Abstrakt
Hyaluronan (HA), en simpel disaccharid enhed, kan polymerisere og betragtes som en primær komponent af den ekstracellulære matrix, som har en bred vifte af biologiske funktioner. I de senere år blev HA fundet på overfladen af tumorceller. Ifølge tidligere rapporter, er forskellig HA-indhold på celleoverfladen af tumorceller nært beslægtet med lymfeknudemetastaser, men de mekanismer medierer denne proces forblev uklart. Denne forskning har til formål at studere indholdet overflade af HA på tumorceller og analysere celleadhæsive ændringer forårsaget af interaktionen mellem HA og dets lymfatiske endotel receptor (Lyve-1). Vi screenede og observerede højt HA-indhold på HS-578T bryst celler og lavt HA-indhold på MCF-7 bryst celler gennem partikel udstødelse, immunofluorescens og flowcytometri eksperimenter. Ekspressionen af Lyve-1, lymfeknuder-fartøj specifik HA-receptoren, var i overensstemmelse med vores tidligere rapport og forbedret vedhæftning af HA
high-HS-578T celler til COS-7
Lyve-1 (+) gennem HA i celle statisk klæbeevne og dynamiske parallelle plade strømningskammeret eksperimenter. MCF-7 bryst celler indeholder lidt HA på overfladen; imidlertid viste vores resultater lidt adhæsion forskel mellem MCF-7-celler og COS-7
Lyve-1 (+) og COS-7
Lyve-1 (-) celler. Lignende resultater blev observeret med hensyn til adhæsion af HS-578T celler eller MCF-7-celler til SVEC4-10 celler. Endvidere har vi observeret for første gang, at celleoverfladen HA indhold af høj overførsel tumorceller var rige, og vi visualiseret tværbindingen af HA kabel strukturer, som kan aktivere Lyve-1 på lymfatiske endotelceller, fremme tumor vedhæftning. Sammenfattende til høj-lav celleoverfladen HA indhold af tumorceller gennem interaktionen med Lyve-1 fører vedhæftning forskelle
Henvisning:. Du Y, Liu H, han Y, Liu Y, Yang C, Zhou M et al. (2013) Samspillet mellem Lyve-1 med Hyaluronan på celleoverfladen kan spille en rolle i mangfoldighed Vedhæftning til kræftceller. PLoS ONE 8 (5): e63463. doi: 10,1371 /journal.pone.0063463
Redaktør: Nikos K. KARAMANOS, University of Patras, Grækenland
Modtaget: Januar 13, 2013; Accepteret: April 3, 2013; Udgivet: May 22, 2013 |
Copyright: © 2013 Du et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Denne forskning blev støttet af shanghai Udvalg for Videnskab og Teknologi (No.10411950500), National Natural Science Foundation of China (81.071.814, 81.172.027, 81.272.479) og Program for Shanghai Emne Chief Scientist (11XD1404000). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
invasion og metastase er de vigtigste biologiske karakteristika af maligne tumorer. Tumorcelleadhæsion spiller en vigtig rolle i tumorinvasion og metastase, herunder forbindelsen mellem tumorceller indbyrdes og mellem tumorceller med andre celletyper. Overførsel af tumorceller involverer adhæsion og adskillelse (adhæsion depolymerisering). I den tidlige fase af tumorinvasion der individuelle tumorceller kaste fra den primære tumor grundet friktion faktor tab, som genererer overførselspotentiale af kræftcellerne. I midten fase af invasion, tumorceller, som blev overført til cirkulationssystemet overholder vaskulære endotelceller og den ekstracellulære matrix. Denne proces involverer mange vedhæftning faktorer og forskellige andre faktorer, der fremmer eller separat vedhæftning såsom celleadhæsionsmolekyler (CD44, cadherin). Denne undersøgelse diskuterer primært problemer med vedhæftning involverer tumorceller og lymfeknuder endotelceller.
Hyaluronan (HA) er sammensat af en lineær gentagelse af disaccharidenheder bestående af D-glucuronsyre og N-acetylglucosamin og er den primære bestanddel af den ekstracellulære matrix. Under fysiologiske betingelser, er HA primært fordelt i bindevæv med mange andre proteiner til dannelse af et stort og kompliceret netværk, der opretholder afstanden mellem celler, såsom slimhinden lamina propria og den ydre membran omkring blodkar i huden fordeling [1], [2 ]. Mange undersøgelser har vist, at HA påvirker tumorangiogenese, metastase og invasionsevne. In vivo fundet studier, der forud for migration, celler øget deres HA koncentration ved deres udgangspunkt sted [3], [4]. Desuden blev HA sig at stige ved invasionen kant af brystcancerceller [5], [6] og i det ekstracellulære miljø [7], som reorganiserer matrixen af invasive tumorceller. Et stort antal eksperimentelle resultater har vist, at aggressive tumorer indeholder høje niveauer af HA, og at forøgede niveauer af HA i faste tumorer er relateret til dårlig tumor differentiering og en reduktion i patientens overlevelsesraten. Tidligere undersøgelser fandt, at forøget HA blev produceret af de omgivende fibroblaster efter stimulering med brystcancerceller [8]. Imidlertid invasive tumorcellerne selv også kunne syntetisere HA på celleoverfladen. Mange undersøgelser fokuserer på ensartetheden af mængden af HA på tumorcelleoverfladen til sin metastase og har fundet, at evnen hos tumorceller at overføre var relateret til deres overflade HA indholdet [9], [10]. Itano og kolleger [10] intravenøst injiceret bryst celler, der producerer HA og mutant brystceller, der ikke kunne producere HA i nøgne mus. De fandt, at mutante kloner viste signifikante fald i metastatisk evne sammenlignet med de parentale celler efter intravenøs (i.v.) injektion i syngene mus. Udtrykke mus hyaluronansyntase 1 (HAS1) ved transfektion i HAS
– celler defekte i hyaluronansyntasekodende aktivitet reddet hyaluronan matrix dannelse samt hyaluronan produktion. Lunge metastase efter i.v. injektion af HAS1 transfektanter blev også genvundet betydeligt. Mange rapporter har bekræftet, at HA indhold på tumorcelleoverfladen var relateret til celle overførselshastighed på [9], [10], [11]. Specifikt for høje niveauer af overflade HA årsag cancerceller overføre hurtigt, og en lav HA-niveauer forårsage tumorceller til at overføre langsomt.
eksisterende litteratur støtter forholdet mellem HA indhold på tumorcelleoverfladen og tumor lymfe metastase. Men reguleringen af tumor vedhæftning, lymfe metastase, og overførselshastighed ved celleoverfladen HA stadig uklar. Undersøgelser vedrørende overførsel via blodet pathway viste, at tumorceller kombineret med vaskulær endotel celleoverflade-specifikke præparat fremmer tumorceller og vaskulær endotelcelle-adhæsion [12], [13]. Desuden blev den overførselshastighed tumor og vedhæftning rate positivt relateret. Undersøgelser har også vist sig, at CD44, et bredt udtrykt endotelial celleoverflade HA receptor, påvirket adhæsionen af tumorceller og lymfocytter. Lymfe metastase feltstudier bekræftet, at høje overfladetemperaturer niveauer af HA i musemelanomceller fremmes hurtig overførsel til lymfeknuder, og lave overfladetemperaturer niveauer af HA i musemelanomceller korrelerede med langsom metastase til lymfeknuder [9]. Lymfatiske endotelceller har en specifik hyaluronsyre receptor navngivet lymfatiske endotelceller hyaluronsyre receptor 1 (Lyve-1) [14]. Lyve-1 blev hypotese at have en effekt, der ligner CD44 om blod endotelceller, hvilket lettes ved at interagere med tumorcelleoverfladen HA og påvirkninger tumorcelleadhæsion. Men den mekanisme, hvormed tumorcelleoverfladen HA virker på Lyve-1 kan påvirke dets vedhæftning og overførsel i tumor lymfe metastase fortsat uklar.
I denne undersøgelse den biologiske rolle af interaktionen mellem Lyve-1 og tumor celleoverflade HA i cancer celleadhæsion blev undersøgt. HS-578T celler, som indeholder højt HA på deres overflade (HA
high-HS-578T) og MCF-7-celler, der har lidt HA på overfladen (HA
lav-MCF-7) blev udvalgt. COS-7-celler transficeret med Lyve-1 (COS-7
Lyve-1 (+)) og SVEC4-10 celler (en lymfeknuder endotelcelle-lignende cellelinie) blev anvendt som modeller til at studere vedhæftningen virkning mellem Lyve -1 og tumorceller, der udtrykker høje eller lave niveauer af HA. HS-578T-celler og MCF-7-celler, som de øverste celler, uafhængigt holde sig til underlag af COS-7
Lyve-1 (+) celler og COS-7-celler transficeret med kontrol pEGFP-N1 vector (COS-7
Lyve-1 (-)) under statiske og dynamiske tilstande. Resultaterne viste, at HA, til stede på overfladen af tumorceller, medieret adhæsion af tumorceller til COS-7
Lyve-1 (+) celler og COS-7
Lyve-1 (-) celler. HA
høj-HS-578T brystkræftceller havde større tilslutning til COS-7
Lyve-1 (+) end COS-7
Lyve-1 (-) celler via interaktionen mellem HA og lymfe endotel cellespecifik hyaluronsyre receptor Lyve-1. Derudover kan MCF-7 brysttumorceller, der mangler celleoverflade HA dybest set ikke klæbe gennem HA og Lyve-1-binding. Lignende resultater blev også observeret om vedhæftning af HS-578T celler eller MCF-7 celler til SVEC4-10 celler.
Resultater
Visualisering af pericellulære Matrix Dannelse af 6 Humane Breast Cancer Cells
HA-indhold i bryst kræftceller adskiller sig væsentligt; derfor blev HA stede på overfladen visualiseret under anvendelse af en partikel-udelukkelse assay. I dette assay blev en klar zone mellem HS-578T og MDA-MB-231-celler, og de faste erythrocytter iagttaget (fig. 1A a, c). Endvidere blev 5 minutter efter Streptomyces hyaluronidase sættes til dyrkningsskålen, HA frakker var nedbrudt, så de røde blodlegemer til at kontakte HS-578T og MDA-MB-231-celler direkte (Fig. 1A b, d). Desuden er disse data er i overensstemmelse med tidligere arbejde [15]. Vores resultater viste, at MDA-MB-435s, MDA-MB-468, MCF-7, og SK-BR-3-celler, som har en lav kapacitet for HA produktion, blev ikke udelukket fra faste erythrocytter (Fig. 1A E, G , i, k), og næsten blev observeret nogen ændring efter tilsætning hyaluronidase (fig. 1A f, h, j, l). For at kvantificere matrix tykkelse blev konturerne af matricer og cellulære grænser fra 10 individuelle celler spores. Overtrækstykkelse blev plottet for hver cellelinje med og uden Streptomyces hyaluronidase behandling (fig. 1B). Det gennemsnitlige ratio for hver betingelse er angivet med en vandret stang. I overensstemmelse med resultaterne af udelukkelsen partikel eksperiment, immunfluorescens (fig. 1C) og flowcytometri (fig. 1D) -forsøg ligeledes bevist, at HA indhold på celleoverfladen af HS-578T og MDA-MB-231-celler var rige, og de andre fire celler havde lavt indhold overflade HA.
(a) Visualisering og morfometrisk analyse af HA matricer blev udført under anvendelse af en partikel–eksklusionsassay før og efter tilsætning af HA-specifikke Streptomyces hyaluronidase. En klar zone var tydelig mellem HS-578T, MDA-MB-231-celler og røde blodlegemer (a, c); ca. 5 min efter Streptomyces hyaluronidase blev tilsat til cellerne, blev de HA frakker nedbrudt, så de røde blodlegemer til at kontakte HS-578T og MDA-MB-231-celler (b, d). Ingen forskel før (e, g, i, k) og efter (f, h, j, I) tilsætning af Streptomyces hyaluronidase til MDA-MB-435s, MDA-MB-468, MCF-7 og SK-BR 3 celler blev observeret. (B) Overflade HA retention blev kvantificeret som forholdet mellem matrix område til celle område. Individuelle brystcancerceller blev sporet ved hjælp Image Pro Plus 6 ved ydergrænsen af den klare zone til at beregne matricen område og på cellen perimeter at beregne celleområdet. Coat /celle arealforhold er plottet som en fordeling, med middelværdien repræsenteret af en vandret stang. (C) En immuncelle fluorescens forsøg blev anvendt til at detektere celleoverflade HA. Den relative lysstyrke repræsenteret HA indhold på celleoverfladen. Stærk lys blev visualiseret i HS-578T og MDA-MB-231 celler; på baggrund af de øvrige fire celletyper var dybest set ikke målbart. (D) HA-indholdet blev også vurderet ved FACS-analyse. Repræsentative histogrammer er vist for celler farvet med biotinyleret HABP og Alexa 488-mærket avidin til HA i ubehandlede celler (rød) eller celler behandlet med Streptomyces hyaluronidase (blå). Kontrol celler blev farvet kun med Alexa 488-mærket avidin (sort).
Breast Cancer Cells HA
high-HS-578T og HA
lav MCF-7 Overhold forskelligt Under Static betingelser
Som tidligere undersøgelser har vist, er den statiske friktionskoefficient eksperiment ofte til at teste vedhæftningen forskellen mellem forskellige molekyler og celler. At undersøge forskellen i tumorcelleadhæsion til COS-7-celler gennem en interaktion med overfladen HA og Lyve-1, blev et bindingsassay udføres. Den korrekte ekspression af Lyve-1 i COS-7-celler blev bekræftet i vores tidligere undersøgelse [16]. HA
high-HS-578T og HA
lav-MCF-7-celler mærket med DAPI blev påført COS-7
Lyve-1 (+) og COS-7
Lyve-1 (- ) celler til at observere stationære adhærens. Vores resultater viste, at mange HS-578T-celler adhæreret til stationære COS-7
Lyve-1 (+) celler på grund af den overflod af HA-molekyler på sin overflade, og antallet af celler, der klæber nedsat, når de interageret med COS- 7
Lyve-1 (-) celler (. figur 2A, a, b, 2B, e). Tidligere undersøgelser under anvendelse af Streptomyces hyaluronidase før bindingsassayet viste, at HA deltager i tumor adhæsion [16]. I overensstemmelse med dette fund, MCF-7-celler, som har lavt indhold overflade HA, viste ingen forskel i tilslutning til COS-7
Lyve-1 (+) celler og COS-7
Lyve-1 (-) celler (. figur 2A, c, d; 2B, f). SVEC4-10 celler er bekræftet som en lymfe endotelcelle-lignende cellelinie [17] og er forskellige fra COS-7 celler; Derfor testede vi også adhæsionen af HS-578T-celler og MCF-7-celler til SVEC4-10 celler, som blev verificeret som en lymfe endotelcelle-lignende cellelinie. Vores resultater viste, at efter blokere interaktionen mellem Lyve-1 og HA, blev et lille fald iagttages i adhæsionen mellem HS-578T-celler og SVEC4-10 celler (Fig 2C, g-i;. 2D, m). Ingen forskel blev observeret mellem MCF-7-celler og SVEC4-10 celler (Fig 2C, j-l;. 2D, n). Således indikerer disse resultater, at forskellen bemærket i overførslen i lymfeknuder fartøjer af tumorceller, der udtrykker høje og lave HA kan skyldes karakteristisk adhæsion til Lyve-1 på lymfe endotelceller.
(A) klæbet HS- 578T og MCF-7-celler vises som blå kugler (a-d). DAPI-mærkede HS-578T-celler var mere klæbende til sammenflydende monolag af COS-7
Lyve-1 (+) celler sammenlignet med COS-7
Lyve-1 (-). MCF-7-celler adhæreret tilsvarende med begge COS-7
Lyve-1 (+) og COS-7
Lyve-1 (-) celler. (B) Kvantitative vurderinger af HS-578T og MCF-7 celleadhæsion på monolag af COS-7-celler er vist, og hvert assay blev udført tre gange. Resultaterne er vist som middelværdi ± SD af tredobbelte brønde fra et typisk forsøg og er udtrykt som en fold stigning i forhold til COS-7-celler transficeret med kontrolvektoren pEGFP-N1. * P 0,05 versus indikerer transficeret pEGFP-N1 vektor kontrol COS-7-celler. (C) klæbet HS-578T og MCF-7-celler vises som blå kugler (g-l). DAPI-mærket HS-578T celler klæbende til sammenflydende monolag af SVEC4-10 celler før og efter blokering med Lyve-1 antistof, isotype antistof. (D) Kvantitative vurderinger af data fra HS-578T og MCF-7 celleadhæsion på monolag af SVEC4-10 celler er vist, og hvert assay blev udført tre gange. Resultaterne er vist som middelværdi ± SD af tredobbelte brønde fra et typisk forsøg og er udtrykt som en fold fald i forhold til SVEC4-10 celler uden behandling. * P . 0,05 versus SVEC4-10 celler uden behandling
Breast Cancer Cells HS-578T og MCF-7 forskelligt overholde Under strømningsforhold
Tumor celle anholdelse og dannelsen af stabile selvklæbende interaktioner mellem tumorceller og endotelceller er afgørende skridt på den metastatiske proces. For at få mere information om de bindende egenskaber af brystkræftceller til COS-7
Lyve-1 (+) og COS-7
Lyve-1 (-) celler, blev udført lignende vedhæftning eksperimenter til de ovenfor beskrevne hjælp en parallel plade flow kammer under forskydning stressbetingelser. Slides med COS-7
Lyve-1 (+) og COS-7
Lyve-1 (-) celler blev anbragt i en parallel plade flow kammer, og HS-578T eller MCF-7-celler blev perfunderet under fysiologiske ren stress. Som vist i fig. 3 (A, a, b, B, e), svarende forøget adhæsion af HS-578T celler til COS-7
Lyve-1 (+) end COS-7
Lyve-1 (-) celler blev observeret under lave strømning (0.1dyn /cm
2); dog MCF-7-celler stadig på lignende klæbet til både COS-7
Lyve-1 (+) og COS-7
Lyve-1 (-) celler (Fig 3A, c, d;. 3B, f) . Vores resultater viste også, at efter blokere interaktionen mellem Lyve-1 og HA, adhæsion mellem HS-578T-celler og SVEC4-10 celler faldet lidt under lave strømning (0,1 dyn /cm
2), som vist i fig. 3 (C, g-i; D, m). Ingen åbenlyse forskelle mellem MCF-7 celler og SVEC4-10 celler (før og efter blokering) blev påvist (fig 3C, j-l;. 3D, n).
(A) Antallet af HS-578T og MCF-7-celler adhæreret til COS-7
Lyve-1 (+) og COS-7
Lyve-1 (-) celler under 0,1 dyn /cm
2 lav forskydningsspænding blev vurderet ved at tælle 5 tilfældige udsigt over fluorescens mikroskop billeder. Klæbet HS-578T og MCF-7-celler vises som blå kugler (A-D). (B) Kvantitative vurderinger af data, der repræsenterer HS-578T og MCF-7 celleadhæsion på monolag af COS-7-celler er vist, og hvert assay blev udført tre gange. Resultaterne er vist som middelværdi ± SD af tredobbelte brønde fra et typisk forsøg og er udtrykt som en fold stigning i forhold til kontrol pEGFP-N1 vektor transficerede COS-7 celler. * P 0,05 versus de angivne transficerede pEGFP-N1 vektor kontrol COS-7-celler. (C) Antallet af HS-578T og MCF-7 celler overholdes SVEC4-10 celler før og efter blokering med Lyve-1 antistof, isotype antistof under 0,1 dyn /cm
2 lav forskydningsspænding blev vurderet ved at tælle 5 tilfældige visninger af fluorescensmikroskop billeder (g-l). (D) Kvantitative vurderinger af data fra HS-578T og MCF-7 celleadhæsion på monolag af SVEC4-10 celler er vist. Hvert assay blev udført tre gange. Resultaterne er vist som middelværdi ± SD af tredobbelte brønde fra et typisk forsøg og er udtrykt som en fold fald i forhold til SVEC4-10 celler uden behandling. * P. 0,05 versus SVEC4-10 celler uden behandling
vedhæftning HS-578T og MCF-7 celler til COS-7
Lyve-1 (+) og COS-7
Lyve-1 (-) celler separat blev udsat for forskellige intensiteter af forskydningsspænding, og ændringer i antallet af klæbende celler blev målt. HS-578T-celler fik lov til at binde til Lyve-1-transficerede celler og kontrolceller 0.1 dyn /cm
2 i 2 min og blev udsat for stigende forskydningsspænding på op til 13,54 dyn /cm
2 (fig. 4A, B, a). HS-578T celler med højt HA-indhold forblev bundet til COS-7
Lyve-1 (+) cellemonolaget på væggen shear stress niveauer på op til 5,4 dyn /cm
2 og begyndte at blive frigivet på 13,54 dyn /cm
2. Mængden af HS-578T celleadhæsion til COS-7
Lyve-1 (+) celler i forhold til COS-7
Lyve-1 (-) celler var stadig højere og ikke åbenbart ændret indtil forskydningsspænding nåede 13,54 dyn /cm
2. Ingen signifikante forskelle i den rullende adfærd MCF-7-celler til COS-7
Lyve-1 (+) og COS-7
Lyve-1 (-) celler blev observeret (figur 4A,. B, b) . Imidlertid er adhæsion af HS-578T celler til SVEC4-10 celler (før og efter blokering) afveg fra adhæsion til COS-7-celler. En bemærkelsesværdig nedgang i vedhæftningen fandt sted mellem HS-578T celler og SVEC4-10 celler, som var ubehandlet eller behandlet med IgG
2A isotypekontrolantistof når forskydningsspænding nåede 2,7 dyn /cm
2 (fig 4C;. D , c). Også, blev påvist ingen signifikante forskelle i den rullende adfærd MCF-7 celler til SVEC4-10 celler (Fig 4C,. D, d).
HS-578T og MCF-7 celler blev perfunderet løbet COS- 7
Lyve-1 (+) og COS-7
Lyve-1 (-) celler ved væg forskydningsspændinger på 0,1, 0,4, 2,7, 5,4 eller 13,54 dyn /cm
2 i 2 min. (A) Antallet af adhærente celler i det samme område er vist som blå kugler. (B) Resultaterne er vist som den relative celle numre af HS-578T-celler (a) og MCF-7 celler (b) fanget af COS-7
Lyve-1 (+) (rød linje) til COS-7
Lyve-1 (-) (blå linje) celler. HS-578T og MCF-7-celler blev perfunderet over en konfluent monolag af SVEC4-10 celler før og efter blokering med Lyve-1-antistof, isotype antistof ved væg forskydningsspændinger på 0,1, 0,4, 2,7, 5,4 eller 13,54 dyn /cm
2 i 2 min. (C) Antallet af adhærente celler i det samme område er vist som blå kugler. (D) Resultaterne er vist som den relative celle numre af HS-578T-celler (c) og MCF-7 celler (d) fanget af SVEC4-10 celler blokering med Lyve-1 (blå linje), SVEC4-10 celler blokering med isotypekontrol (rød linje) til SVEC4-10 celler uden behandling (sort linje). Fejlsøjlerne repræsenterer middelværdien ± SD af antallet af celler bundet. Data er repræsentative for 3 uafhængige forsøg.
High HA-udtrykkende cancerceller Form hyaluronan Kabel Structures
HA-kabler kan have den samme kapacitet for at aktivere Lyve-1 som deres evne til at aktivere CD44 in vivo [18], og vores resultater samt resultaterne af tidligere rapporter viste, at nogle tumor overflader indeholder høje niveauer af HA. Det var imidlertid uklart, om HA på overfladen af tumorceller udvikler sig til kabel strukturer og spille en rolle i aktivering Lyve-1. Derfor forsøgte vi at bruge immunofluorescens til påvisning HA kabler på overfladen af tumorceller. Indtil tumorcellerne nået 100% konfluens, blev biotinyleret HABP tilsat til cellerne for at detektere HA distribution. Resultaterne viste, at brystcancerceller HS-578T og BT-549, lungecancer 95-D-celler, cervikal carcinoma HeLa-celler, colon cancer RKO-celler og lungeadenocarcinom A549-celler alle indeholder høje niveauer af HA og udvikle kabelstrukturer (Fig . 5), som blev tidligere rapporteret at forekomme i HK2 celler. Efter at have brugt Streptomyces hyaluronidase at nedbryde HA på tumor overflade blev HA-kabler hK2 celler forsvundet (fig. 5). Ligeledes blev HA kabler på de andre celler også afskaffet af Streptomyces hyaluronidase fordøjelse (data ikke vist). HA-kabler blev heller ikke påvist i MCF-7-celler, som har lave niveauer af overflade HA.
konfluent monolag celler blev dyrket i nærvær af 10% (v /v) FCS før fiksering med methanol og påvisningen af HA ved tilsætning af bHABP. Sektionerne blev afbildet ved inverteret fluorescens mikroskopi (× 20 mål). HA kabler er fremhævet med hvide pile. Original forstørrelse × 20. Streptomyces hyaluronidase blev tilsat til cellerne før fiksering. De HA-kabler blev nedbrudt uden afsløring.
Diskussion
Denne undersøgelse har vist, at HA-medieret mekanisme regulerer vedhæftning af tumorceller til lymfeknuder endotelceller. En signifikant forskel blev observeret i vedhæftning af brystcancer-cellelinie HS-578T, som udtrykker høje niveauer af HA, med COS-7
Lyve-1 (+) celler; i modsætning hertil COS-7
Lyve-1 (-) celler transficeret med kontrolvektor pEGFP-N1 udviste ikke denne ændring under både statiske og strømningsmæssige forhold. MCF-7 celler, der mangler HA på deres overflade klæbet på samme måde til COS-7
Lyve-1 (+) celler COS-7
Lyve-1 (-) celler. En lille ændring blev også påvist i adhæsionen af HS-578T celler til SVEC4-10 celler før og efter tilsætningen af blokerende antistof. Disse resultater antyder, at HA på tumoren overflade kan deltage i bryst- tumormetastase ved at påvirke binding med Lyve-1 på lymfekar endotelceller.
Tidlig metastase til lymfeknuder er en hyppig komplikation i human brystcancer. Ifølge tidligere rapporter, vi screenede HA på 6 typer af brystkræftceller, de meget metastatiske cellelinier HS-578T [19], [20] og MDA-MB-231 [21], [22], [23], den moderat metastatiske cellelinier MDA-MB-435s [21], [23] og MDA-MB-468 [24], [25], og den lave eller ingen metastatiske cellelinier MCF-7 [23], [25], [ ,,,0],26] og SK-BR-3 [19], [27] gennem en klassisk udelukkelse partikel assay en immunfluorescens eksperiment, og flowcytometrianalyse. Overensstemmelse med tidligere rapporter [28], fandt vi, at HS-578T og MDA-MB-231-celler indeholder høje niveauer af HA på deres overflade, mens HA-niveauer på overfladen af MDA-MB-435s, MDA-MB-468, MCF -7, og SK-BR-3-celler blev knap nok detekteret. HA på tumoren overflade har vist sig at være associeret med tumor lymfe metastase; derfor, vi overvejet, om og hvordan HA stede på tumoren overflade deltager i denne proces. For yderligere at undersøge den biologiske funktion af HA i tumor lymfe metastase, valgte vi høje HA-udtrykkende celler HS-578T og lav HA-udtrykkende MCF-7-celler til at undersøge, om HA påvirkninger kapaciteten af tumorceller til at klæbe til COS-7
Lyve-1 (+) celler og SVEC4-10 celler.
Lyve-1, en celleoverfladereceptor for HA i lymfatisk endotel, har vist sig at være korreleret med en høj frekvens af regional lymfeknudemetastaser [29], [30]. Forskere fra andre laboratorier har vist, at peritumorale lymfekar i nogle typer carcinoma indeholde tumor emboli dekoreret med hyaluronan inden i hulrummet, og de foreslog at tumorceller inden drænende lymfekar kan binde HA, forårsager en interaktion med karvæggen via CD44 /HA /Lyve-1 interaktion [31]. Til direkte undersøge, om Lyve-1-HA vekselvirkning påvirker tumor lymfeknuder metastase, undersøgte vi den klæbende evne af tumorceller (forskellige HA-indhold) til Lyve-1-positive celler. Vores statiske adhæsionsassay afslørede, at Lyve-1 øger adhæsionen af HS-578T celler til COS-7-celler via hyaluronan, som tidligere blev rapporteret [16]. Men hvorvidt lavt HA-indhold i tumorceller frembringer en interaktion med Lyve-1, gennem andre faktorer til at påvirke tumorcelleadhæsion er stadig uklar. Vi udførte også en statisk vedhæftning eksperiment med MCF-7-celler og COS-7
Lyve-1 (+) og COS-7
Lyve-1 (-) celler. Den foreliggende undersøgelse viste, at Lyve-1 forøgede ikke adhæsionen af MCF-7-celler, der mangler HA på deres overflade til COS-7-celler. Desuden at bedste model adhæsionen af tumorceller til lymfe endotelceller, vi anvendte SVEC4-10 celler til at gentage adhæsion. Kun en let reduktion blev set efter brug af blokerende antistof, som kan være forårsaget af begrænsede interaktioner med HA og Lyve-1 på SVEC4-10 celler. Tilsammen tyder disse resultater på, at forskellige niveauer af HA på tumorceller påvirke deres metastaser i lymfesystemet. De høje HA niveauer på HS-578T-celler fremme binding til Lyve-1 og adhæsion, og cellerne kan endda være trukket ind i lymfesystemet.
Den rullende interaktion er en forudsætning for dannelsen af høj styrke intermolekylære bindinger og fast vedhæftning [32]. For at bestemme stabiliteten af adhæsive interaktioner, er hydrodynamisk in vitro strømningskammeret eksperimenter ofte brugt [33], [34]. I den foreliggende undersøgelse at undersøge effekten af flow på klæbeevnen af HA
high-HS-578T-celler og HA
lav-MCF-7-celler til COS-7
Lyve-1 (+) og COS-7
Lyve-1 (-) celler, blev cellerne eksponeret for progressivt stigende væske forskydningsspænding. Resultaterne viste, at HA interaktioner med Lyve-1 var moderat stærk i mediering adhæsion under betingelser med fysiologiske forskydningsspændinger ved 2,7 dyn /cm
2. Faste adhæsion blev defineret som cellers evne til at modstå løsrivelse på en væg forskydningsspænding på 10 dyn /cm
2, som tidligere rapporteret [33]; derfor er antallet af adhærerede HS-578T-celler faldet som stress steg til 13,54 dyn /cm
2, men de stadig forblev delvist bundet til COS-7
Lyve-1 (+) celler sammenlignet med COS-7
Lyve-1 (-) celler. Endvidere viste resultaterne, at HA interaktioner med Lyve-1 på SVEC4-10 celler var svagt i forhold til interaktionen med COS-7-celler, fordi antallet af adhærerede HS-578T celler åbenbart faldt under fysiologiske forskydningsspænding ved 2,7 dyn /cm
2. Disse resultater antyder, at HA fremmer en relativt svag og forbigående adhæsion af tumorceller til lymfe endotelceller ved interaktion med Lyve-1, som også kan foreslå deres roller i tumorceller rullende langs endotel under lymfe flow. Som en kontrol, HA
lav-MCF-7-celler blev også udsat for COS-7-celler og SVEC4-10 celler, men ingen signifikante ændringer i adhæsion adfærd MCF-7-celler til begge celler blev observeret ved enhver given shear kraft.
Forskning udført af Jackson GD [35] viste, at Lyve-1 funktionelt var “tavshed” i en celle-specifik måde, og at HA-protein-komplekser, såsom HA-kabler kan have den samme kapacitet til at aktivere Lyve -1 som evnen til at aktivere CD44 in vivo [36], [37], [38]. For første gang, den aktuelle undersøgelse dokumenterer for distribution og morfologi af HA på tumor celle overflader. Vores undersøgelse viste, at der findes HA kabler på nogle tumor celleoverflader og at HA krydses som kabler på celleoverfladen af tumorer kan aktivere Lyve-1. Men baseret på de resultater, der er offentliggjort af Jung San Huang, HA stimulerer kontraktion af ER netværk i lymfatiske endotelceller i et Lyve-1-afhængig måde [39], og det menes, at HA binder til Lyve-1 i lymfeknuder endotel celler, hvilket var i overensstemmelse med vores resultater. Disse modsætninger kan tilskrives de forskellige detektionsmetoder, der anvendes i undersøgelserne. Ikke desto mindre kan HA på overfladen af tumorceller påvirke tumor vedhæftning gennem interaktioner med Lyve-1 findes på lymfeendotelceller.
Som konklusion, at resultaterne giver os mulighed for bedre at forstå mekanismen bag reguleringen af HA på tumor celleoverfladerne og adhæsionen af tumorceller. HA på tumorceller medierer deres vedhæftning gennem lymfe endothelcelle HA receptor Lyve-1. Vedhæftning styrke afhænger af mængden af HA stede på tumorcellerne; Men denne mekanisme kun spiller en rolle i begyndelsen af processen, og mange spørgsmål er stadig uklare. For eksempel er det uvist, om tumorcelleoverfladen HA er relateret til HA syntetisk enzym, HA nedbrydende enzym eller andre molekyler. Det er også uklart, om HA-kabler aktiverer Lyve-1 på lymfekar. Yderligere arbejde på dette område er i gang i vores laboratorium.
Materialer og metoder
Reagenser og tilbehør
Biotinyleret HABP (hyaluronan bindende protein, HABP) blev købt hos Merck (Darmstadt , Tyskland). TRITC-mærkede avidin blev opnået fra Boster (Wuhan, Kina). Alexa Fluor® 488 streptavidin blev erhvervet fra Life Technologies (Carlsbad, USA). Muse Lyve-1-antistof og rotte-IgG
2A isotypekontrol blev indkøbt fra R & D Systems (Minneapolis, USA). DMEM, RPMI-1640, L-15 og F-12k blev erhvervet fra Gibco (Stockholm, Sverige). Føtalt bovint serum (FBS) blev opnået fra Hyclone (Lanzhou, Kina). En Chamlide SC-shear stress kammer blev opnået fra levende celler Instruments (Seoul, Korea).
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.