PLoS ONE: PDX-1 er en terapeutisk Mål for kræft i bugspytkirtlen, Insulinom og Islet Neoplasi Ved hjælp af en Novel RNA Interference Platform

Abstrakt

bugspytkirtlen og tolvfingertarmen homeobox-1 (PDX-1) er en transskription faktor, regulerer insulin ekspression og holm vedligeholdelse i den voksne pancreas. Vores seneste undersøgelser viser, at PDX-1 er et onkogen for kræft i bugspytkirtlen og er overudtrykt i kræft i bugspytkirtlen. Formålet med denne undersøgelse var at demonstrere, at PDX-1 er et terapeutisk mål for både hormonelle symptomer og tumorvolumen i musemodeller for pancreascancer, insulinoma og ø-neoplasi. Immunhistokemi af humane pancreas og holmen neoplasi prøver afslørede markeret PDX-1 overekspression, hvilket tyder på PDX-1 som en “drugable” target inden for disse sygdomme. For at gøre dette, en roman RNA-interferens effektor platform, bifunktionel shRNA

PDX-1, blev udviklet og undersøgt i mus og humane cellelinjer samt i musemodeller af kræft i bugspytkirtlen, insulinoma og ø-neoplasi. Systemisk levering af bi-shRNA

humanPDX-1 lipoplekser resulterede i markant reduktion af tumorvolumen og forbedret overlevelse i en human bugspytkirtelkræft xenotransplantat musemodel. bi-shRNA

mousePDX-1 lipoplekser forhindrede død af hyperinsulinæmi og hypoglykæmi i et insulinom musemodel. shRNA

mousePDX-1 lipoplekser tilbageføres hyperinsulinæmi og hypoglykæmi hos et immun-kompetent musemodel af ø neoplasi. PDX-1 blev overudtrykt i bugspytkirtlen neuroendokrine tumorer og nesidioblastosis. Disse data viser, at PDX-1 RNAi terapi styrer hormonelle symptomer og tumorvolumen i musemodeller for pancreascancer, insulinoma og islet neoplasi derfor PDX-1 er et potentielt terapeutisk mål for disse pancreassygdomme

Henvisning.: liu SH, Rao DD, Nemunaitis J., Senzer N, Zhou G, Dawson D, et al. (2012) PDX-1 er en terapeutisk Mål for kræft i bugspytkirtlen, Insulinom og Islet Neoplasi Ved hjælp af en Novel RNA Interference Platform. PLoS ONE 7 (8): e40452. doi: 10,1371 /journal.pone.0040452

Redaktør: John J. Rossi, Beckman Research Institute of the City of Hope, USA

Modtaget: 15. maj 2012; Accepteret: 7 jun 2012; Udgivet: 8. august, 2012 |

Copyright: © Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud R01-DK46441 fra National Institute of Diabetes og Digestive og nyresygdomme; tilskud R01-CA095731 fra National Cancer Institute; Den Alkek Foundation; Vivian L. Smith Foundation; MD Anderson Foundation; og generøsitet af Bill og Olivia Heintz familie. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. D. Rao, N. Senzer, Z. Wang og N. Templeton er ansat af Gradalis, Inc. følgende forfattere er aktionærer i Gradalis, Inc .: N. Senzer, FC Brunicardi, D. Rao og J. Nemunaitis. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

bugspytkirtlen og tolvfingertarmen homeobox-1 (PDX -1) er en transkriptionsfaktor som spiller en kritisk rolle ved regulering embryologic pancreas udvikling samt i insulinekspression og holm vedligeholdelse i den voksne pancreas [1], [2], [3], [4]. PDX-1 knockout er dødelig hos mus og mutation af PDX-1 fører til modne indtræden af ​​diabetes af den unge (MODY subtype IV) i mus og humane patienter [5], [6]. Vedvarende overekspression af PDX-1 fører til acinære at duktalt celle metaplasi i mus [7]. Overekspression af PDX-1 i cellelinjer resulterer i omdannelse af ikke-insulinproducerende celler til insulinproducerende celler efter GLP-1 stimulus [8], [9], [10], [11], [12], [13 ]. PDX-1 er velkendt som en vigtig regulator af mange pankreatiske endokrine gener, såsom insulin [1], [2], [3], [4], glucokinase [14], ø-amyloidpolypeptid [15], [16], [17], glucose transportør type 2 [GLUT2] [18], [19], pancreaspolypeptid [20] og somatostatin [21], [22], og har derfor en afgørende rolle i at opretholde glukose homøostase.

Vores seneste undersøgelser viser, at PDX-1 er et onkogen [23], [24]. Den er markant overudtrykt i bugspytkirtelkræft [23], [25], [26], [27] og regulerer proliferation og invasion af humane bugspytkirtelkræftceller

in vitro

in vivo

i mus [23]. PDX-1 overekspression i benigne og maligne celler resulterede i øget tumordannelse, når disse celler implanteres i mus [24]. Systemisk levering af shRNA

humanPDX-1 lipoplekser resulterede i en markant reduktion af tumor volumen og forlænget overlevelse i et menneske bugspytkirtelkræft xenograft musemodel [23].

Vores team har udviklet en ny bifunktionelt RNA-interferens platform hvor translation af target mRNA undertrykt via både spaltningsprodukter-uafhængig og spaltning-afhængige RISC lastning veje, hvilket resulterer i differentieret Argonaut inkorporering og separat, men koordineret, målrettet inaktivering mekanismer [28].

i denne undersøgelse, en hidtil ukendt RNAi effektor målretning PDX-1 blev udviklet og undersøgt i humane og murine cellelinjer, såvel som i musemodeller for pancreascancer, insulinoma og ø-neoplasi at bestemme, om PDX-1 er et potentielt terapeutisk mål for styring af både hormonale symptomer og tumor volumen i disse pancreas sygdomme.

Materialer og metoder

Etik Statement

SCID mus blev opstaldet i et BL-4 anlæg og plejes i overensstemmelse med de retningslinjer i

den Pleje og anvendelse af forsøgsdyr

udarbejdet af Institute of Laboratory Animal Resources, Kommissionen om Life Science, National Research Council og det Baylor College of Medicine Animal Research. Protokollen blev godkendt af Udvalget for den etiske af dyreforsøg i Baylor College of Medicine. (Tilladelse nummer: AN 2404)

Der blev modtaget Menneskelige prøver under en menneskelig protokol, der blev godkendt af Institutional Review Board ( IRB) for Baylor College of Medicine (Permit nummer: H 14054); prøver blev behandlet i nøje overensstemmelse med de procedurer, der dikteres af nævnte protokol. Alle humane pancreas neuroendokrine tumorer og nesidioblastosis prøver blev de-identificerede prøver opnået med IRB samtykke (H 14054) og skriftlige godkendelse.

Cellelinjer, vektorer og antistoffer

Mus βTC-6 og humane pancreas cancercellelinie PANC-1 cellelinier blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Bethesda, MD) og tidligere rapporteret [29]. Humane pancreas neuroendokrine tumor prøver og menneskelige nesidioblastosis prøver blev venligst stillet til rådighed af Dr. David Dawson af Patologisk Institut ved UCLA og Dr. Milton Finegold af Patologisk Institut ved Texas Børnehospital, hhv. Mus PDX-1 shRNA (shRNA

mousePDX-1) er designet som tidligere beskrevet [23]. Bi-funktionelle mus (bi-shRNA

mousePDX-1) og human PDX-1 (bi-shRNA

humanPDX-1) blev opnået fra Gradalis Inc (Dallas, TX). Prip-mCherry_CMV-eGFP og Prip-mCherry _CMVeGFP_H1-shRNA

mousePDX-1 subklonedes baseret på den oprindelige vektor RIP-mCherry-NLS-mCherry, der blev leveret af Dr. Michael Mancini fra Baylor College of Medicine. Gede-anti-kanin anti-serum og fåre-anti-muse-anti-serum konjugeret med peberrodsperoxidase blev indkøbt fra Amersham (Amersham Life Science Inc., Arlington Heights, IL). Kanin-anti-gede-IgG blev opnået fra Zymed (Zymed Laboratories, Inc. South San Francisco, CA, USA).

Transfektion og reporter assay

β TC-6 eller PANC-1-celler var udpladet i 10-cm cellekulturplader på 1 × 10

6 celler pr skål eller 24-brønds plader med 1 x 10

5 celler /brønd og inkuberet ved 37 ° C i 24 timer. Transfektionsassays blev udført under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens instruktioner. Fluorescenssignaler blev observeret og talt under anvendelse af fluorescensmikroskopi som beskrevet tidligere [23] til at bestemme reporter aktiviteter.

Celleproliferationsassay

in vitro

Celleproliferation blev bestemt ved MTS assay (Promega, Madison, WI) og BrdU indarbejde assay (kolorimetrisk) (Roche Diagnosistics GmbH, Mannherim, Tyskland) ved 12, 24, 48 og 72 timer efter transfektion. Absorbans blev læst i en Multiskan EX-pladelæser (Thermo Electronic Corp., Franklin, MA) ved 492 nm for MTS og 500 nm for BrdU-assay og niveauer af proliferation blev beregnet som tidligere beskrevet.

Western blot-analyser

Otteogfyrre timer efter transfektion, som beskrevet tidligere [23], βTC-6-celler blev opsamlet og lyseret i RIPA-buffer. Tyve (20) ug cellelysater blev påført SDS-PAGE-gel til elektroforese. Proteinet blev derefter overført til membraner, der skal probes med forskellige antistoffer mod PDX-1, cyclin D1, cyclin E, Cdk2, Cdk4 og p27. Immunkomplekser blev visualiseret ved forøget kemiluminescens (ECL) påvisning ved peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer.

Dyr og shRNA levering

SCID mus blev opstaldet i en BL-4 anlæg og plejes i overensstemmelse med retningslinjer i

den Pleje og anvendelse af forsøgsdyr

udarbejdet af Institute of Laboratory Animal Resources, Kommissionen om Life Science, National Research Council og det Baylor College of Medicine Animal Research. DNA-doser blev bestemt ved at opfylde kriterierne i mindre end 10% mus død efter injektion af liposomalt shRNA kompleks i regelmæssige SCID-mus. Hanmus, alderen 8- til 10-uger gamle, blev podet med 1 × 10

6 beta TC-6 eller PANC-1 celler pr mus via intraperitoneal (ip) injektion. To uger senere blev enten Ø TC-6 eller PANC-1 mus tilfældigt grupperet (30 mus per gruppe) og den første cyklus af shRNA

mousePDX-1 eller bi-shRNA

mousePDX-1 eller bi-shRNA

humanPDX-1 henholdsvis fik via injektion i halevenen. Disse cyklusser blev gentaget på dag 14 og 28 for i alt tre injektioner. Den samme protokol blev anvendt på SSTR

1/5

– /- mus ved hjælp af 3 cykler af 35 ug shRNA

mousePDX-1. De shRNA lipoplekser blev fremstillet som tidligere beskrevet [23].

Insulin og glukosemålinger

På dag 7, 21, 35 og 120 efter hver genafgivelse, 50 pi prøver af helblod blev opsamlet og spundet at adskille serummet. Glucoseniveauer blev målt under anvendelse af en Beckman-Coulter Glucose Analyzer 2 (Coulter-Beckman, Fullerton, CA), og præsenteres som gennemsnit ± S.E.M. i mg /dl. Insulin niveauer blev bestemt ved hjælp af en mus insulin ELISA kit fra Mercodia (Linco Research, St. Charles, MO) og præsenteres som gennemsnit ± S.E.M. . I ug /l

Intraperitoneal Glukose Tolerance Test (IPGTT)

SSTR

1/5

– /- mus på dag 7 og 150 efter indledende levering af shRNA

mousePDX-1 blev fastet natten over, før indsamling af blodprøver som T

0. Grupperede mus fik derefter 1,2 g glucose /kg legemsvægt via IP injektion efterfulgt af indsamling af blodprøver ved 15, 30, 60 og 120 min efter injektion af glucose. Glucose og insulinniveauer blev målt som beskrevet ovenfor.

Obduktion, væv indsamling, immunhistokemi og TUNEL-assay

De-identificerede humane pancreas neuroendokrine tumorer og nesidioblastosis prøver blev opnået fra Dr. David Dawson og fra Dr. William Fisher for IHC. Mus pancreas, holme og prøver tumorvæv blev opnået på dag 0, 7, 21, 35, og sluttidspunkt efter indledende genafgivelse. Peritoneale tumorer blev makroskopisk og mikroskopisk evalueret, og større (A) og mindre (B) diameter målt og registreret. Tumorvolumen (V; en roterende ellipsoide) blev beregnet ifølge formlen: V (mm

3) = A (mm) × B

2 (mm)

2/2. Samlede tumorvolumen blev beregnet ved at lægge alle tumorer sammen. Mus blev scoret ifølge nærvær eller fravær af tumor. IHC blev udført som tidligere beskrevet. Anti PDX-1, insulin, PP, cyclin E, p27, Cdk4 eller PCNA antistoffer blev påført på objektglas med 1:100 fortynding efterfulgt af inkubation natten over ved 4 ° C. Objektglas blev inkuberet med Cy3 eller FITC-konjugeret anti-kanin, ged eller mus sekundært antistof afhængig afledning af primære antistoffer i en time, og monteret med dækslides. TUNEL-assay (FragEL ™ DNA-fragmentering Detection Kit, kolorimetrisk-TdT Enzyme, Calbiochem, La Jolla, CA) blev udført ifølge producentens protokol. Hastigheden af ​​apoptose blev udtrykt som forholdet mellem apoptotiske kræftceller til det samlede antal endotelceller i 10 felter på × 100 forstørrelse.

Statistisk analyse

uparret Students

t

-test blev anvendt til statistiske analyser af blodsukkerniveauet, insulin niveauer, og celleproliferation med

P

0,05 indikerer signifikans. Den χ

2 test blev anvendt til sats sammenligning. Nummer-log blev anvendt til mus overlevelse sammenligning. Kaplan-Meier i SPSS 15,0 til MS Windows blev brugt til at plotte overlevelseskurver.

Resultater

PDX-1 er overudtrykt i humant prøvemateriale af pancreas neuroendokrine tumorer og nesidioblastosis samt mus insulinom celler og en transgen ø-hyperplasi musemodel

PDX-1 blev overudtrykt i 36 humane pancreas og ø-neoplasi prøver og herunder 26 pancreatiske neuroendokrine tumorer (fig. 1a) og 10 nesidioblastosis prøver (fig. 1b). PDX-1 også blev overudtrykt i muse insulinom (p TC-6) celler (fig. 1c) og i begge ø og acinære celler i pancreas af somatostatinreceptorundertyper 1 og 5 knock-out-mus (SSTR

1/5

– /-.) (fig 1e, f, henholdsvis) sammenlignet med den for vildtypemus (figur 1d).. Disse data viser, at PDX-1 er signifikant overudtrykt i både human pancreas neuroendokrine tumorer, nesiodioblastosis og mus islet neoplasi, tyder det et potentielt mål for disse sygdomme.

Immunfarvning med anti-PDX-1-antistof viser overekspression af PDX-1 i humane ø-neoplasi prøver (26 pancreatiske neuroendokrine tumorer (a), 10 nesidioblastosis enheder (b), βTC-6 tumorer (c) og 6 pancreas prøver fra SSTR1 /5

– /- mus (e, f .) PDX-1 overudtrykkes i begge øer (e) og acinære celler (f), SSTR1 /5

– /- mus sammenlignet med den af ​​vildtypemus hvor kun øceller udtrykte PDX-1 (d). PDX-1 positive er angivet med pilen (× 200).

Målretning PDX-1 med bi-shRNA

humanPDX-1 kontroller tumor volumen i et menneske bugspytkirtelkræft xenograft musemodel

In vitro

studier.

Siden Panc-1 celler er humane bugspytkirtelkræftceller der markant overekspression PDX-1, blev disse celler anvendes til både

in vitro

og

in vivo

undersøgelser. bi-shRNA

humanPDX-1 transfektion af PANC-1 celler resulterede i knock down af PDX-1. Dette var forbundet med reduktion af celleproliferation med 58%, 40% og 38% i forhold til tom vektor kontrol ved 24, 48 og 72 timer efter transfektion, hhv. Der var større inhibering af celleproliferation end der ses med shRNA

humanPDX-1 ved 0,6 ug og 1,2 ug /ml medium doser (fig. 2a, 2b), som omhandler den potentielle fordel bi- shRNA

humanPDX- 1 i RNAi terapi for pancreascancer.

MTS assay viste tidsforløbet for celleproliferation for PANC-1 (a) celler transficeret med bi-shRNA

mousePDX-1 og bi-shRNA

humanPDX-1 hhv. En sammenligning af celleproliferation hæmning procenter mellem bi-shRNA og shRNA transfektion ved forskellige doser er vist i Panc-1-celler (b).

In vivo Salg undersøgelser.

En PANC-1 xenograft SCID mus model er blevet udviklet og godt undersøgt i vores laboratorium; når de placeres intraperitonealt i SCID-mus, PANC-1 celler voksede til store tumorer inden for to måneder. To uger efter implantation af cellerne, tre cykler af bi-shRNA

humanPDX-1 lipoplekser (35 ug /mus, indgivet intravenøst ​​på dag nul, 14 og 28) signifikant reduceret PANC-1 tumorvolumen med kun få mus med resterende tumorer gennemsnit 51 mm

3 i forhold til 100% af kontrol mus med tumorer i gennemsnit 1199 mm

3 på 90 dage efter behandling (p 0,05;. figur 3a). Overlevelse i behandlingsgruppen var signifikant længere end kontroller (115 ± 9,5d vs 85 ± 1.4D henholdsvis (p = 0,001;. 3B) uden nogen signifikant forskel i overlevelse mellem tom vektor-behandlede mus og ubehandlede mus (85 ± 9d vs 76 ± 8d, p = 0,981). Under disse mus med resterende tumorer, tumor PDX-1-ekspression blev signifikant reduceret fra 95 ± 11,1% til 12 ± 1,3% på dag 0 og 90 efter behandlingen, (fig. 3c top panel). IHC analyse af resterende tumorer afslørede nedsat ekspression af celleproliferationsmarkører, proliferativ celle (PCNA) og cyclin E, (fra 84 ± 9,6% til 15 ± 0,8% og fra 66 ± 10,2% til 9 ± 2,3% henholdsvis;… figur 3c 2

nd og 3

rd paneler) og en stigning i p53-ekspression (fig 3c 4

th panel) Mærket apoptose blev set i resterende tumorer på dag 90 post behandling, hvilket tyder på de resterende tumorer blev sammensat af apoptotiske celler, som mangler PDX-1-ekspression. (fig. 3c bundpanel). Bemærkelsesværdigt tre cykler af bi-shRNA

humanPDX-1 lipoplekser havde ingen effekt på systemiske glucose og insulinniveauer , hvilket understreger betydningen af ​​arts-specifikke udformning af PDX-1 RNAi (fig. S1).

tumorvolumen blev evalueret og sammenlignet ved 90 og 120 dage efter den første behandling mellem behandlings- og kontrolgrupper (a). De overlevelsesrater af mus i behandling og af dem, der modtager den tomme vektor kontrol blev analyseret ved hjælp af Kaplan-Meier i SPSS (b). Immunfarvning for tumor lysbilleder med PDX-1, PCNA, cyclin E, og P53 samt TUNEL-assayet blev udført og analyseret (c). Den positive for hver markør er angivet med pilen (× 200).

Disse data viser, at flere cykler af systemisk bi-shRNA

humanPDX-1 lipoplekser var veltolereret og reduceres effektivt menneske bugspytkirtelkræft tumorvolumen og forlænget overlevelse i SCID-mus. Disse data viser, at PDX-1 er et potentielt mål ved hjælp af denne roman terapeutiske platform for den mest aggressive form for bugspytkirtlen neoplasi.

Målretning PDX-1 med bi-shRNA

mousePDX-1 kontroller overdreven sekretion af insulin fra mus insulinom celler og i en musemodel af insulinoma

In vitro

studier.

bi-shRNA

mousePDX-1 resulterede i signifikant større knockdown af PDX- 1-ekspression i p TC-6-celler ved doser på 0,6 ug og 1,2 ug /ml medium end shRNA

mousePDX-1 og tom vektor kontrol i både Western blot (fig 4a; p. 0,05) og immunhistokemi (IHC) analyser (fig. 4b øverste panel).

Sammenligning af effekten af ​​bi-shRNA

mousePDX-1, shRNA

mousePDX-1 eller tom vektor i hæmning af PDX-1-ekspression i β TC-6 -celler er vist ved hjælp af western blot (a) og celle immunfarvning (øverste felt, b som angivet ved pilen). Insulinekspression og glucose stimulerede sekretion som respons på knockdown af PDX-1 er vist ved celle immunfarvning (bundpanel, b som angivet ved pilen) (× 200) og ELISA-assay (d) henholdsvis. Hvert eksperiment blev gentaget fem gange. PDX-1 og insulin ekspression i immunfarvet p TC-6-celler kvantificeres (c). PDX-1-ekspression påvirkede RIP-directed reporterekspression (RIP-mCherry) i βTC-6-celler (e og f). De celler, der udtrykker mCherry (rød) og GFP (grønt) blev visualiseret og fotograferet under anvendelse af fluorescensmikroskopi (e og f). (× 200).

bi-shRNA

mousePDX-1 resulterede i signifikant større hæmning af insulin udtryk og PDX-1-ekspression end den, der ses med shRNA

mousePDX-1 og tom vektor kontrolceller, (fig 4c, s. 0,05, og fig 4b.). Transfektion med bi-shRNA

mousePDX-1 resulterede i signifikant større hæmning af glucosestimuleret insulinsekretion fra β TC-6 celler

in vitro

sammenlignet med den, der ses med shRNA

mousePDX-1 og tomme vektor kontrol ved glucosekoncentrationer af 5 og 11 mM (p 0,05), (fig 4d.). Disse resultater viser, at bi-shRNA

mousePDX-1 hæmmer insulin ekspression og sekretion via PDX-1 knockdown, og gør det i højere grad end konventionel shRNA

mousePDX-1 i mus insulinom celler.

for yderligere at afgrænse den mekanisme, hvormed knockdown af PDX-1 hæmmer insulin ekspression og sekretion gennem reduceret aktivering af rotte insulin promoter-1 (RIP), reporter konstruerer (RIP-mCherry) med eller uden shRNA

mousePDX-1 blev transficeret til p TC-6-celler. RIP-mCherry-H1-shRNA

mousePDX-1 resulterede i signifikant reduktion i mCherry ekspression sammenlignet med den af ​​RIP-mCherry uden shRNA

mousePDX-1 (10 ± 1,6% vs. 35 ± 8,1% og 12 ± 2,1 % vs 66 ± 13,2% ved 24 timer og 48 timer, henholdsvis p 0,05;. figur 4e). Transfektion af RIP-mCherry-CMV-eGFP-H1 viste, at 90% af cellerne med held blev transficeret, som det fremgår af eGFP ekspression. Derudover 69% af eGFP-udtrykkende celler udtrykte mCherry, og i RIP-mCherry-CMV-eGFP-H1-shRNA

mousePDX-1 transfekterede celler, 88% af cellerne udtrykte eGFP; dog kun 12% af cellerne udtrykte mCherry (p 0,05;. figur 4f). Nedsat PDX-1-ekspression blev bekræftet ved anvendelse western blot. Disse data antyder, at aktivering af insulin promotoren signifikant inhiberet af shRNA

mousePDX-1 via knockdown af PDX-1-ekspression.

Transfektion med bi-shRNA

mousePDX-1 i β TC-6 celler resulterede i signifikant undertrykkelse af celleproliferation anvendelse af to forskellige assay: MTS-assayet viste reduktioner på 52%, 38% og 31% versus tom vektor kontrol ved 24, 48 og 72 timer efter transfektion (fig 5a.) og BrdU inkorporering assay viste reduktioner på 42%, 35% og 42% ved 12, 24, og 48 timer efter transfektion, henholdsvis (figur 5b.) (p 0,05 på alle tidspunkter). bi-shRNA

mousePDX-1 resulterede i større inhibering af celleproliferation end shRNA

mousePDX-1 ved lave doser (6 ug /10 cm skål) efter 48 timers transfektion (fig. 5c). Celle cyklus protein analyse viste større nedregulering af positive regulatorer, cyclin E, Cdk2, og Cdk4, og opregulering af negative regulatorer, p53 og p27, i bi-shRNA

mousePDX-1-behandlede celler sammenlignet med den for tomme vektor kontrol (p 0,05;. figur 5d). Disse data viser, at PDX-1 knockdown inhiberer muse insulinoma celleproliferation via ændringer i cellecyklusproteiner.

MTS assay viste tidsforløbet for celleproliferation for β TC-6 (a) celler transficeret med bi-shRNA

mousePDX-1 og bi-shRNA

humanPDX-1 hhv. En sammenligning af de procentdele af celleproliferation hæmning mellem bi-shRNA og shRNA transfektion ved forskellige doser er vist i Ø TC-6 celler (b). Celleproliferation bestemt ved BrdU også vises (c). Western blot analyse af 20 ug lysatet fra p TC-6 celler, der var transficeret med shRNAi

mousePDX-1 efter 48 timer blev udført med anti-PDX-1, cyclin E, Cdk2, Cdk4, p53 og p27 (d).

In vivo

studier.

Tidligere vores laboratorium udviklet en dødelig mus insulinom model, som er blevet godt undersøgt. SCID-mus implanteres med muse insulinom celler og bukke under for hyperinsulinæmi og hypoglykæmi på ca. 60 dage. I denne musemodel, tre cykler af enten intravenøs bi-shRNA

mousePDX-1 lipoplekser (25 ug /mus hver anden uge) eller shRNA

mousePDX-1 lipoplekser (35 ug /mus hver anden uge) forhindrede død af hyperinsulinæmi og hypoglykæmi ( fig. 6a og b og c og d henholdsvis). Forbigående hyperglykæmi og hypoinsulinæmi blev observeret, men niveauerne vendte tilbage til baseline på dag 150 efter den første behandling i begge behandlingsgrupper. I kontrolgruppen, tom vektor lipoplekser havde ingen effekt på letal hyperinsulinæmi og hypoglykæmi, som vist i fig. 6a og b.

Glucose niveauer A og C svarende til insulin niveauer B og D blev erhvervet fra β TC-6 mus behandlet med bi-shRNAi

mousePDX-1 eller shRNAi

mousePDX-1 , henholdsvis. I hvert tal a-d, instrumentbrættet linje repræsenterer kontrolgruppe data og streg-prik linje repræsenterer behandlingen gruppe data. Ø-celler, der udtrykker PDX-1, insulin, PP, PCNA, p27, cyclin E og cdk4 blev vist ved IHC og ø-celle apoptose blev vist ved TUNEL-assay, som angivet ved pile (× 200) (e). Mus overlevelse efter tre behandlingsgrupper cyklusser af enten tomme vektor eller bi-shRNAi

mousePDX-1 og tom vektor eller shRNAi

mousePDX-1 blev evalueret og sammenlignet ved hjælp af Kaplan-Meier i SPSS (f).

Samlet overlevelse i bi-shRNA

mousePDX-1 og shRNA

mousePDX-1 behandlingsgrupper var signifikant længere end for kontrollerne (106 ± 7.8d vs 53 ± 1.4D og 146 ± 9,5d vs 53 ± 1.4D henholdsvis p 0,05 vs kontrol, fig 6f, fig S2)… Det skal bemærkes, at den ubetydelige forskel i overlevelse mellem de to behandlingsgrupper skyldtes bevidst ofrer af bi-shRNA

mousePDX-1 gruppe mus på et tidligere tidspunkt (fig. S2F). Disse data viser, at PDX-1 knockdown under anvendelse systemiske bi-shRNA

mousePDX-1 lipoplekser effektivt forhindrer hyperinsulinæmisk, hypoglykæmisk død i en insulinom SCID-musemodel; derfor, de behandlinger styre overdreven hormonal sekretion er forbundet med denne form for ø-neoplasi.

Det er bemærkelsesværdigt, systemisk bi-shRNA

mousePDX-1 og shRNA

mousePDX-1 lipoplekser resulterer i tidsmæssig hyperglykæmi, der repræsenterer en forudsigelig off-target effekt på muse-øer, eftersom PDX-1 er den fremherskende regulator af insulin ekspression. Efter behandling med bi-shRNA

mousePDX-1,

in situ

ø-PDX-1-ekspression blev reduceret i en behandling-afhængig måde, fra 88 ± 10,1% på dag 0 til 71 ± 8,6%, 49 ± 9,7% og 23 ± 6,6% på dag 7, 21, 35 efter behandlingerne henholdsvis og vendte tilbage til 83 ± 12,4% på dag 120 efter behandling, som vist på fig. 6e, toppanelet. Insulin udtryk også var signifikant reduceret fra 92 ± 8,3% på dag 0-61 ± 9,8%, 32 ± 5,3%, og 12 ± 1,9% på dag 7, 21, 35, efter behandlingerne, henholdsvis og vendte tilbage til 89 ± 15,3% på dag 120 efter behandling, som vist i fig. 6e, 2

nd panel. Ekspressionsniveauer af PP også faldt betydeligt på samme tidspunkter efter behandling (fig. 6e, 3

rd panel). Markører for ø-celleproliferation, blev cellecyklusproteiner og apoptose også studeret før og efter behandlingen. Islet PCNA-ekspression faldt betydeligt fra 16 ± 1,4% til 10 ± 0,8%, 7 ± 0,6%, 5 ± 0,2% og 14 ± 2,0% på dag 0, 7, 21, 35 og 120 efter behandling, (fig. 6e, 4

th panel). Både IHC og western blot analyser af pancreas sektioner demonstreret øget p27-ekspression og faldende udtryk for protein niveauer i cyklin E og Cdk4 følgende tre cyklusser af behandlingen (fig. 6e, 5

th, 6

th og 7

th paneler, og fig. S3, henholdsvis). bi-shRNA

mousePDX-1 resulterede i en signifikant stigning i apoptose af muse øer fra 1 ± 0,2% på dag 0, til 14 ± 2,4%, 24 ± 3,6%, 42 ± 5,5%, og 10 ± 1,1% på dag 7, 21, 35 og 120 efter behandling, (fig. 6e nederste panel). Tom vektor kontrol terapi havde ingen virkning på holm PDX-1, insulin, PP-ekspression, cellecyklusproteiner og apoptose. Disse data er i overensstemmelse med resultater ses efter PDX-1 knockdown i muse insulinom celler

in vitro

. De foreslår også, at systemisk bi-shRNA

PDX-1 lipoplekser resultere i tidsmæssig, mild hyperglykæmi udgår fra undertrykkelse af PDX-1 inden for de Langerhanske øer med efterfølgende undertrykkelse af insulin og PP-ekspression, korrelerer med ændringer i ø-cellecyklusproteiner og øget holm apoptose.

Angivelse af alle ø-markører tilbage til baseline værdier, offer, hvilket tyder på en regenerativ kapacitet af murine holme, hvilket resulterer i normalisering af basale insulin og glucose niveauer. Dette er i modsætning til de PANC-1 celle resterende tumorer, der havde lave niveauer af PDX-1 og markant forhøjede apoptose, hvilket tyder på en mangel på regenerering. Lignende mønstre af ekspression af PDX-1, insulin, PP, og cellecyklusproteiner og apoptose i øceller også blev observeret efter tre cykler af shRNA

mousePDX-1 lipoplekser (Fig. S4). Disse data viser, at systemisk bi-shRNA

mousePDX-1 lipoplekser effektivt forhindre hypoglykæmisk død i en insulinom SCID-musemodel og resultere i

in situ

knockdown af PDX-1 i øerne, hvilket fører til undertrykkelse af insulin ekspression og sekretion og efterfølgende hyperglykæmi. Bemærkelsesværdigt, eventuelle off-target ø effekter var milde og tidsmæssige, hvilket tyder på en regenerativ kapacitet murine endokrine bugspytkirtel. Eftersom der ikke er resterende insulinom celler findes i denne model efter terapi, ø-data viser evnen af ​​systemisk leveret behandling til knockdown PDX-1 i denne model. Salg

Systemisk shRNA

mousePDX-1 lipoplekser reverse hyperinsulinæmi og hypoglykæmi og ændre glukosetolerance i somatostatinreceptorundertyper 1 og 5 (SSTR

1/5

– /-) knockout-mus

SSTR1 /5

– /- musemodel blev anvendt som musene repræsenterer en immun-kompetent insulinoma-lignende musemodel med overekspression af PDX-1 i både acinære celler og øceller, featured med hyperinsulinæmi og hypoglykæmi. Vi ønskede at undersøge, om gentagne intravenøse behandlinger ville vende basal hyperinsulinæmi og hypoglykæmi og tolereres i disse immun-kompetente mus. Tre cykler af shRNA

mousePDX-1 lipoplekser (35 ug /mus) blev tålt godt og væsentligt vendt basal hyperinsulinæmi og hypoglykæmi i SSTR

1/5

– /- mus (3 ± 0,2 ug /l og 83 ± 19,5 mg /dl på dag 0 og 0,5 ± 0,1 ug /l og 205 ± 25,9 mg /dl på dag 35 efter tre behandlinger henholdsvis som vist i fig 5a og b).; tom vektor lipoplekser havde ingen effekt på hyperinsulinæmi og hypoglykæmi (fig. 7a og b). Bemærkelsesværdigt, systemiske glucose og insulin niveauer vendte tilbage til baseline på dag 150 efter den første behandling, hvilket tyder på en regenerativ kapacitet af disse murine holme.

Glucose niveauer (a), og tilsvarende insulin niveauer (b) blev målt som beskrevet i fremgangsmåde afsnittet. Immunfarvning for pancreas dias med PDX-1, blev PCNA og TUNEL assay udføres. Rød farvning i toppanelet af (c) indikerer PDX-1 ekspression (pil); grøn farvning på midterste panel (c) angiver PCNA udtryk (pil). Apoptotisk tumorceller fra SSTR1 /5

– /- mus farves brun og er vist i det nederste panel af (c) (pil) (× 200). IPGTT assay viste glukose niveauer og insulin niveauer (d) på dag 7 og glucose niveauer og insulin niveauer (e) på dag 150 efter shRNA

mousePDX-1 behandling. Data er præsenteret som middelværdi ± S.E.M. og P 0,05 indikerer signifikans

Intraperitoneale glukose tolerance test (IPGTT) blev udført på SSTR

1/5

– /- mus på dag 7 og 150 efter.