to-tailed Students

t

-test med p. 0,05 betragtet som signifikant

Reverse-transkriptase PCR

Totalt RNA blev isoleret fra LNCaP-celler dyrket i FBS og CSS medier i 14 dage, ved anvendelse af RNAqueous-4PCR Kit (Ambion). I alt 1 ug oprenset RNA blev revers-transkriberet under anvendelse af en vilkårlig primer, inkluderet i sættet til opnåelse af cDNA via højkapacitets cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). CDNA’et blev anvendt som en skabelon til PCR-amplifikation under anvendelse af AmpliTaq Gold® 360 Master Mix (Applied Biosystems) og primerne var som følger

GAPDH forward primer:.

5’GACCCCTTCATTGACCTCAAC 3 ‘

GAPDH revers primer:

5 ‘CTTCTCCATGGTGGTGAAGA 3’

IL8 fremad primer:

5 ‘TTTTGCCAAGGAGTGCTAAAGA 3’

IL8 revers primer :

5 ‘AACCCTCTGCACCCAGTTTTC 3’

reaktionsprodukterne blev kørt på 1,5% agarosegel med ethidiumbromid. GAPDH blev anvendt som en intern normalisering kontrol.

Måling af celledød

Behandlede og kontrolceller blev høstet, resuspenderet i PBS og fortyndet 1:01 i 0,4% Trypan blue (Invitrogen). DEAD (blå) og levende ikke-farvede celler straks talt ved anvendelse af et hæmacytometer. Procentdelen af ​​døde celler blev bestemt ud fra mindst tre uafhængige forsøg udført in duplo.

Måling af Cellular ROS Niveauer

Assayet blev udført som tidligere beskrevet [28]. Kort fortalt blev de angivne celler ved ækvivalente konfluens indsamlet via trypsination, vasket i iskold 1X Hanks bufferet saltopløsning (HBSS) og inkuberet med frisk fremstillet 5- (and-6) -chlormethyl-2 ‘, 7’-dichlorofluorescein diacetat ( CM-DCF-DA Molecular Probes /Invitrogen, C6827) i 20 minutter ved 37 ° C. Cellerne blev derefter vasket og resuspenderet i 1X HBSS før detektion af FITC signal gennem fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). Flowcytometrisk analyse blev udført på en Accuri C6 cytometer (BD Biosciences). X-aksen repræsenterer FITC kanal (FL1) fluorescensintensitet i log-skala, og Y-aksen repræsenterer antallet af celler. Eksperimenter blev udført i mindst to eksemplarer, med repræsentative profiler bliver vist.

Crystal Violet Farvning

Ca. 3 × 10

5 celler blev podet i 10 cm skåle indeholdende RPMI plus 5% FBS i 36-48 timer før du skifter til RPMI plus 5% CSS. Medier var opdateres hver 3-4 dage. For krystalviolet farvning, blev mediet aspireret og celler vasket én gang i 1 x PBS, blev 1% krystalviolet opløsning tilsat til hver skål og efterladt til farvning i 2 minutter ved stuetemperatur. Pletten blev fjernet, og hver skål skyllet to gange i deioniseret vand. Retter blev derefter nedsænket i vand i 20-30 minutter for at udvaske overskydende pletten og reducere baggrunden, og venstre lufttørre natten over før tælling kolonier eller tager billeder. Forsøg blev udført in duplo

Statistical Analysis

Statistisk signifikans af resultaterne blev bestemt ved at beregne standardafvigelsen fra middelværdien, og ved en to-halet t-test, med p. 0,05 betragtes signifikant.

Resultater og konklusioner

Karakteristik af ADIS i LNCaP og LAPC4 Celler

for at bekræfte, om den observerede proliferative anholdelse på AD skyldes induktion af cellulære ældning vi udnyttede den godt karakteriseret androgen-følsomme LNCaP da det besidder funktionelle versioner af både større senescens-medierende veje, p53 og p16

INK4a [32], [33]. Desuden kongruent med kliniske modeller for prostatakræft, LNCaP celler viser spontane udvækster af androgen-refraktære varianter følgende langsigtede kultur i androgen-udtømte medier [20], [34]. Derfor dyrkede vi LNCaP-celler i CSS-holdige medier (herefter benævnt CSS kultur) at efterligne AD og vurderet fremkomsten af ​​cellulære senescens markører.

Vi fandt, at der ud over den forventede proliferative arrest (fig. S1A ) og erhvervelse af en neuroendokrine morfologi [35] (fig. 1A), CSS-dyrkede LNCaP celler udviklede også andre distinkte markører for cellulær ældning (fig. 1) [36]. Disse omfattede øget senescens-associeret beta-galactosidase (SA-beta-gal) aktivitet (fig. 1A), nedsat farvning for den pan-spredning markør, Ki67 (fig. 1 B) og en G1 /S cyklus celle arrest (Fig. 1C ). Efter 7 dage i CSS kultur 50% celler udviste disse egenskaber og efter 10 dage i CSS, at fraktion steg til 80% af bulk population (figur 1A-B.). Behandling med anti-androgen, bicalutamid, inducerede også proliferativ ophør og fremkomsten af ​​en aldrende fænotype som bestemt ved SA-beta-gal-farvning og en G1 /S tilbageholdelse (fig. S1). Derimod blev minimal celledød observeret efter CSS eller bicalutamid behandling som bedømt ved visuel mangel af afrundede, ubundne celler og spaltes PARP ekspression (data ikke vist). Væsentligt, når cellerne blev gendannet til androgen-fyldt føtalt bovint serum (FBS) medier efter 14 dage CSS kultur, bulkpopulation bevaret ældede markører (vist i tilfælde af restaureringen at Replete FBS kultur i 9 dage, benævnt 9D FBS stolpe -sen), hvilket indikerer, at proliferationsstandsning er permanent snarere end forbigående art (fig. 1A-C).

for yderligere at skelne CSS kultur proliferation anholdelse fra den midlertidige fænomenet celle hvile, vi dyrket LNCaP-celler i serumfrie medier, der vides at inducere hviletilstand [37], 7 dage i parallel med celler dyrket i CSS medier. Derefter vi skiftede begge sæt celler tilbage til FBS medier i 4 dage. Henviser til LNCaP-celler udsat for serumfrit kulturmedium genoptaget proliferation ved restaurering til fuld medier, svarende til en stigning i proliferationen markering, cyclin A har de CSS-dyrkede celler ikke gøre det (fig. S2). Som LNCaP celler undergår ikke yderligere populationsfordoblinger engang placeret under androgen-berøvet kultur (fig. S1A), men tage op til 4 dage for at vise betydelig erhvervelse af ældning markører (fig. 1A, B), vi ønskede at afgøre, om dette proliferationsstandsning var reversibel inden 4 dage af androgen depletering. For at gøre dette, blev LNCaP celler skiftet tilbage til androgen-propfuld medier på 3, 8 eller 14 dage efter CSS kultur (fig. 1D). Vi fandt, at celler skiftes tilbage til FBS medier på dag 3 var let stand til at genoptage proliferation. Til sammenligning celler skiftet til Replete medier på dag 8 ikke genoptog fuld proliferation men en undergruppe af disse celler var i stand til fortsat at dividere, hvilket antyder en delvis irreversibelt standset cellepopulation. I overensstemmelse med vores resultater i fig. 1A-B, blev der ikke observeret spredning, når cellerne blev skiftet tilbage til fuld medier efter 14 dage i CSS kultur (fig. 1D). Således kollektivt, vores resultater kontrollere, at AD inducerer de vigtigste funktioner i cellulære senescens i LNCaP celler.

ADIS fænotype vi observerer i LNCaP celler Forud progressivt stigende totale cellulære ROS niveauer observeret allerede som én dag efter at have skiftet celler til CSS medier (fig. 1E), såvel som ved fremkomst af gradvis større antal co-lokaliserede gamma-H2AX og 53BP1 foci (fig. 1F). Disse foci indikerer et monterings DNA beskadigelse respons (DDR), formentlig som reaktion på vedvarende udbedrede DNA-beskadigelse [28], [38]. Den ADIS-associerede elevation i ROS niveauer og DNA skader foci er i overensstemmelse med den kendte ætiologi cellulær aldring [36], hvilket yderligere styrker at AD genererer opstrøms belastninger er kendt for at udløse cellulær ældning.

ADIS medieres af p16

INK4a Pathway og associerede med bekæmpelse af p53 Pathway

To store tumor suppressor veje, p53 /p21

Cip1 /WAF1 og p16

INK4a, typisk mægle aldring [39], [ ,,,0],40]. Afhængigt af celletypen eller stressor, er den aldrende fænotype associeret med aktivering af en eller begge disse veje [39], [41]. Men selv om begge veje er aktiveret, kan man dominerer at håndhæve aldrende fænotype [28], [40]. Derfor analyseres vi LNCaP celler ved stigende varigheder af CSS kultur ved sondering totale protein lysater fra disse prøver til niveauer af senescens-medierende proteiner, p16

INK4a og p53 /p21

Cip1 /WAF1. Som forventet, AR ekspression faldt med stigende varighed CSS kultur (fig. 2A). Selv

a priori

, eksistensen af ​​en vedvarende DDR (fig. 1F) førte os til at forvente, at p53 /p21 pathway ville blive inddraget, vi fandt i stedet, at ADIS var forbundet med øget ekspression af p16

INK4a (fig. 2A). Overraskende niveauer af p53 og dets effektor cellecyklus-regulatorisk protein, p21

Cip1 /WAF1, faldt med stigende varighed CSS kultur (fig. 2A). Endvidere tilsætning af 10 nM dihydrotestosteron (DHT) til CSS medier var i stand til at forhindre både den observerede nedgang i AR og cyclin A-niveauer og ADIS-associerede ændringer i p16

INK4a og p53-ekspression (fig. S3A). Dette fund bekræfter disse molekylære ændringer sker specifikt på grund af fraværet af androgen i dyrkningsmedierne.

(A) Immunoblotting blev udført på ca. 35 ug af de indikerede proteinprøver med antistoffer mod de betegnet proteiner. Coomassie blue-farvning blev anvendt til at normalisere for totalt protein loading. Bemærk, at AR-ekspression mindskes som forventet ved CSS kultur. Tendensen af ​​p53, p21 og p16-proteinekspression opretholdes efter genoprettelse af androgen-fyldt kultur post-senescens (post-SEN) angiver bestandighed af ændringerne. (B) immunblotting at vise virkningerne af shRNA-medieret knockdown af p16 på ADIS. Bemærk forhøjede AR og cyclin A niveauer i shp16 celler under CSS kultur i forhold til at styre eller shp53 knockdown celler. (C) Effekt af p16 undertrykkelse på SA-beta-gal farvning. De angivne celler blev dyrket i CSS i 14 dage og derefter om FBS- holdige medier i yderligere 9 dage. Bemærk den observerede nedgang i SA-beta-gal-farvning i shp16 celler. * P. 0,05

Betydeligt, p16

INK4a ekspressionsniveauerne fortsat højt og p53 /p21 forblev lav i bulk befolkningen selv efter androgen-propfuld kultur blev restaureret (figur 2A.). Denne observation understøtter permanens af ældning-associerede molekylære kredsløb aktiveres ved androgen-berøvet kultur trods den delvise genopretning af AR-ekspressionsniveauer (Fig. 2A). Forhøjede p16

INK4a niveauer sammen med forhøjet SA-beta-gal-farvning, reduceret proliferation og nedsat AR og cyclin A ekspression blev også observeret efter CSS kultur af androgen-responsive men p53-mutant [32] LAPC4 cellelinie (fig. S4A-D). 5A.