PLoS ONE: udskilt protein sure og Rig på cystein (SPARC) Undertrykker Angiogenese af Down-regulerer ekspressionen af ​​VEGF og MMP-7 i gastrisk Cancer

Abstrakt

Baggrund

udskilt protein surt og rig på cystein (SPARC) er et glycoprotein, der fungerer til at inhibere angiogenese, proliferation og invasion i forskellige typer af cancer. Evnen hos SPARC at modulere neovaskularisering menes at være medieret delvist af dens evne til at modulere ekspressionen af ​​vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) og matrixmetalloproteinaser (MMP’er). I denne undersøgelse, vi havde til formål at bestemme effekten af ​​SPARC-ekspression i mavens kræftceller på proliferation og angiogenese

in vitro

in vivo

.

Metode

Vi evaluerede udtryk for SPARC i syv humane gastrisk cancer cellelinjer. Derefter etablerede vi et stabilt transficeret SPARC overudtrykt cellelinie (BGC-SP) og en stabilt transficeret SPARC-knockdown cellelinie (HGC-sh). Effekten af ​​SPARC overekspression og SPARC lyddæmpning blev undersøgt ved at undersøge kapillær dannelse af HUVEC’er

in vitro

og en dorsal hudfoldens kammer model

in vivo

. Kvantitativ realtids-PCR og western blotting blev udført for at detektere, om udtrykkene for VEGF og MMP-7 blev moduleret af SPARC ekspression. For yderligere at bestemme virkningen af ​​SPARC ekspression på angiogenese

in vivo

, xenograftmodeller blev etableret og mikrokar densitet (MVD) af forskellige kloner blev påvist ved immunhistokemi.

Resultater

endogen SPARC overekspression inhiberede ekspressionen af ​​VEGF og MMP-7, samt angiogenese induceret af BGC-SP-celler. Tilsvarende SPARC lyddæmpning forøget ekspression af VEGF og MMP-7, samt angiogenese induceret af HGC-SH-celler. Forhøjet angiogenese induceret af SPARC tavshed i HGC-sh celler blev nedsat, når VEGF blev neutraliseret af antistoffer, og MMP-7 blev slået ned

in vitro

.

Konklusion

SPARC undertrykker angiogenese af gastrisk cancer ved nedregulering af ekspressionen af ​​VEGF og MMP-7

Henvisning:. Zhang JL, Chen GW, Liu YC, Wang PY, Wang X, Wan YL et al. (2012) udskilt protein Sure og Rig på cystein (SPARC) Undertrykker Angiogenese af Down-regulerer ekspressionen af ​​VEGF og MMP-7 i Gastric Cancer. PLoS ONE 7 (9): e44618. doi: 10,1371 /journal.pone.0044618

Redaktør: Rajesh Mohanraj, UAE University, De Forenede Arabiske Emirater

Modtaget: 9. juni 2012; Accepteret: August 6, 2012; Udgivet: September 5, 2012 |

Copyright: © Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af National Natural Science Foundation of China (nr 30.901.417 /H1617). https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Blandt kræftrelaterede dødsfald, mavekræft andenpladsen på verdensplan efter lungekræft; næsten to tredjedele af tilfældene forekommer i udviklingslandene, herunder 42% fra Kina [1]. Angiogenese er en kritisk proces i gastrisk cancer; Derfor er regulatoriske og signalmolekyler, som modulerer angiogenese blive fokus for nuværende forskning. Angiogenese er ikke en aktiv proces i sig selv; den styres af nogle angiogene faktorer og nogle inhibitorer af angiogenese.

udskilt protein sure og rig på cystein (SPARC), også kendt som osteonectin eller BM-40, er et mangesidet secerneret glycoprotein, som udtrykkes ved mange forskellige typer af celler og er forbundet med knogledannelse, fibrose og vævsheling.

Nylige undersøgelser viser, at SPARC modulerer proliferation, apoptose, invasion og angiogenese i forskellige typer af cancerceller, men rolle SPARC i tumorigenese er kompliceret og synes at være celletypespecifik grund af sine forskellige funktioner i et givet mikromiljø [2]. SPARC fungerer som en tumorsuppressor i bryst, neuroblastom, pancreas, æggestokkene og lungekræft [3]. Ovariecancer i SPARC-null mus voksede betydeligt større end i vildtype-dyr med augmented niveauer af vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) og matrixmetalloproteinaser (MMP’er) [4]. Ved at undertrykke tumorvaskularitet gennem suppression af VEGF-ekspression og sekretion, SPARC inhiberede gliom vækst [5]. SPARC binder til VEGF og derved inhibere VEGFR phosphorylering, mitogenaktiverede proteinkinaser (MAPK) aktivering og VEGF-induceret DNA-syntese [6]. Imidlertid rolle SPARC i angiogenese er også celletypespecifik, som ændrer signaltransduktionshændelser i afhængighed af unikke cellulære miljøer [7].

VEGF stimulerer angiogenese og er det vigtigste signal protein produceret af celler [8]. MMP’er spiller vigtige roller i tumorudvikling, ikke kun i nedbrydning af ekstracellulær matrix, men også i reguleringen af ​​angiogenese. MMP-7, som er den mindste molekylvægt på alle MMP familiemedlemmer, har vist sig at fremskynde proliferation af humane navlestrengsveneendotelceller (HUVEC’er) i en dosis-afhængig måde

in vitro

[9].

Den primære funktion af SPARC i angiogenese af gastriske cancer cellelinjer fortsat uklart. Derfor i denne undersøgelse har vi den hypotese, at SPARC kan modulere proliferation og angiogenese ved at regulere VEGF og MMP-7 udtryk i gastriske cancerceller. For at teste disse hypoteser, testede vi udtryk for SPARC i syv gastrisk cancer cellelinjer. Så, for at vurdere effekten af ​​ændrede SPARC på mavens kræftceller, vi etableret et BGC-SP klon, som overudtrykt SPARC og en HGC-sh-klon, hvor den endogene SPARC blev slået ned.

Resultater

Angivelse af SPARC i dyrkede Gastric cancer Cells

Vi evaluerede udtryk for SPARC i flere humane gastrisk cancer cellelinjer. Western blotting viste, at SPARC var undectable i AGS, MKN45, NIC-N87 og BGC-823-cellelinjer, men SGC-7901 cellelinie udtrykte lavt niveau af SPARC og HGC-27, MGC-803 cellelinjer udtrykte højt SPARC ( Figur 1A).

(A) SPARC proteinekspression i 7 typer af gastrisk cancercellelinier. (B) SPARC protein (øvre felt) og mRNA (nederste panel) ekspression i parentale celler (BGC-P og HGC-P), tom vektor transficerede kloner (BGC-EV og HGC-EV), SPARC cDNA-udtrykkende klon (BGC -SP) og SPARC shRNA-udtrykkende klon (HGC-sh). GAPDH tjente som lastning kontrol. (C) Celleproliferation blev bestemt ved MTT-assayet. BGC-P og HGC-P-celler og transficerede kloner (500 celler) blev dyrket i plader med 96 brønde og inkuberet i 8 dage, og celleproliferation blev analyseret ved MTT-metoden. Resultaterne er vist som middel (± SD) af firdobbelte bestemmelser fra seks separate forsøg.

Overekspression og Hæmning af endogen SPARC i gastrisk cancer cellelinjer

Western blotting viste, at 43 kDa bånd svarende til SPARC protein blev signifikant forøget i BGC-SP (BGC celler, der udtrykker SPARC cDNA) celler sammenlignet med parentale (BGC-P) og kontrol-celler transficeret med tom vektor (BGC-EV) (P 0,05); SPARC blev hæmmet af næsten to tredjedele i HGC-sh celler (HGC celler, der udtrykker SPARC-shRNA) sammenlignet med HGC-P og HGC-EV-celler (P 0,05, figur 1B). RT-PCR viste, at SPARC mRNA-ekspression i BGC-SP-celler blev forøget i sammenligning med BGC-P og BGC-EV-celler (P 0,05); SPARC mRNA-ekspression i HGC-sh faldt med næsten 80% i forhold til HGC-P og HGC-EV-celler (P 0,05, figur 1B).

SPARC Overekspression Fald spredning af mavekræft cellelinier

for at afgøre, om ændret SPARC udtryk påvirket udbredelsen af ​​gastrisk cancer cellelinjer, blev væksten af ​​transfekterede celler sammenlignet med de forældre og tomme vektor kontrol. Dataene viste, at væksten af ​​BGC-SP-celler blev inhiberet i sammenligning med BGC-P og BGC-EV-celler efter 8 dages dyrkning (P 0,05); væksten af ​​HGC-sh celler blev øget en smule i forhold til HGC-P og HGC-EV-celler (P 0,05, figur 1C).

SPARC Overekspression i Gastric Cancer Cell Lines Reducerer angiogenese

in vitro

og

in vivo

for at forstå effekten af ​​ændret SPARC udtryk på angiogenese i gastrisk cancer cellelinjer, blev HUVEC’er inkuberet i konditionerede medier. Den BGC-SP supernatant induceret HUVEC’er til at differentiere til kapillære-lignende strukturer inden for 36 timer (2564,5 ± 553,1 um, P 0,05) i mindre grad end supernatanten fra BGC-EV-celler (5002,4 ± 665,7 um) og BGC-P-celler (5417,3 ± 784,25 um, figur 2A). Den HGC-sh supernatant induceret HUVEC’er til at differentiere til kapillær-lignende strukturer inden for 36 timer (7024,9 ± 923,1 um, P 0,05) til en stærkere grad end supernatanten fra HGC-EV-celler (4456,2 ± 554,2 um) og HGC-P celler (4023,4 ± 665,2 um, figur 2A). Kvantificering af den gennemsnitlige rørlængde indikerede, at rørlængde på HUVEC’er i konditioneret medium fra BGC-SP blev reduceret med ca. 52,7% i forhold til kontrolceller; rørlængde på HUVEC’er i konditioneret medium fra HGC-sh kloner blev forøget 74,6% i forhold til kontrolceller (figur 2A)

(A)

In vitro

angiogenese:. HUVEC’er blev podet i Matrigel -belagt plader med 96 brønde inkuberet med supernatant høstet fra BGC-P og HGC-P-celler eller transficerede kloner. Cellerne fik lov til kultur i 36 h på Matrigel i betinget medier. Virkningerne af konditionerede medier på kapillær dannet af HUVEC’er blev analyseret, og det kapillære længde blev målt. Kapillær længde viste data er middel (± standardafvigelse.) Af firdobbelte bestemmelser fra tre separate forsøg. * P 0,05, signifikant forskel fra kontrolceller. (B)

In vivo

angiogenese: BGC-P, BGC-EV, BGC-SP, HGC-P, HGC -EV, eller HGC-sh (1 × 10

6), blev implanteret i diffusion kamre og kirurgisk placeres under den dorsale hud af athymiske nøgne mus. PV, allerede eksisterende kar; TN, tumor-induceret vaskulatur. Nydannede skibe blev kvantificeret og repræsenteret som pr felt. Kolonner er middelværdier (± standardafvigelse.) I firdobbelte felter fra tre separate forsøg. * P. 0,05, signifikant forskel fra kontrol celler

Den dorsale vindue model viste, at BGC-SP celler havde et fald i tumor-induceret mikrokar 40,4% i forhold til kontrol-celler (P 0,05) . HGC-SH-celler i den dorsale hud-fold kammer resulterede i en stigning 73,2% i tumorinduceret mikrokar, med et større antal små blødende pletter i sammenligning med kontrolceller (P 0,05 Figur 2B). Disse resultater viste klart, at SPARC overekspression i mavekræft hæmmede angiogenese

in vitro

in vivo

.

Den MAPK’er Signalering Pathway og ekspression af VEGF og MMP-7 hæmmes ved SPARC overekspression

for at bestemme virkningen af ​​SPARC overekspression på MMP-7 og VEGF, kvantitativ realtids-PCR og Western blotting-assays blev udført. Resultaterne viste, at MMP-7 og VEGF-ekspression var negativt reguleret af SPARC ekspression. I BGC-SP-celler, blev niveauerne af MMP-7 mRNA, MMP-7 protein, VEGF-mRNA, og VEGF-protein inhiberet af 87,2%, 68,9%, 48,4% og 58,6%, henholdsvis i forhold til tom vektor transficerede celler. I HGC-SH-celler, MMP-7 mRNA-niveauet steg 11,6 gange, MMP-7 proteinniveauet steg 8,1 gange, VEGF mRNA-niveauet steg 8,8 gange, og VEGF-proteinniveau steg 3,2 gange sammenlignet med tomme vektor celler (figur 3A, B). For at bestemme hvorvidt MAPK signalvejen blev reguleret af SPARC, SAPK /JNK, ERK1 /2 og p-38-niveauer blev bedømt ved western blotting. Resultaterne viste, at niveauer af p-ERK1 /2 var signifikant reduceret i BGC-SP-celler og forhøjede i HGC-SH-celler i sammenligning med deres kontrolceller (figur 3C).

(A) Cellelysater blev anvendt at udføre western blotting-analyse for VEGF og MMP-7-ekspression. GAPDH tjente som lastning kontrol. Udtrykkene af VEGF og MMP-7 blev afvist på proteinniveau i BGC-SP celler. Udtrykkene af VEGF og MMP-7 blev forøget på proteinniveau i HGC-sh celler. Kolonner er middelværdier (± standardafvigelse.) Af tredobbelte eksperimenter; * P 0,05, signifikant forskel fra kontrolceller. (B) Real-time PCR blev udført til vurdering af VEGF og MMP-7 mRNA-transkript-niveauer. GAPDH tjente som en belastning kalibrering. Kolonner er middelværdier (± standardafvigelse.) Af tredobbelte eksperimenter; * P 0,05, signifikant forskel fra kontrolceller. (C) Cellelysater blev anvendt til at udføre western blotting-analyse for molekyler i MAPK signalvej. Aktiveringen af ​​ERK1 /2 blev hæmmet i BGC-SP celler sammenlignet med kontrol celler, dog ERK1 /2 blev aktiveret i HGC-sh celler sammenlignet med kontrol celler.

Knock-down af SPARC Expression i HGC-27 Cells Fremmer angiogenese via opreguleret VEGF og MMP-7 Expression

for at bekræfte, at de pro-angiogene virkninger set med nedsat SPARC udtryk skyldes øget MMP-7 og VEGF udtryk og ikke til et niveau af SPARC selv, blev HUVEC’er inkuberet i konditionerede medier høstet fra HGC-SH-celler med eksogent tilsat rekombinant human SPARC (rhSPARC, 0,3 ug /ml). Vores data indikerer, at tilsætning af eksogent SPARC ikke inhiberede kapilllærlignende strukturer af HUVEC’er sammenlignet med HGC-sh (figur 4), i modsætning til det anti-angiogene respons ses med endogen ekspression af SPARC i BGC823 celler (figur 2).

(A) konditioneret medium fra HGC-P, HGC-EV, HGC-sh med eller uden rhSPARC (0,3 ug /ml) og HGC-sh + MMP7-SH-celler blev koncentreret under de samme betingelser. β-kaseinzymografi blev udført for MMP-7 aktivitet. Western blotting-analyse blev udført for MMP-7, SPARC og VEGF proteinniveauer i konditionerede medier. Cellerne blev opsamlet og lysater probet med GAPDH-antistof til at kalibrere samlede beløb for de respektive proteiner. Kolonner er middelværdier (± standardafvigelse.) Af tredobbelte eksperimenter. (B)

In vitro

angiogenese: For at bekræfte at SPARC ekspressionsregulerende medieret antiangiogene virkninger skyldes ændret MMP-7 og VEGF-ekspression i stedet for til ekspression af SPARC selv, høstet supernatant fra HGC-SH-celler blev sat til 0,3 ug /ml rhSPARC. Supernatanter fra begge HGC-SH, og HGC-sh + MMP7-SH-celler med neutraliserende antistof mod VEGF blev også anvendt i co-kultur-assay (anti-VEGF = neutraliserende antistof til VEGF). HUVEC’er blev podet i Matrigelcoatede plader med 96 brønde inkuberet med konditionerede medier. Virkningerne af konditionerede medier på de forud dannede rør af HUVEC’er blev analyseret, og røret længde blev målt. Tube længde viste data er midlet (± standardafvigelse.) Af firdobbelte bestemmelser fra tre separate forsøg. * P 0,05, signifikant forskel fra HGC-P celler, ** P. 0,05, signifikant forskel fra HGC-sh celler

For yderligere at karakterisere rolle VEGF og MMP-7 i SPARC- medieret angiogenese modulation, MMP-7-shRNA og 1 ug /ml neutraliserende VEGF-antistof (Chemicon, Temacula, CA, USA) blev anvendt til HGC-sh kloner til at antagonisere funktionerne af MMP-7 og VEGF.

vi undersøgte evnen af ​​MMP-7-ekspression i HGC-SH-celler til at modulere angiogenese

in vitro

ved stabilt at transficere MMP-7-shRNA i HGC-SH-celler. Figur 4A viser, at ekspressionen af ​​MMP-7 i HGC-sh + MMP7-SH-celler blev nedreguleret ved stabilt udtrykker MMP-7-sh-RNA til et niveau, der kan sammenlignes med HGC-P og HGC-EV-celler. For at belyse den rolle, MMP-7 i knock-down SPARC-medieret fremme af tumorcelle-induceret angiogenese udførte vi kapillærdannelse analyse med konditionerede medier af HGC-SH-celler og HGC-sh + MMP7-SH-celler. Som vist i figur 4B, resultater viser, at faldet MMP-7-ekspression i HGC-sh + MMP7-SH-celler førte til en signifikant nedsat kapillær-dannelse ved HUVEC’er

in vitro

(HGC-sh + MMP7-sh

vs

HGC-sh, P. 0,05)

for at bestemme funktionen af ​​forhøjede VEGF-ekspression induceret af SPARC lyddæmpning, VEGF i de konditionerede medier af HGC-sh og HGC-sh + MMP7-sh celler blev neutraliseret ved VEGF-antistof (1 pg /ml). Resultaterne viste, at kapillær dannelse af HUVEC’er blev reduceret betydeligt i HGC-sh supernatant indeholdende VEGF neutraliserende antistof sammenlignet med supernatant fra HGC-SH-celler alene (HGC-sh + anti-VEGF

vs

HGC-sh, P 0,05 figur 4B). Kapillær dannelsen af ​​HUVEC’er var næsten helt hæmmet, når de dyrkes i konditioneret medier HGC-sh + MMP7-sh celler plus tilføjede VEGF neutraliserende antistof (

vs

HGC-sh, P 0,05 figur 4B).

serumfrie konditionerede medier høstet fra HGC-P, HGC-EV, HGC-sh med eller uden rhSPARC (0,3 ug /ml) og HGC-sh + MMP7-SH-celler blev koncentreret ved ultrafiltrering rør (Millipore, Bedford, MA , USA) under samme betingelser. Western blotting viste, at koncentrationen af ​​SPARC i HGC-SH-celler med 0,3 ug /ml rhSPARC inmedium var lig med den for HGC-P supernatant (figur 4A).

Overekspression af SPARC i gastrisk cancerceller Hæmmer tumorigenicitet i nøgne mus

for at vurdere den terapeutiske effekt af SPARC udtryk BGC-P, BGC-EV, BGC-SP celler eller HGC-P, HGC-EV, HGC-sh celler blev injiceret subkutant i nøgne mus. Der var ingen signifikant forskel i størrelse mellem BGC-P (n = 6; betyde tumorvolumen = 2004 ± 63 mm

3), BGC-EV (n = 6; betyde tumorvolumen = 1856 ± 69 mm

3 ) xenografter. Et signifikant fald (39,1%) i gennemsnitlig tumorvolumen blev fundet i dyr implanteret med BGC-SP xenotransplantater (n = 6; betyde tumorvolumen = 1130 ± 55 mm

3) sammenlignet med dyr implanteret med BGC-EV xenografter ( P 0,05, figur 5). Der var ingen signifikant forskel i størrelse mellem HGC-P (n = 6; betyde tumorvolumen = 1605 ± 63 mm

3), HGC-EV (n = 6; betyde tumorvolumen = 1708 ± 82 mm

3 ) xenografter. En signifikant stigning (50,3%) i gennemsnitlig tumorvolumen blev fundet i dyr implanteret med HGC-sh xenotransplantater (n = 6; betyde tumorvolumen = 2412 ± 75 mm

3) sammenlignet med dyr implanteret med HGC-EV xenografter ( P. 0,05, figur 5)

(A) paraffinindlejrede sektioner af xenotransplanterede tumorer blev anvendt til immunhistokemisk analyse af SPARC, MMP-7, VEGF, og CD-31. (B) Snit blev farvet med et monoklonalt antistof mod human SPARC, VEGF, MMP-7. Sum densiteter blev beregnet og analyseret ved IPP 6.0. Kolonner er middel (± standardafvigelse.) Af firdobbelte bestemmelser fra seks mus i hver gruppe. * P 0,05, signifikant forskel fra kontrolceller. (C) MVD i tumorvæv blev kvantificeret ved at tælle CD31-positive områder i hvert mikroskopisk synsfelt. Kolonner er middel (± standardafvigelse.) Af firdobbelte bestemmelser fra seks mus i hver gruppe. * P 0,05, signifikant forskel fra kontrolceller. Tumoren volumen blev beregnet (volumen = bredde

2 × længde × 0,52). Mængden af ​​tumorer på den 50. dag angives med middelværdierne (± SD) af seks mus i hver gruppe, * P. 0,05, signifikant forskel fra kontrol celler

For at vurdere SPARC, VEGF , MMP-7 udtryk

in vivo

, xenograft snit blev farvet med et monoklonalt antistof mod human SPARC, VEGF eller MMP-7. Figur 5A viser, at BGC-SP tumorer udtrykker mere SPARC end BGC-P, BGC-EV tumorer, mens samtidigt VEGF, er MMP-7 udtryk reduceret (P 0,05, figur 5A). Sektioner fra HGC-sh tumorer udtrykker mindre SPARC end HGC-P, HGC-EV tumorer mens samtidigt VEGF, er MMP-7 udtryk forøget (P 0,05, figur 5A). CD31 anvendes primært til at demonstrere tilstedeværelsen af ​​vaskulære endotelceller i histologiske vævssnit, som kan hjælpe til at vurdere graden af ​​tumor angiogenese. For at vurdere, om ændret SPARC udtryk medieret af mikrokar densitet (MVD), analyserede vi angiogenese i xenotransplantater ved histologisk analyse af CD-31. Der var ingen signifikant forskel i MVD mellem BGC-P (12,5 ± 2,3 mikrokar /0,145 mm

2), BGC-EV (11,5 ± 3,4 mikrokar /0,145 mm

2) xenotransplantater. MVD blev reduceret 54,8% i BGC-SP (5,2 ± 2,1 mikrokar pr /mm

2) tumorer i forhold til BGC-EV tumorer (P 0,05, figur 5). Der var ingen signifikant forskel i MVD mellem HGC-P (6,4 ± 2,1 mikrokar /0,145 mm

2), HGC-EV (6,9 ± 1,8 mikrokar /0,145 mm

2) xenotransplantater. MVD blev forhøjet 51,7% i HGC-sh (10,5 ± 1,5 mikrokar /0,145 mm

2) tumorer sammenlignet med HGC-EV tumorer (P 0,05, figur 5)

Diskussion

SPARC er en vævsspecifik protein, der påvirker flere celleprocesser, herunder proliferation, invasion, og angiogenese variabelt i forskellige typer af væv. For eksempel tidligere undersøgelser vist, at SPARC fremmet invasionen mens samtidig inhibering af væksten af ​​tumorer [5], [10]. I medulloblastom, kan overekspressionen af ​​SPARC hæmme angiogenese i tumoren ved at sænke ekspression og sekretion af VEGF og MMP-9 [11]. I melanom imidlertid ekspressionen af ​​SPARC var positivt korreleret med angiogenese [12]. Funktionen af ​​SPARC i gastriske kræftceller fortsat uklart.

For at undersøge den rolle, SPARC i gastrisk kræft, vi først testet udtryk for SPARC i syv cellelinier af mavekræft. De fleste cellelinjer gav ikke udtryk for, eller kun udtrykt lavt niveau af SPARC. For at bestemme den rolle, SPARC i væksten og angiogenese af gastrisk cancer etablerede vi BGC-SP klonen som stabilt transficeret med en SPARC cDNA vektor og HGC-sh klon som stabilt transficeret med en shRNA vektor målretning SPARC mRNA. SPARC udtryk steg markant i BGC-SP-klon og faldt i HGC-sh-klon i forhold til deres respektive kontrol-kloner, som bestemt ved western blotting og RT-PCR-analyser. Celleproliferation var lavere i BGC-SP-klon, og var højere i HGC-sh klon end i deres respektive kontrol kloner ved MTT metoden. Vi fandt også, at overekspression af SPARC hæmmede tumor celle-induceret kapillær dannelse af HUVEC’er

in vitro

og angiogenese i dorsale vindue assay

in vivo

. På den anden side, nedregulering af SPARC af mRNA interferens fremmet kapillær dannelse

in vitro

angiogenese

in vivo

.

Blodkar er afgørende for at levere næringsstoffer til væv . Derfor neovaskularisering er uundværlig for udviklingen af ​​fast tumor. Tidligere undersøgelser har vist, at SPARC spiller en rolle i angiogenese [7]. Vores resultater viste, at overekspression af SPARC hæmmede angiogenese

in vitro

in vivo

i forbindelse med nedgangen i MMP-7, VEGF og phosphoryleret ERK1 /2, mens nedregulering af SPARC forfremmet angiogenese

in vitro

in vivo

i forbindelse med forøgelsen af ​​MMP-7, VEGF og phosphoryleret ERK1 /2.

Vi yderligere implementeret studier for at undersøge den rolle, VEGF og MMP-7 i SPARC-medieret angiogenese modulation. Når rekombinant humant SPARC protein blev tilsat til konditioneret medium fra HGC-sh klon til at genoprette SPARC koncentration, dette konditionerede medium ikke ændre den kapillære dannelse af HUVEC’er af

in vitro

assay sammenlignet med den kapillære dannelse af HUVEC’er inkuberet i betingelsen medie uden eksogent rhSPARC. Vi derefter brugt MMP-7-shRNA at nedregulere MMP-7-ekspression i HGC-sh klon, og /eller anti-VEGF-antistof til at neutralisere VEGF i konditioneret medium fra HGC-sh klon. Kapillærdannelse af HUVEC’er blev inhiberet signifikant, når de inkuberes i de konditionerede medier med lavere MMP-7 og /eller blokeret VEGF. Disse eksperimenter antyder, at SPARC nedregulering alene er utilstrækkelig til fremkaldelse af neovaskularisering og andre faktorer skal inddrages i denne proces.

VEGF spiller en central rolle i angiogenese, og er nødvendigt for overlevelse af endotelceller [8]. I gliom, SPARC inhiberede tumorvækst ved at ændre dets mikromiljø og undertrykke sin angiogenese gennem inhibering af VEGF-ekspression og sekretion [5]. Der kan være en negativ sammenhæng mellem SPARC og VEGF udtryk, dvs., jo mere SPARC, jo mindre VEGF eller

omvendt

[13], [14].

MMP-7 er i stand til nedværdigende basalmembran eller bindevæv omkring skibene. Det stimulerer også DNA-syntese i dyrkede vaskulære endotelceller, og inducerer angiogenese på det sted, hvor coloncancer-celler blev implanteret i en musemodel [15]. VEGF og andre angiogene faktorer fungerer primært gennem MAPK signalveje, som menes at være vigtige transduktionsveje involveret i neovaskulariseringen processer i tumorer [8]. Vores seneste undersøgelse viste, at MMP-7-ekspression blev moduleret via aktivering af MAPK signalveje [16]. Flere undersøgelser viste også, at SPARC negativt modulerede aktiveringen af ​​MAPK pathways [17]. Derfor kan SPARC udtryk ændre den angiogene balance i tumorer ved at nedregulere en række neovaskularisering fremme faktorer.

For at undersøge funktionen af ​​SPARC i reguleringen af ​​gastrisk kræft vækst

in vivo

, BGC-SP og HGC-sh cellekloner blev sammenlignet med deres kontrol kloner for deres evne til at danne tumorer i et subkutant model. SPARC overekspression reducerede signifikant størrelsen af ​​xenotransplanteret tumor med reduceret MVD, nedregulering af SPARC af RNA-interferens fremmet væksten af ​​xenotransplanteret tumor med øget MVD. Derfor, i gastrisk cancer-xenotransplantater, SPARC ekspression er negativt korreleret med angiogenese. Tidligere undersøgelser indikerede, at SPARC bidrog til regulering af tumor dannelse, selv om dens rolle syntes at være celletypespecifik. I hepatocellulære cancercelle-line xenotransplantater, SPARC overekspression betydeligt forsinket tumordannelse reduceret tumorstørrelse og nedsat MVD i sammenligning med kontrol xenografter [18]. I tyktarmskræft væv, blev SPARC udtryk negativt korreleret med VEGF udtryk og MVD [19]. I medulloblastom celler, SPARC overekspression hæmmede angiogenese fører til faldet af tumorvækst [11]. I humane mikrovaskulære endotelceller, SPARC inhiberede DNA-syntese

in vitro

[6]. I neuroblastomceller xenotransplantater, SPARC-peptider inhiberede angiogenese og tumorvækst

in vivo

[20]. Disse resultater bekræftede SPARC som en inhibitor af tumorangiogenese

in vivo

.

SPARC udtrykker i normale gastriske epitelceller, gastriske cancerceller, og stromacellerne omgivende gastrisk cancer på et lavere niveau [21 ]. En immunhistokemisk undersøgelse viste, at SPARC hovedsagelig udtrykkes i stromaceller omgiver tumoren [22]. Disse uoverensstemmelser kan ikke fuldt ud forklares. SPARC ekspression kan afhænge af histologisk type tumor, eller

omvendt

. Seneste immunhistokemi undersøgelse viste, at SPARC udtryk negativt var korreleret med ekspressionen af ​​VEGF og MVD i mavekræft væv, og SPARC udtryk faldt i mavekræft med højere grad af malignitet [23].

Sammenfattende væksthæmning af gastrisk cancer ved SPARC synes at være medieret gennem sine suppression virkninger på MMP-7 og VEGF udtryk, som igen kan hæmme mikrokar infiltration i tumorer. Vi konkluderer, at nedregulering af SPARC kan associere med forløbet af mavekræft, og udforskning til formål at regulere SPARC udtryk kan blive en meningsfuld tilgang til at forbedre mavekræft behandling.

Materialer og metoder

Antistoffer og reagenser

Antistoffer mod SPARC (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), (p-) SAPK /JNK, (p-) ERK1 /2, (p-) p-38, MMP-7 (cellesignalering teknologi, Danvers, MA, USA), VEGF, og CD31 (Abcam, Cambridge, MA, USA) blev anvendt til western blotting og immunhistokemi. Den rhSPARC blev leveret af R 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.