PLoS ONE: Finindstilling roller Endogen Brain neurotrofisk faktor, TrkB og Sortilin i Kolorektal Cancer Cell Survival

Abstrakt

Baggrund

neurotrophin receptorer blev oprindeligt identificeret i nerveceller. De blev for nylig påvist i nogle kræftformer i forbindelse med invasiv, men funktionen af ​​disse tyrosinkinasereceptorer ikke tidligere undersøgt i kolorektal cancer (CRC) celler.

Metoder og Resultater

Vi rapporterer her at humane CRC cellelinier syntetisere den neurale vækstfaktor hjerne-afledt neurotrofisk faktor (BDNF) under stressbetingelser (serumudsultning). Parallelt hermed CRC celler udtrykte høj- (TrkB) og lav-affinitet (p75

NTR) receptorer på plasmamembranen, mens TrkA og TrkC, to andre høj affinitet receptorer for NGF og NT-3, henholdsvis, kunne ikke påvises. Vi viser, at BDNF-induceret celleproliferation og havde en anti-apoptotisk virkning medieret gennem TrkB som vurderet af K252a, en Trk farmakologiske inhibitor. Det undertrykte både celleproliferation og overlevelse af CRC-celler, som ikke udtrykker TrkA eller TrkC. Parallelt med forøgelsen af ​​BDNF sekretion, sortilin, et protein virker som en neurotrophin transportør samt en co-receptor for p75

NTR, blev forøget i cytoplasmaet af primære og metastatiske CRC celler, hvilket antyder, at sortilin kunne regulere neurotrophin transport i disse celler. Imidlertid pro-BDNF, også påvist i CRC-celler blev co-udtrykt med p75

NTR på cellemembranen og co-lokaliseret med sortilin. I modsætning til BDNF exogen pro-BDNF induceret CRC apoptose, hvilket tyder på, at en modvægt mekanisme er involveret i kontrollen af ​​CRC celleoverlevelse, gennem sortilin som co-receptor for p75

NTR, højaffinitetsreceptoren for pro- neurotrophiner. Ligeledes viser vi, at BDNF og TrkB udskrifter (og ikke p75

NTR) er overudtrykt i patienternes tumorer ved sammenligning med deres tilstødende normale væv, især i fremskredne stadier af CRC.

Konklusion

samlet set viser disse resultater fremhæver, at BDNF og TrkB er essentielle for CRC cellevækst og overlevelse in vitro og i tumorer. Denne autokrine løkke kunne være af stor betydning at definere nye målrettede behandlinger

Henvisning:. Akil H, Perraud A, Melin C, Jauberteau MO, Mathonnet M (2011) Finindstilling roller Endogen Brain neurotrofisk faktor , TrkB og Sortilin i Kolorektal Cancer Cell Survival. PLoS ONE 6 (9): e25097. doi: 10,1371 /journal.pone.0025097

Redaktør: Mark P. Mattson, National Institute on Aging Intramural Research Program, USA

Modtaget: Juli 6, 2011; Accepteret: August 23, 2011; Udgivet: 26 September, 2011

Copyright: © 2011 Akil et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Ligue contre le Kræft og Conseil Régional du Limousin. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

hjerneafledt neurotrofisk faktor (BDNF), et medlem af neurotrofinfamilien, vides at spille en kritisk rolle i modulering af celle overlevelse, differentiering og apoptose i nervesystemet [1].

BDNF signaler via to typer af celleoverfladereceptorer: høj-affinitet tropomyosin-relateret kinase (Trk) receptor B (TrkB), en tyrosinkinasereceptor og lavaffinitetsreceptoren (p75

NTR), samt en dødsdomæne receptor tilhører tumornekrosefaktor (TNF) receptorfamilien, en fælles receptor for alle neurotrofiner nervevækstfaktor (NGF), neurotrofin-3 (NT-3), og neurotrophin-4/5 (NT-4/5 ). Neurotrophiner syntetiseres som forstadier (proneurotrophins), som spaltes proteolytisk til modne neurotrophiner. Pro-BDNF-spaltning kan forekomme enten intracellulært ved indvirkning af furin eller proconvertase, eller ekstracellulært ved virkningen af ​​plasmin, matrixmetalloproteinase 7 (MMP-7) eller MMP-9 [2]. Både modne BDNF og pro-BDNF er biologisk aktive, med divergerende roller, der afspejler forskellige affinitet: pro-BDNF viser højere affinitet for p75

NTR, mens modne BDNF har større tilhørsforhold til TrkB

BDNF binder. den 145 TrkB fuldlængde receptor og en trunkeret gp95TrkB variant, der bevarer direkte signalering aktiviteter [3] og øger specificitet for BDNF [3], [4], [5]. Mens trk receptorer er involveret i de fleste af overlevelse og vækst egenskaber af neurotrophiner funktioner p75

NTR, omfattende undersøgt i neuroner, afhænger af neural celletype, tilstedeværelsen af ​​ligand og dets tilknytning til et samarbejde receptor. Faktisk p75

NTR forbundet med Trk co-receptor forbedrer [6] eller undertrykke neurotrofin-medieret celleoverlevelse [7]. Det blev for nylig vist at være i stand til at binde pro-BDNF og inducere celledød, når forbundet med sortilin (et medlem af Vps10p-domæne receptorer familie) [8], [9], [10].

Således , regulering af pro-BDNF forarbejdning tilføjer ekstra kontrol over balancen mellem p75

NTR og TrkB engagement [11], [12]. Den antiapoptotisk funktion af BDNF medieres selvom interaktion med høj affinitet receptorer 95 og 145TrkB [5], mens pro-BDNF inducerer apoptose via interaktion med en receptor kompleks af p75

NTR og sortilin [10], [13].

Sortilin udtrykkes i flere væv, især hjerne, rygmarv, hjerte, muskel, adipocytter [14] og B-lymfocytter [8]. Sortilin blev oprindeligt beskrevet i humane neurale celler som en intracellulær transport protein til neurotrophiner og proneurotrophins [15] og for nylig som en transportør af Trk neurotrophin receptorer i neurale celler [16]. Endvidere sortilin var også kendt som en co-receptor (NTSR3) for en G-protein-koblet receptor, idet neurotensin receptor-1 (NTSR1), der aktiveres af neurotensin [17]. Neurotensin blev oprindeligt vist at spille en rolle i væksten og overlevelsen af ​​colorektal cancer (CRC) celler, gennem dets binding til denne sortilin /NTSR1 komplekset [18].

BDNF er blevet impliceret i patogenesen og prognose af mange menneskelige maligniteter såsom neuroblastomer [19], [20], medulloblastom [21], prostatacancer [22], [23], lungecancer [24], pancreas carcinom [25], [26], [27], og hepatocellulært carcinom [28]. I CRC, en overekspression af BDNF [29] og TrkB [30] blev for nylig rapporteret i patienternes væv, men ingen data omhandler funktionen af ​​BDNF som en autokrin sløjfer i CRC celle overlevelse. Da TrkB ekspression er associeret med flere kræftformer; målet med denne undersøgelse var at fastlægge betingelserne for endogene sekretion af BDNF og ekspressionen af ​​neurotrophin receptorer i CRC. Heri, viser vi, at endogent BDNF secerneres af CRC-celler indgivet til serum deprivation og inducerer celle overlevelse gennem TrkB tyrosinkinasereceptor, der udtrykkes på membranen af ​​stressede celler. Det er bemærkelsesværdigt, at TrkB og BDNF udtryk blev styrket i patienternes tumorer især i fremskredne stadier. Kollektivt, disse data påpege relevansen af ​​BDNF /TrkB vej i vækst- og invasiv af CRC.

Materialer og metoder

Celler og kultur

Menneskelig CRC-cellelinjer svarende til forskellige tumor stadier blev indkøbt fra American Type Culture Collection. WiDr [31] og SW480 [32] var primære CRC-afledte cellelinjer, mens de to andre linjer blev afledt fra CRC metastaser i lymfeknuder (SW620 stammer fra den samme patient som SW480 linje) [32] og ascites (COLO 205) [33]. Under basale betingelser blev WiDr celler holdt i MEM-medium (Gibco) suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt kalveserum (FCS) (Gibco), 1 mM natriumpyruvat (Gibco), 1% ikke-essentielle aminosyrer (Gibco), 100 IU /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin (Gibco). SW480, SW620 og COLO 205 linjer blev dyrket i RPMI-medium (Gibco) suppleret med 10% FCS, 100 IU /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin ved 37 ° C under befugtet atmosfære og 5% CO2. Dyrkede celler blev understreget af 24 til 72-h serum sult. Musen antagonistiske anti-BDNF-monoklonalt antistof (mAb) klon 35928,11 (10 ug /ml) blev indkøbt fra Calbiochem. Rekombinant human BDNF (100 ng /ml), rekombinant pro-BDNF (4 ng /ml), og K252a (200 nM) blev indkøbt fra Alomone labs.

Patienter og vævsprøver Salg

All patient-afledte væv blev indsamlet og arkiveret, ved Tumorotheque Limoges Universitetshospital, under protokoller godkendt af Institutional Review Board (AC N 2007-34, DC 2008-604 og 72-2011-18). Skriftligt informeret samtykke blev opnået ved alle emner til denne undersøgelse. Tumorvæv blev opnået fra 20 patienter, som gennemgik kirurgisk fjernelse af CRC i Limoges Universitetshospital mellem januar 2006 og februar 2007. Fire adenocarcinom patienter pr fase (ifølge pTNM klassifikation [34]) er blevet valgt til denne undersøgelse. Væv fra fire patienter med benign kolorektal sygdom, megadolichocolon, blev anvendt som kontroller. Salg

RT-PCR-analyse

CRC cellelinjer blev dyrket i medium indeholdende eller ikke 10% FCS i 24 til 72 -H. SV total RNA isolation systemet (Promega) blev anvendt til at isolere total RNA fra cellelinierne som beskrevet i producentens instruktioner. Mængden af ​​RNA ekstraheret blev kvantificeret ved måling af absorbansen ved 260 nm ved NanoDrop spektrofotometer ND-1000 (Labtech). Renheden af ​​RNA blev kontrolleret ved forholdet DO260 /DO280 nm mellem 1,83 og 2,00. Fraværet af RNA-nedbrydning blev bekræftet ved elektroforese på en 1,5% agarosegel indeholdende ethidiumbromid. Ekstraktion af RNA fra patienters væv blev udført som beskrevet [35]. Første-streng cDNA-syntese blev dannet ved anvendelse af SuperScript III (Invitrogen). PCR blev udført ved anvendelse af Taq-DNA-polymerase (Invitrogen). Totalt RNA isoleret fra humane neuroblastom-cellelinier (IMR32, SH-SY5Y) og humane erythromyeloblastoid leukæmi K562-celler blev anvendt som positive kontroller. Ikke-reverse-transskriberede prøver (fremstillet ved at udelade revers transkriptase) blev kørt parallelt med den omvendte-transskriberede prøver at udelukke kontaminering med genomisk DNA.

Primere blev konstrueret ved hjælp af Primer 3 (forudsat i det offentlige rum ved Whitehead Institute for Biomedical Research /MIT center for Genomic Research, Cambridge, MA, og til rådighed på https://www.wi.mit.edu). Oprettet primerpar er angivet, sammen med deres forventede produkt størrelse og annealeringstemperaturer i tabel 1.

Sequencing

Efter ekstraktion af PCR-produkter med Rapid PCR renseanlæg (MARLIGEN Bioscience), ifølge producentens instruktioner, blev PCR-produkter direkte sekventeret ved anvendelse af BigDye® Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) i et GeneAmp @ PCRSystem 2700 thermocycler (Applied Biosystems). Fragmenterne blev oprenset ved isopropanolfældning. Den sekventering gel blev kørt på en automatiseret laser fluorescerende DNA sequencer ABI Prism® 3130 × l Genetisk Analyser (Applied Biosystems) og homologier blev kontrolleret ved hjælp Finch TV, efter sprængning med BDNF, TrkB145, TrkB95, p75

NTR, og sortilin GenBank-sekvenser (NM_001143816, NM_001018064, NM_001007097, NM_002507, og NM_002959 henholdsvis).

Western blot

Mouse anti-BDNF (1 ug /ml) og muse-anti-TrkB (1 ug /ml) antistoffer (Abs) blev indkøbt fra R 1 ug /m) Abs fra Santa Cruz Biotechnology, kanin anti-TrkA (1:1000), kanin anti-TrkC (1:1000) og muse-anti-Akt (1:2000) Abs fra Cell Signaling Technology. Subkonfluente cellelinier kulturer blev lyseret (5 minutter på is) i dyrkningskolber med 1 × Cell lyseringsbuffer (Cell Signaling Technology) indeholdende 1 mM PMSF (Sigma-Aldrich). Suspensionen blev sonikeret i 1 min (en pulsering på 40 Hz hver 20 sek) nedbrydes kromosomalt DNA og centrifugeret ved 14.000 g i 10 minutter. Supernatanter blev opsamlet, og proteinkoncentrationen blev bestemt ved anvendelse Bradford proteinkoncentration assay (Sigma). SDS-PAGE blev udført, og proteinerne blev elektro-blottet på PVDF-membraner (Biotrace ™). Efter en times inkubation ved stuetemperatur i blokeringsopløsning (5% fedtfri tørmælk i PBS) blev membranerne eksponeret for det specifikke primære Abs i blokeringsopløsning natten over ved 4 ° C. Derefter blev membraner vasket tre gange i 5 min med TBS /0,1% Tween-20 og de immunreaktioner blev påvist ved peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært Ab til mus, kanin eller ged Ig (DakoCytomation) fortyndet til 1:2000 i blokeringsopløsning i 1 timer ved stuetemperatur. Efter vask blev visualisering af immunkomplekser opnås ved anvendelse af Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore). Protein-loading kontrol blev udført med anti-actin-Ab (Cell Signaling Technology). Western blots blev scannet ved hjælp af en bio-imaging-system (Genesnap, Genetool, Syngene). Densitometriske analyser blev udført ved hjælp af et ImageJ software program (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA https://rsb.info.nih.gov/ij/). Proteinekspression blev bestemt i relative enheder i forhold til actin ekspression.

Immunofluorescens Salg

celler dyrket på 12-mm dækglas blev fikseret med 4% PFA ved stuetemperatur i 30 minutter, og permeabiliseret eller ikke med 0,1% Triton X-100. Ikke-specifik binding blev blokeret af 30 minutters inkubation med PBS-2% BSA ved stuetemperatur. Dækglas blev derefter inkuberet natten over ved 4 ° C i blokeringsopløsning med det primære Ab. Følgende Abs blev anvendt: kanin anti-BDNF-Ab (1 ug /ml; Santa Cruz Biotechnology), kanin-anti-pro-BDNF Ab (8 ug /ml; Alomone Labs), muse-anti-TrkB Ab (2,5 ug /ml; R Santa Cruz Biotechnology) og gede-anti-sortilin Ab (1 ug /ml; Santa Cruz Biotechnology). Celler blev vasket 3 gange i PBS og inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur med Alexa Fluor-konjugeret sekundært Ab’er (Invitrogen) fortyndet 1:5000 i PBS. Efter 3 vaske i PBS blev kerner farvet i 5 minutter med DAPI. Efter intensive vaske blev dækglas vendt på objektglas og monteret med Dako Fluorescent Mounting Medium (DakoCytomation). Negative kontroller var celler inkuberet med irrelevant normalt kanin, mus eller gede-IgG (Sigma). Billeder blev taget med et konfokalt mikroskop (Carl Zeiss, LSM 510); overflade plots af fluorescensdata blev genereret med ImageJ software program.

ELISA

Efter en 24-h, 48-H og 72-H kultur, prøver af supernatant fra cellelinier blev opsamlet og opbevaret ved -80 ° C indtil dagen for assayet. Immunoassays Systems (Promega), der er specifikke for BDNF blev udført ifølge producentens anvisninger. Resultater blev udtrykt som gennemsnit ± SEM (pg /ml). Mindst tre uafhængige forsøg blev udført for hver eksperimentel betingelse, hver med målinger i tre eksemplarer.

celleproliferation assays

Celleproliferation blev målt ved anvendelse Click-det edu Alexa Fluor 488 Flowcytometri assay ( Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Kort beskrevet blev celler (2 x 10

5 pr brønd) inkuberet natten over på tolv brønde før behandling, dernæst dyrket i 24-h i serumfrit medium med eller uden exogent BDNF, K252a eller begge BDNF og K252a tilsat samtidigt . Sprednings-værdier blev målt under anvendelse af en BD LSRFortessa flowcytometri (BD Biosciences). Eksperimenter blev udført tre gange, og tre sæt af 50.000 celler blev opsamlet for hver tilstand. Dataene blev erhvervet og analyseret af BD FACSDiva 6.0 software (BD Biosciences). Hvert eksperiment blev gentaget mindst tre gange.

Apoptose assay

Apoptose blev målt ved påvisning af cytoplasmatiske opløselige nukleosomer bruger kalorimetrisk assay Celledød Detection ELISAPLUS kit (Roche Molecular Diagnostic) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Absorbans-værdierne blev målt ved 405-490 nm dobbelte bølgelængder. Opnået i kontrol absorbans blev normaliseret til en værdi på 1, som tidligere beskrevet [7]. Alle forsøgene blev udført tre gange og gentages mindst tre gange. Salg

Statistisk analyse

Statistisk signifikans blev bestemt ved en envejs-analyse af varians (ANOVA) med StatView 5.0-software (Abacus Concepts ).

P

værdier 0,05 blev anset for signifikante. Mean og SEM-værdier blev opnået fra mindst 3 uafhængige forsøg.

Resultater

tarmkræft cellelinjer udtrykker TrkB og p75

NTR men ikke TrkA eller TrkC receptorer

TrkB og p75

NTR udtryk blev påvist i CRC cellelinjer under basale (10% FCS) dyrkningsbetingelser, både på mRNA (figur 1A) og protein (figur 1 D) -niveauer med nogle forskelle afhængigt cellelinier. Henviser fuldlængde TrkB (TrkB145) og p75

NTR transkripter var fremherskende i en primær (SW480) og en metastase (SW620) linje (figur 1A) (to cellelinier isoleret fra den samme patient), stærkest udtrykt transkripter var dem af det trunkerede isoform (TrkB95) i alle cellelinjer (figur 1A) bortset WiDr celler, som udtrykte TrkB95 og p75

NTR først efter en 48-h serum deprivation (figur 1B). TrkB og p75

NTR sekventering efter agarose eluering geler validerede disse resultater. Imidlertid blev TrkA og TrkC transkripter (Figur 1C) samt proteiner receptorer (figur 1D) ikke påvist, uanset dyrkningsbetingelser, i modsætning til den erythromyeloblastoid leukæmi K562-cellelinje vides at udtrykke disse neurotrofinreceptorer [36].

(A): RT-PCR af BDNF, dens høje (TrkB) og lav (p75

NTR) affinitetsreceptorer, TrkA, og TrkC fra celler dyrket i basal (10% FCS-medium), WiDr (bane: 1 ), SW480 (bane 2), SW620 (bane 3), COLO 205 (bane: 4). GAPDH mRNA niveauer blev anvendt som en intern kontrol. Positiv kontrol (bane 5) var neuroblastomcellelinje (IMR32) for BDNF, TrkB og p75

NTR; og de erythromyeloblastoid leukæmiceller (K562) for TrkA og C. Et repræsentativt resultat af mindst tre til fem uafhængige forsøg. (B) Sammenligning af TrkB95 og p75

NTR på total RNA udvundet fra WiDr celler dyrket i 10% FCS eller efter 24 til 72 timer serum deprivation (0% FCS). TrkB95 og p75

NTR mRNA /GAPDH mRNA kvantificering af band intensiteter evalueret af densitometri er vist ovenfor baner og udtrykt i arbitrære enheder (gennemsnit af tre uafhængige forsøg). (C) Samme eksperiment: RT-PCR af TrkA og TrkC på total RNA ekstraheret fra WiDr-celler dyrket under basale dyrkningsbetingelser (10% FCS), og efter 24-72 timer af serum sult i sammenligning med positiv kontrol (K562) (D) ekspression af pro-BDNF og BDNF, fuld længde TrkB 145 og trunkeret TrkB 95 og p75

NTR proteiner i CRC-cellelinjer dyrket i 10% FCS. TrkA og TrkC blev ikke påvist. Actin blev anvendt som indlæsning protein kontrol. WiDr (bane 1), SW480 (bane 2), SW620 (bane 3), COLO 205 (bane: 4). Positiv kontrol (bane: 5) var IMR32 celler for BDNF, pro-BDNF, TrkB og p75

NTR og K562-celler eller TrkA og TrkC. Et repræsentativt resultat af mindst tre uafhængige forsøg.

CRC celler producerer endogene BDNF

Da CRC udtrykte TrkB receptorer, søgte vi efter en endogen produktion af BDNF, en TrkB ligand. BDNF mRNA blev fundet i alle undersøgte cellelinjer under basal (10% FCS) betingelser, overvejende de to primære CRC linjer (WiDr og SW480). Interessant, efter serum sult i 24 til 72 timer, BDNF mRNA-niveauer (figur 2A), samt modne BDNF-protein (17 kDa) detekteres ved Western blot i cellelysater, blev forøget i de fire CRC-celler (figur 2B), som vist ved densitometri-værdier (BDNF /GAPDH-forhold for mRNA og BDNF /Actin nøgletal for proteiner) (figur 2A, B). Desuden blev BDNF sekretion detekteret ved ELISA i kultursupernatant af CRC cellelinier. BDNF udgivelse var signifikant forhøjet ved serum sult i de to primære WiDr og SW480 CRC cellelinjer (figur 2C og tabel 2) henviser til, at det var ingen signifikant forbedret i metastatisk SW620 og COLO 205 CRC cellelinier (tabel 3). Serum deprivation førte til en stigning af BDNF niveauer i cytoplasmaet i disse fire cellelinjer som vist for SW480 i figur 2D. Kvantificering den grønne fluorescens intensitet i hver dyrkningsbetingelser bekræftede resultaterne fra fluorescens billeder (figur 2D) og forstærket de opnåede resultater ved Western blotting.

(A) BDNF produktion vurderet ved RT-PCR af total RNA udvundet fra celler dyrket i basal tilstand (10% FCS) og i 24 til 72 timer af serum deprivation. Kvantificering af båndintensiteter er vist som ovenfor (gennemsnit af tre uafhængige forsøg). (B) BDNF ekspression ved western blotting (i forhold til actin) i totalt cellulært protein ekstraheret fra cellelinjer dyrket under basal betingelse (10% FCS), og efter 24-72 timer af serum deprivation (0% FCS). Ifølge densitometriske analyser viste kvantificering en signifikant forøget ekspression af BDNF i dyrkede celler. Histogrammer er middelværdier ± SEM af mindst tre uafhængige forsøg. **,

s

0,01; ***,

s

0,001, i sammenligning med basale dyrkningsbetingelser. (C) Sekretion af BDNF vurderet ved ELISA i supernatant af de WiDr og SW480 cellelinjer under basale betingelser (10% FCS), og efter 24-72 timer af serum deprivation (0% FCS). Resultater udtrykkes som middelværdien ± SEM af triplikater fra tre forskellige eksperimenter. ***,

s

0,001, sammenlignet med basal kultur tilstand. (D) Sammenligning af BDNF ekspression med SW480 celler dyrket i 10% FCS og efter 72-h serum deprivation. Konfokal mikroskopi med anti-BDNF Ab og Alexa Fluor-488-konjugat (grøn) og kerner modfarvet med den blå-fluorescerende DNA-farve DAPI. Relativ kvantificering blev vurderet ved grøn fluorescens overflade plot. Billeder var repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. Målestokke 10 um. Lignende resultater blev observeret med de tre andre linjer (data ikke vist). Vejviser

Serum sult inducerer membranøs udtryk for TrkB og dets co-lokalisering med BDNF

Konstateringen at endogen BDNF udskilles under serum sult betingelser førte os til at søge efter ekspression af dets højaffinitetsreceptor. I basal (FCS-holdigt) -kulturer (figur 3A, C), blev højaffinitetsreceptoren TrkB og dens ligand BDNF afsondret i alle CRC-cellelinier. En 24-h serumudsultning inducerede en flytning af TrkB til cellemembranen (figur 3B, D). Interessant nok blev en co-lokalisering af TrkB og BDNF på membranen påvises i alle undersøgte cellelinjer og nåede et maksimum efter 72 timer med afsavn, som vist for WiDr og COLO 205 celler (figur 3B, D). Lignende farvningsmønstre blev opnået for SW480 og SW620 (data ikke vist). Den coekspression på membranen af ​​både TrkB og endogen BDNF antyder, at BDNF og TrkB kunne være impliceret i en autokrin sløjfe i stressede CRC-celler.

Konfokal mikroskopi af WiDr (A, B) og COLO 205 (C, D ) celler, farvet med et anti-BDNF-Ab (rød), anti-TrkB mAb (grøn) eller begge (overlay) dyrket med 10% FCS (A, C) eller efter 24 timers serum deprivation (B, D). Under basale dyrkningsbetingelser (10% FCS), blev TrkB og BDNF afsondret i cytoplasmaet (pile) i WiDr (A) og COLO 205 (C) celler. De samme farvningsmønstre blev opnået med de to andre cellelinjer (data ikke vist). Efter serumudsultning flytning til cellemembranen og co-lokalisering af TrkB og BDNF (gult fusioneret, pile) blev påvist i WiDr (B) og COLO 205 (D). Billeder var repræsentative i mindst tre til fem uafhængige forsøg.

BDNF fremmer spredning og overlevelse af CRC cellelinjer gennem TrkB

For at bestemme funktionen af ​​denne ligand-receptor system i proliferation og overlevelse af WiDr, SW480, SW620 og COLO 205 CRC-celler, proliferation og apoptose blev udført med eksogent BDNF enten i FCS-frit eller i 10% FCS-holdige kulturer. Efter en 24-h dyrkning i serumfrit medium, exogent BDNF forøgede signifikant proliferation af alle undersøgte cellelinjer, i modsætning til fraværet af virkning i nærvær af 10% FCS (figur 4A og tabel 2, 3). Da TrkB blev udtrykt på overfladen af ​​stressede celler, hypotese vi dens mulige rolle i celledeling under sådanne forhold. Faktisk tilsætning af K252a, en Trk inhibitor [37], undertrykte proliferative virkning af eksogent BDNF i serumfrie kulturer i alle undersøgte cellelinjer (figur 4A), som tyder på, at endogen BDNF var impliceret i celle vækst gennem TrkB (fig. 4A og tabel 2, 3). For yderligere at evaluere rollen af ​​TrkB og BDNF i stressede CRC celleoverlevelse blev apoptose evalueret af opløselige nucleosomstørrelse cytoplasmiske niveauer i kulturer med og uden exogent BDNF eller K252a. Efter en 24-h serumudsultning, WiDr, SW480, SW620, og COLO 205 celler stimuleret med eksogent BDNF havde signifikant nedsat apoptotiske forhold, mens der ikke blev observeret nogen signifikant virkning på celler opretholdt i normalt medium (figur 4B, C og tabel 2, 3 ). Desuden 200 nM K252a øgede apoptotiske forhold mellem WiDr, SW480, SW620, og COLO 205 (figur 4B, C og tabel 2, 3). De opnåede efter 48 og 72-h serum udsultning resultater bekræftede disse data (fig. 4B, C), hvilket tyder på, at spredning af CRC celler kan være medieret af en BDNF /TrkB signalvejen.

(A) Rolle af endogen BDNF og dets receptor TrkB på CRC celledeling: effekter af eksogent BDNF og undertrykke endogene TrkB receptor på celleproliferation. De fire cellelinier blev dyrket i 24 timer i FCS-frit medium (FCS 10%, -) i nærvær af exogent BDNF (+), K252a (+) alene eller i kombination. Celleproliferation blev bestemt ved flowcytometri-analyse under anvendelse edu Alexa Fluor 488. Dataene præsenteres som histogrammer af prolifererende celler i relative enheder ± SEM for fem uafhængige forsøg. *,

s

0,05; **,

s

0,01; ***,

s Restaurant 0,001, sammenlignet med serum-frit medium. (B, C) Virkninger af eksogent BDNF og undertrykke endogene TrkB receptor på celle overlevelse. Apoptotiske forhold mellem opløselige nukleosomer blev detekteret ved ELISA Cell for WiDr, SW480, SW620, og COLO 205 induceret af serum deprivation alene (FCS 10%, -) eller sammen med enten exogent BDNF (+), eller med K252a (+), løbet 24-72 timer af serum deprivation. Histogrammer, mean ratio af apoptotiske celler ± SEM af mindst tre uafhængige forsøg. *,

s

0,05; **,

s

0,01; ***,

s

0,001, sammenlignet med serum-frit tilstand alene. (D, E) apoptotisk forhold efter 24 timers serum deprivation alene (0% FCS) eller med kombination med en neutraliserende anti-BDNF mAb (0% anti-BDNF). Histogrammer, mean ratio af apoptotiske celler ± SEM for tre uafhængige forsøg. *,

s

0,05; **,

s

0,01; ***,

s

. 0,001, sammenlignet med serum-frit tilstand alene

For at definere signaltransduktionsvejen induceret af BDNF /TrkB aktivering, søgte vi efter Akt phosphorylering i to CRC cellelinier efter BDNF-behandling. Faktisk afslørede western blotting, at eksponeringen af ​​WiDr eller SW480 til BDNF efter en 16-timers serum afsavn, induceret Akt fosforylering (Ser 473) efter 5 minutter, nåede maksimum ved 30 minutter (7 til 8 gange forøgelse) og alligevel opdaget efter 24 timer (3 til 4 gange stigning) (figur 5).

evne BDNF at aktivere PI3-kinase /Akt-signalvejen i CRC-celler blev vurderet ved anvendelse af antistoffer specifikke for Akt og phospho-Akt (Pakt ). WiDr og SW480-celler blev serum sultet i 16 timer. Cellerne blev derefter eksponeret for BDNF (100 ng /ml) og høstet på forskellige tidspunkter, i 5 minutter (min) til 24 timer (h). Tredive ug proteinlysater blev analyseret for Pakt (Ser473) og total Akt ved western blot-analyse. Densiteten af ​​hver Pakt bånd blev korrigeret for varians i læsning, ved hjælp af densiteten af ​​den tilsvarende samlede Akt. Den gange induktion blev evalueret som forholdet mellem phosphorylerede Akt protein densiteter mellem kontrol (0 min) og behandlede celler. Et repræsentativt resultat af mindst tre uafhængige forsøg.

Vi bestemmes derfor apoptotiske niveauer af de fire cellelinjer i tilstedeværelse af en neutraliserende anti-BDNF mAb [38]. Dette mAb faktisk øget apoptose af primære CRC linjer: WiDr (figur 4D, venstre og tabel 2), SW480 (figur 4D, højre og tabel 2) og metastatiske linier, SW620 (figur 4E, venstre og tabel 3) og COLO 205 ( Figur 4E, højre og tabel 3).

Tilsammen antyder disse data at endogen BDNF er impliceret i CRC overlevelse celle i serumfrie kulturer via TrkB gennem en autokrin sløjfe. Dette førte til at studere rolle sortilin i BDNF trafik.

Sortilin, en BDNF handel protein, udtrykkes af CRC cellelinjer

De anvendte primere i studiet af sortilin udskrifter anerkendte den intracellulære del af proteinet (sortilin IC involveret i neurotrophin denne handel) og den ekstracellulære del (sortilin EF var involveret i dens receptor egenskaber). Sortilin transkript (figur 6A) og protein (figur 6B) blev påvist i alle undersøgte cellelinjer. Ved sammenligning med celler dyrket i 10% FCS, en 24 til 72-h serum deprivation forbedret sortilin udtryk som påvist på immunblots af WiDr, SW480, SW620 og COLO 205 ekstrakter (figur 6B). Sortilin er kendt for at eksistere under to forskellige tilstande af glykosylering i CRC celler. Det blev faktisk opdaget som en dublet i SW480 cellelinje (figur 6B), men næppe i andre (WiDr, Colo205) med et udtryk variabel mellem cellelinjer og kulturer (figur 6B). Sortilin blev detekteret i alle CRC cellelinjer ved konfokal mikroskopi også, som vist for SW620 (figur 6C). Dobbelt-farvning for sortilin og BDNF viste en slående colokalisering med forøgede fluorescensintensiteter Efter 24 timers serum sult (figur 6C). Kvantificering den grønne (BDNF) og rød (sortilin) ​​fluorescensintensiteter i hver dyrkningsbetingelser bekræftede resultaterne fra fluorescens billeder (figur 6C). Lignende farvningsmønstre blev observeret med WiDr, SW620, og COLO 205 cellelinjer under de samme betingelser (data ikke vist). Alt i alt, vores resultater er i overensstemmelse med den hypotese, at sortilin kunne udøve funktionen af ​​transporteren for BDNF.

(A) Sortilin detektion ved RT-PCR af total RNA udvundet fra celler dyrket i 10% FCS og efter 24 -72 h serum sult. Expression blev styret med specifikke primere for sin ekstracellulære (Sortilin EF) og intracellulære (Sortilin IC) dele. En repræsentant resultat fra mindst tre uafhængige forsøg. (B) Vurdering ved western blotting af sortilin ekspression (i forhold til actin) i totalt cellulært protein ekstraheret fra undersøgte cellelinjer dyrket under basal tilstand og efter 24-72 timer af serum deprivation.