PLoS ONE: en autokrin Cytokine /JAK /STAT-Signaling inducerer Kynurenin Syntese i multiresistent Menneskelig Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund

multiresistent kræftceller er svære at udrydde for det er ineffektivt at konventionelle lægemidler mod cancer. Udover at undslippe de cytotoksiske virkninger af kemoterapi, de også omgå pro-immunogene virkninger induceret af lægemidler mod cancer: ja de er ikke godt genkendes af værtens dendritiske celler og fremkalder ikke en holdbar anti-tumor immunitet. Det er endnu ikke blevet undersøgt, hvorvidt multiresistent celler har en anden evne til at fremkalde immunosuppression end chemosensitive dem. Vi behandlet dette spørgsmål i humane og murine chemosensitive og multiresistent kræftceller.

Resultater

Vi fandt, at aktiviteten og ekspressionen af ​​indolamin 2,3-dioxygenase en (IDO1), som katalyserer omdannelse af tryptophan i den immunsuppressive metabolit kynurenin, var højere i alle de multilægemiddelresistente analyserede celler og at IDO1 inhibering reducerede væksten af ​​lægemiddelresistente tumorer hos immunkompetente dyr. I kemoresistent celler var højere den basale aktivitet af JAK1 /STAT1 og JAK1 /STAT3 signalering, den STAT3 inhibitoren PIAS3 blev nedreguleret, og den autokrine produktion af STAT3-mål- og IDO1-inducere cytokiner IL-6, IL-4, IL- 1β, IL-13, TNF-α og CD40L, blev forøget. Den afbrydelse af JAK /STAT signalering sænkede IDO1 aktivitet og vendes de kynurenin-induceret pro-immunosuppressive virkninger, som afsløret af den restaurerede proliferation af T-lymfocytter i STAT-lyddæmpet kemoterapi celler.

Konklusioner

Vores arbejde viser, at multiresistent celler har en stærkere immunsuppressiv holdning end chemosensitive celler, på grund af den konstitutiv aktivering af JAK /STAT /IDO1 akse, således resulterer kemo- og immun-undvigende. Forstyrre denne akse kan i væsentlig grad forbedre effektiviteten af ​​kemo-immunterapi protokoller mod tumorer

Henvisning:. Campia I, Buondonno I, Castella B, Rolando B, Kopecka J, Gazzano E, et al. (2015) en autokrin Cytokine /JAK /STAT-Signaling inducerer Kynurenin Syntese i multiresistent menneskelige kræftceller. PLoS ONE 10 (5): e0126159. doi: 10,1371 /journal.pone.0126159

Academic Redaktør: Michael Platten, University Hospital of Heidelberg, Tyskland

Modtaget: Oktober 27, 2014 Accepteret: 29 2015; Udgivet: 8. maj 2015

Copyright: © 2015 Campia et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den italienske sammenslutning for Cancer Research (AIRC; bevilge MFAG 11475, www.airc.it), det italienske ministerium for University og Forskning ( “Fremtiden i Forskningsprogram” FIRB 2012, give RBFR12SOQ1, www.istruzione.it). JK er fyr i den italienske Foundation for Cancer Research (FIRC, www.fondazionefirc.it). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

at opnå en god kemoterapi effekt og fremkalde en holdbar anti-tumor immunrespons er de vigtigste udfordringer i chemoimmunotherapy. Kemoresistens, især den samtidige resistens over for forskellige kemoterapeutiske midler kendt som multilægemiddelresistens (MDR), er en af ​​de største problemer, som kemoterapi [1]. MDR kan være til stede ved diagnose eller foranlediget af selektivt tryk for kemoterapi; det ofte henvist til overekspression af ATP-binding cassette (ABC) transportere ansvarlige for anticancerlægemidlet efflux, såsom P-glycoprotein (Pgp), MDR beslægtede proteiner (MRPs) og brystcancer resistens protein (BCRP). Sammen har de udstrømning både klassiske kemoterapeutiske midler (f.eks antracykliner, taxaner, Vincaalkaloider, epipodophyllotoxiner, topotecan, methotrexat) og nye målrettede lægemidler (f.eks imatinib, dasatinib, lapatinib, gefitinib, sorafenib, erlotinib), begrænse deres cytotoksiske virkninger [2].

specifikke kemoterapeutiske midler, såsom anthracycliner og oxaliplatin, inducerer også pro-immunogene virkninger, ved at inducere translokation på plasmamembranen af ​​specifikke “Eat Me” signaler, ligesom chaperon calreticulin, som udløser tumorcellen fagocytose og den efterfølgende aktivering af antitumor CD8

+ T-lymfocytter [3]. Denne mekanisme virker ikke i celler, der overudtrykker Pgp [4-6], som resulterer samtidig kemo- og immun-resistent.

Desuden tumorceller kan unddrage værten immunosurveillance ved at undertrykke aktiviteten af ​​værtens immunsystem. En overflod af mekanismer mægle tumor-induceret immunosuppression, herunder: ændringer i tumor overfladeantigener; frigivelse af immunosuppressive cytokiner i tumormikromiljøet; udvidelse af T-hjælper-2-lymfocytter, T-regulerende (Treg) celler, myeloide afledte suppressorceller og type 2-tumorassocierede makrofager, der begunstiger tumorvækst og forringe aktiviteten af ​​anti-tumor populationer, såsom T-hjælper 1-lymfocytter , CD8

+ T-lymfocytter, type 1-tumorassocierede makrofager, naturlige dræberceller [7].

Et af de stærkeste mediatorer af det tumor-inducerede immunosuppression er kynurenin, produktet af tryptophan katabolisme via tryptophan dioxygenase (TDO) [8] og indolamin 2,3-dioxygenase enzymer (IDO1 og IDO2) [9], der induceres af interferon-γ (IFN-γ) [10, 11], nitrogenoxid (NO) [12 ] og jern [13]. Tryptophan er en essentiel aminosyre for proliferation og overlevelse af CD8

+ og CD4

+ T-lymfocytter; desuden den øgede kynurenin /tryptophan forhold alvorligt kompromitterer effektiviteten af ​​værtens cellulære immunitet, fordi kynurenin inhiberer aktiveringen af ​​T-lymfocytter [7, 14]. IDO1 udtrykkes i tumor-infiltrerende dendritiske celler [15] og i stromale tumorceller [16], og det har vist sig konstitutivt udtrykt eller opreguleret i flere tumorceller [14, 17]. En øget serum kynurenin /tryptophan forholdet er korreleret til en hurtigere progression af lungekræft [18] og IDO positivitet i tumorprøver er normalt forbundet med en dårlig klinisk prognose [19-21]. IDO1 overekspression understøtter tumorvækst og progression af lungekræft [22], hvilket fører til hypotesen, at kynurenin, foruden sine immunosuppressive virkninger, kan direkte forbedre tumor udvikling.

Vi har tidligere vist, at multiresistent celler er resistente over for den immunogene død drives af dendritceller-medieret fagocytose [4-6]. Det er ikke blevet undersøgt, hvorvidt multilægemiddelresistente celler adskiller sig fra chemosensitive dem også for evnen til at inducere immunosuppression: vi fandt, at multidrug-resistente celler havde en basalt højere produktion af det immunosuppressive metabolit kynurenin end chemosensitive celler og vi undersøgte den molekylære basis for denne fænotype.

Materialer og metoder

Kemi

plastvarer til cellekulturer var fra Falcon (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Elektroforesen reagenser blev opnået fra Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). Det humane rekombinante IFN-γ blev opnået fra R pH blev justeret til neutralitet med NaOH.

Celler

De menneskelige chemosensitive ikke-småcellet lungecancer A549 celler blev købt fra Istituto Zooprofilattico Sperimentale “Bruno Umbertini” (Brescia, Italien). De menneskelige chemosensitive tyktarmskræft HT29-celler, de menneskelige chemosensitive kronisk myeloid leukæmi K562-celler, de menneskelige chemosensitive mesothelial Met5A celler og murine konstitutivt kemoterapi mamma JC celler fra ATCC (Manassas, VA) Den resistente underlinjer A549 /dx, HT29 /dx, K562 /dx blev genereret i vores laboratorium ved dyrkning af ovennævnte parentale celler i et medium indeholdende stigende koncentrationer af doxorubicin, der anvendes som et MDR inducer, som rapporteret tidligere [4]. Det humane konstitutivt kemoresistent malignt mesotheliom (HMM) celler blev opsamlet, efter informeret skriftligt samtykke fra patienterne, som Biologic Bank of malignt mesotheliom (S.S. Antonio e Biagio Hospital, Alessandria, Italien), hvor den histologiske karakterisering blev udført [23]. Den eksperimentelle protokol (kode: TASK3) blev godkendt den 09/11/2011 af bioetiske komité ( “Comitato Etico Interaziendale”) i S. S. Antonio e Biagio Hospital, Alessandria, Italien. Cellerne blev dyrket i det respektive dyrkningsmedium suppleret med 10% vol /vol føtalt bovint serum (FBS), 1% v /v penicillin-streptomycin, 1% vol /vol L-glutamin og blev holdt i en befugtet atmosfære ved 37 ° C og 5% CO

2

Kynurenin måling

IDO aktivitet blev bestemt ifølge [24], med mindre modifikationer:. 200 pi cellekultursupernatanter blev tilsat til 100 pi 30% w /v trichloreddikesyre (TCA) og inkuberet i 30 minutter ved 50 ° C for at hydrolysere N-formylkynurenine til kynurenin. Efter centrifugering ved 10.000 x g i 10 minutter blev 100 pi af supernatanten overført til en 96-brønds plade, blandet med 100 pi 2% vægt /volumen p-dimethylamino benzaldehyd i 99,8% v /v eddikesyre, og inkuberet i 10 min ved stuetemperatur. Kynurenin blev påvist ved måling af absorbansen ved 490 nm under anvendelse af en Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader (BioTek, Winooski, VT). Absorbansen af ​​dyrkningsmediet alene blev betragtet som en blank og blev subtraheret fra værdierne opnået i nærvær af cellerne. Resultaterne blev udtrykt som nmol kynurenin /mg celleproteiner, ifølge en titreringskurve tidligere indstillet. Kynurenin niveauer i cellekultursupernatanterne blev målt parallelt af højtryksvæskekromatografi (HPLC), som rapporteret i [25], med mindre modifikationer: 400 pi cellekultursupernatanterne blev tilsat til 100 pi 30% vægt /volumen TCA , inkuberet i 30 minutter ved 50 ° C og centrifugeret ved 15.000 xg i 10 min. Den klare supernatant blev filtreret gennem 0,45 um PTFE-filtre (Alltech, Nicholasville, KY) og analyseret ved en Agilent LC-system (Palo Alto, CA), udstyret med vakuumafgasser (G1322A), kvaternær pumpe (G1311A), manuel-injektor (Rheodyne , Cotati, CA) og multipel bølgelængde detektor (G1365A) integreret i HP1200 system. Dataene blev indhentet og behandlet med Agilent ChemStation softwaren. Injektionsvolumenet var 20 pi. En Agilent Eclipse XDB-C18-søjle (125 mm x 4,0 mm, 5 um) blev anvendt til analyse ved 30 ° C. Den kromatografiske separation blev udført under anvendelse af mobil fase bestående af 15 mmol /l (pH 4,0) og acetonitril (90:10, vol /vol) ved en strømningshastighed på 0,8 ml /min. Eluatet blev overvåget ved 365 nm, refereres mod en 700 nm bølgelængde. Kalibreringsprøverne blev fremstillet ved tilsætning kynurenin standarder (Sigma Chemical Co.) i koncentrationsområdet 0,50-50 umol /L til dyrkningsmediet. Resultaterne blev udtrykt som nmol kynurenin /mg celleproteiner.

QRT-PCR og PCR arrays

Det totale RNA blev ekstraheret og revers-transkriberet ved hjælp af iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories ). Den QRT-PCR blev udført med iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories). Det samme cDNA-præparat blev anvendt til at kvantificere genet af interesse og husholdning genet

β-actin

. Primersekvenserne, designet med qPrimerDepot software (https://primerdepot.nci.nih.gov/), var: for

IDO1

: 5’CAGGCAGATGTTTAGCAATGA -3 « 5’GATGAAGAAGTGGGCTTTGC -3 « for

β-actin

: 5’GCTATCCAGGCTGTGCTATC-3 ‘; 5’TGTCACGCACGATTTCC-3 ‘. Mængden af ​​

IDO1

mRNA var normaliseret versus mængden af ​​

β-actin

mRNA, valgt som husholdning gen, og blev udtrykt som

IDO1

/

β- actin

ratio, anvendelse af Bio-Rad Software Gene Expression Kvantificering (Bio-Rad Laboratories). PCR arrays blev udført på 1 ug cDNA, under anvendelse af human JAK /STAT-signalvejen RT² Profiler PCR Array og den humane IL-6 /STAT3 signalvejen Plus RT² Profiler PCR Array (Qiagen, Hilden, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Analysen af ​​data blev udført med RT² Profiler PCR Array Data Analysis (Qiagen).

Western blotting

Cellerne blev skyllet med lysis buffer (125 mmol /L Tris-HCI, 750 mmol /l NaCl, 1% volumen /volumen NP40, 10% v /v glycerol, 50 mmol /l MgCl

2, 5 mmol /l EDTA, 25 mmol /l NaF, 1 mmol /l Navo

4 , 10 ug /ml leupeptin, 10 ug /ml pepstatin, 10 ug /ml aprotinin, 1 mmol /l phenylmethylsulfonylfluorid; pH 7,5), sonikeret og centrifugeret ved 13.000 xg i 10 min ved 4 ° C. 20 ug af proteiner fra cellelysater blev underkastet Western blotting og probet med de følgende antistoffer mod: IDO1 (kanin polyklonale, fortyndet 1: 2.000, AG-25A-0029, Adipogen, San Diego, CA); IDO2 (muse monoklonale, fortyndet 1: 500, SAB3701447, Sigma Chemical Co.); TDO (kanin polyklonalt, fortyndet 1: 1.000, SAB2102400, Sigma Chemical Co.); phospho (Tyr 1022/1023) -JAK1 (kanin polyklonale, fortyndet 1: 1000, # 3331, Cell Signaling Technology, Danvers, MA); JAK1 (kanin polyklonale, fortyndet 1: 1000, # 3344, Cell Signaling Technology); phospho (Tyr701) -STAT1 (kanin polyklonale, fortyndet 1: 1000, # 9167, Cell Signaling Technology); STAT1 (mus monoklonalt, fortyndet 1: 1000, klon 15H3, Thermo Scientific, Rockford, IL); phospho (Tyr705) -STAT3 (kanin polyklonale, fortyndet 1: 2000, # 9145, Cell Signaling Technology); STAT3 (mus monoklonalt, fortyndet 1: 5000, klon 9D8, Thermo Scientific); Pgp (kanin polyklonalt, fortyndet 1: 250, sc-8313, Santa Cruz Biotechnology Inc.); MRP1 (mus monoklonalt, fortyndet 1: 100, ab32574, Abcam, Cambridge, UK); MRP2 (muse monoklonale, fortyndet 1: 100, ab3373, Abcam); MRP3 (gede polyklonale, fortyndet 1: 250, sc-5776, Santa Cruz Biotechnology Inc.); MRP4 (gede polyklonale, fortyndet 1: 250, ab77184, Abcam); MRP5 (gede polyklonale, fortyndet 1: 250, sc-5781, Santa Cruz Biotechnology Inc.); BCRP (kanin polyklonalt, fortyndet 1: 500, sc-25.882, Santa Cruz Biotechnology Inc.); β-tubulin (muse monoklonale, fortyndet 1: 500, sc-5274, Santa Cruz Biotechnology Inc.), efterfulgt af en sekundær peroxidase-konjugeret antistof (Bio-Rad Laboratories). Proteinerne blev detekteret ved forøget kemiluminescens (Bio-Rad Laboratories). Nukleare ekstrakter blev udarbejdet med Nuclear Uddrag Kit (Aktiv Motif, Rixensart, Belgien); 10 ug kerneproteiner blev opløst ved SDS-PAGE og probet med følgende antistoffer mod: PIAS1 (kanin monoklonale, fortyndet 1: 1.000, ab109388, Abcam); PIAS3 (kanin polyklonalt, fortyndet 1: 1.000, ab22856, Abcam); phospho (Tyr701) -STAT1; STAT1; phospho (Tyr705) -STAT3; STAT3; TATA-bindende protein (TBP, kanin polyklonalt, fortyndet 1.500, sc-273, Santa Cruz Biotechnology Inc.). For at udelukke enhver cytosol forurening af kerneekstrakter, vi bekræftet, at β-tubulin var målbart i nukleare prøver (ikke vist).

In vivo

tumorvækst

1 x 10

5 human A549, A549 /dx, HT29, HT29 /dx celler i 20 pi kulturmedium, blandet med 20 pi Cultrex BME (Trevigen, Gaithersburg, MD), blev implanteret subkutant i den højre flanke på 6-8 uger gamle kvindelige nøgen BALB /c mus, opstaldet under 12 timers lys /mørke cyklus, med mad og drikke forudsat

ad libitum

. 1 x 10

5 murine kemoresistent JC celler, syngeniske med BALB /c mus [26], blev implanteret i immunkompetente dyr. I en anden forsøgsopstilling, når A549 /dx, HT29 /dx og JC tumorer nåede volumen på 100 mm

3, dyrene blev randomiseret i to grupper: “Control” (behandlet med 100 pi saltopløsning

per os

, 5 dage /uge i tre uger); “Brassinin” (behandlet med 400 mg /kg af IDO1 inhibitoren 5-Br-brassinin

per os

, 5 dage /uge i tre uger), som beskrevet i [27]. I begge eksperimentelle sæt, blev tumorvæksten målt dagligt ved caliper og blev beregnet ifølge ligningen (LxB

2) /2, hvor L = tumorlængde og W = tumor bredde. Mus blev aflivet på dag 21. De eksperimentelle procedurer blev godkendt af bioetiske komité ( “Comitato Etico di Ateneo”) fra University of Torino, Italien.

Cytokine produktion

Produktionen af ​​cytokiner blev målt i cellekultursupernatanten ved anvendelse af følgende kommercielle kit: Humant interleukin-6 (IL-6) Duo Set Development kit (R resultaterne blev udtrykt som procent af levedygtige celler versus ubehandlede celler.

Nitrite måling

Niveauet af nitrit, et stabilt derivat af NO, i cellekultursupernatanterne blev målt ved Griess-metoden [ ,,,0],29]. Resultaterne blev udtrykt som nmol nitrit /mg celleproteiner.

Iron måling

100 x 10

6 celler blev vasket med PBS, fritliggende med trypsin /EDTA, centrifugeret ved 12.000 xg i 2 min, resuspenderes i 1 ml PBS og lydbehandlet. Den intracellulære jern blev målt under anvendelse af en AAnalyst 200 Atomabsorptionsspektrometer (PerkinElmer). Resultaterne blev udtrykt som ng jern /ml cellesuspension.

Statistisk analyse

Alle data i tekst og tal er givet som middelværdi ± SD. Resultaterne blev analyseret ved en envejs variansanalyse (ANOVA). En

s

0,05 blev betragtet som signifikant.

Resultater

Kynurenin syntese er højere i multidrug resistente celler og moduleres af 5-Br-brassinin, methyl-DL-tryptophan og interferon-γ

Vi analyserede først kynurenin produktion i et panel af chemosensitive og multilægemiddelresistente cancerceller, der viser et andet mønster af ABC transportører (S1 Fig): HT29, A549, K562, Met5A var humane chemosensitive celler; HT29 /dx, A549 /dx og K562 /dx var modeller af erhvervet MDR; HMM og JC var human og murin konstitutivt kemoresistent celler. Multidrug resistente cellelinier havde højere kynurenin niveauer-detekteret ved HPLC (S2 Fig) og spektrofotometrisk assay (Fig 1A) -og forøgede niveauer af IDO1 protein sammenlignet med chemosensitive celler (Fig 1B). IDO2 blev opdaget ved varierende mængder i chemosensitive og kemoterapi celler; TDO blev påvist i alle cellelinjer analyseret, undtagen i A549 /dx celler (Fig 1B).

IDO1

mRNA resulterede også højere i multiresistent celler end i chemosensitive dem (Fig 1C).

Humane chemosensitive lungekræft A549 celler og kemoterapi A549 /dx celler, humane chemosensitive tyktarmskræft HT29-celler og kemoterapi HT29 /dx celler, humane chemosensitive kronisk myeloid leukæmi K562-celler og kemoterapi K562 /dx celler, human chemosensitive mesothelial Met5A celler og menneskelige kemoterapi malignt mesotheliom HMM celler blev murine kemoterapi mamma JC celler underkastet følgende undersøgelser. A. kynurenin niveauer i cellekultursupernatanterne blev målt spektrofotometrisk. Data er præsenteret som middelværdi ± SD (n = 4). * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001: kemoresistent celler (MDR-positive) versus de tilsvarende chemosensitive (MDR-negative) celler. B. Western blot-analyse af IDO1, IDO2 og TDO ekspression. Den β-tubulin ekspression blev anvendt som kontrol af samme protein loading. Figuren repræsenterer 3 eksperimenter med lignende resultater. C. Ekspressionsniveauet af

IDO1

mRNA blev målt ved QRT-PCR. Data er præsenteret som middelværdi ± SD (n = 4). * P 0,01, ** p 0.002:. Kemoterapi celler (MDR-positive) versus de tilsvarende chemosensitive (MDR-negative) celler

Menneskelig kemoterapi A549 /dx celler og HT29 /dx celler voksede hurtigere end de chemosensitive A549 og HT29-celler implanteres i nøgne BALB /c-mus (figur 2A). De murine kemoterapi JC celler havde den højeste vækstrate (Fig 2A). Interessant nok IDO1 inhibitoren 5-Br-brassinin [27] hæmmede ikke væksten af ​​A549 /dx og HT29 /dx tumorer, implanteret i immunsvækkede mus, men det betydeligt reduceret progression af JC tumorer, implanteret i immunkompetente dyr (Fig 2B ). Disse data tyder på, at IDO aktivitet kan understøtte den hurtige vækst af kemoterapi tumorer hos immunkompetente værter.

A. 1 x 10

5 human A549, A549 /dx, HT29, HT29 /dx celler blev implanteret subkutant i 6-8 uger gamle hun nøgne BALB /c-mus, 1 x 10

5 murine JC-celler blev implanteret i immunkompetente BALB /c-mus. Tumorvækst blev monitoreret dagligt ved caliper måling. Data er præsenteret som middelværdier ± SD af 10 mus /gruppe. * P 0,02, ** p 0,005, *** p 0,001: A549 /dx eller HT29 /dx celler versus A549 eller HT29-celler, på de tilsvarende tidspunkter. B. Dyr med A549 /DX, HT29 /DX, JC-tumorer blev randomiseret i to grupper, når tumorer nåede volumen på 100 mm

3: “Control” gruppe (behandlet med 100 pi af saltopløsning

per os

, 5 dage /uge i tre uger, CTRL); “Brassinin” (behandlet med 400 mg /kg af IDO1 inhibitoren 5-Br-brassinin

per os

, 5 dage /uge i tre uger, BRA). Tumorvækst blev monitoreret dagligt ved caliper måling. Data er præsenteret som middelværdier ± SD af 6 mus /gruppe. ** P 0,005:. BRA-gruppe versus CTRL-gruppe, på de tilsvarende tidspunkter

Vi næste undersøgt årsagen til forskellen i kynurenin produktion mellem chemosensitive og kemoterapi celler. For nemheds skyld har vi fokuseret på A549 og A549 /dx celler som modeller for chemosensitive og multilægemiddelresistente celler, henholdsvis for i disse celler forskellen i kynurenin niveauer og IDO1 ekspression var meget klart. Da HPLC-måling og den spektrofotometriske analyse gav overlejres resultater for A549 og A549 /dx celler (S2 Fig og Fig 1A), anvendte vi det sidstnævnte assay som en pålidelig metode til at vurdere forskelle i kynurenin niveauer mellem disse to cellelinier.

Vi analyserede, om kynurenin niveauer varierede forskelligt i afhængighed af kemoterapeutiske lægemidler, hvortil multilægemiddelresistent celler er insensitive-, til IDO1 aktivatorer, såsom NO, jern og IFN-γ, og at IDO1 inhibitorer, såsom 5- Br-brassinin og methyl-DL-tryptophan [30].

Doxorubicin, cisplatin, gemcitabin og mitoxantron, anvendes ved koncentrationer, der reduceres til 50% levedygtighed følsomme A549-celler uden at påvirke levedygtigheden af ​​resistente A549 /dx celler (S3A Fig), ikke ændre kynurenin niveauer, der forblev signifikant højere i A549 /dx celler end i A549-celler, enten i fravær eller i nærværelse af kemoterapeutiske midler (S3B Fig). Tilsvarende NO donorer S-nitrosoglutathion og S-nitroso-N-acetylpenicillamin, som steg niveauet af NO i chemosensitive og multidrug resistente celler (S4A Fig), ikke ændre kynurenin syntese i forhold til ubehandlede celler i begge cellepopulationer (s4b fig). At modulere intracellulær jern behandlede vi A549 og A549 /dx celler med cellen permeable jern-frigivende forbindelse FeNTA og med jernkelator desferroxamine, som henholdsvis forøget og formindsket mængden af ​​celle jern (S5A Fig): igen, hverken FeNTA eller desferroxamine varierede kynurenin produktion (S5B fig).

IFN-γ øgede kynurenin niveauer i både chemosensitive og multidrug resistente celler, men omfanget af denne stigning var større i A549 /dx-celler (fig 3A). Virkningen af ​​IFN-γ, som blev reduceret med inhibitorerne methyl-DL-tryptophan og 5-Br-brassinin (Fig 3A), var forbundet med stigningen i

IDO1

mRNA (Fig 3B) og protein ( fig 3C). Også i dette tilfælde var stigningen fremkaldt af IFN-γ var mere udtalt i A549 /dx end i A549-celler (fig 3B og 3C), hvilket antyder, at de multilægemiddelresistente celler var mere følsomme over for cytokinet. Lignende effekter af IFN-γ, methyl-DL-tryptophan og 5-Br-brassinin blev påvist i HT29 og HT29 /dx celler, K562 og K562 /dx celler, Met5A og HMM celler (data ikke vist).

A549 og A549 /dx celler blev inkuberet i 48 timer i frisk medium (CTRL) eller i medium indeholdende IDO1 inhibitorer methyl-DL-tryptophan (1 mmol /l, mTrp) eller 5-Br-brassinin (100 pmol /l, BRA), og IDO1 inducer IFN-γ (100 ng /ml, IFNy), alene eller i kombination. A. kynurenin niveauer i cellekultursupernatanterne blev målt spektrofotometrisk. Data er præsenteret som middelværdi ± SD (n = 4). * P 0,01: versus A549 CTRL celler; °°° p 0,001: versus A549 /dx CTRL;

◊◊ p 0,005: IFN-γ + mTrp-behandlet, IFN-y + BRA-behandlede A549 og A549 /dx celler versus de tilsvarende celler behandlet med IFN-γ alene. B. Ekspressionsniveauet af

IDO1

mRNA blev målt ved QRT-PCR. Data er præsenteret som middelværdi ± SD (n = 4). *** P 0,001: versus A549 CTRL celler; °°° p 0,001: versus A549 /dx CTRL-celler. C. Western blot-analyse af IDO1 ekspression. Den β-tubulin ekspression blev anvendt som kontrol af samme protein loading. Tallet er repræsentativt for 3 eksperimenter med lignende resultater.

multiresistent celler har en højere aktivitet af JAK /STAT signalering og en øget autokrine produktion af STAT3-afhængige cytokiner end chemosensitive celler

Da IFN-γ aktiverer JAK /STAT1-3 signalering [31], og STAT1 og STAT3 er potente transkriptionelle aktivatorer af

IDO1

gen i de fleste pattedyrceller [32, 33], vi analyserede ekspressionsniveauerne vigtige gener af JAK /STAT pathway af en high-throughput PCR-screening. Som vist i S1 tabel og figur 4A, har A549 /dx celler ikke forskellige fra A549-celler til ekspression af

JAK1-2-3

, men udviste højere ekspression af

STAT1

STAT3

. I tråd med denne tendens, klassisk STAT1- og STAT3 målgruppen gener (

A2M

,

BCL2L1

,

CDKN1A

,

CRP

,

CXCL9

,

FAS

,

IRF1

,

JunB

,

MMP3

,

MYC

,

NOS2

,

SOCS1

) var opreguleret i multidrug resistente celler (S1 tabel). I Western blotting validering, fandt vi tilsvarende niveauer af totalt JAK1 protein i hele cellelysater af A549 og A549 /dx celler, men højere niveauer af det aktive tyrosin-phosphoryleret JAK1 i multilægemiddelresistente celler (Fig 4B). Mængderne af STAT1, phospho (Tyr701) -STAT1, STAT3, phospho (Tyr705) -STAT3 var også højere i kemoterapi celler (Fig 4B). MRNA-niveauet af STAT1 inhibitoren PIAS1 var ikke signifikant forskellig mellem A549 og A549 /dx celler (S1 Tabel og figur 4A), og niveauet af PIAS1 protein var den samme i de nukleare ekstrakter (Fig 4C). Derimod nukleare mængde af STAT3 inhibitor PIAS3 var lavere i A549 /dx celler (figur 4C); dette var i overensstemmelse med det lavere niveau af

PIAS3

mRNA (S2 tabel). Interessant, STAT1, phospho (Tyr701) -STAT1, STAT3, phospho (Tyr705) -STAT3 blev alle mere translokeres til kernen af ​​multidrug-resistente celler (Fig 4C). Dette mønster, hvilket sandsynligvis skyldes den større mængde og phosphorylering af STAT1 /STAT3 og til den nederste udtryk PIAS3, førte os til at hypotesen, at STAT1- og især, STAT3-målgener bør være opreguleret i multiresistent celler.

A. Den cDNA fra A549 og A549 /dx celler blev analyseret ved en PCR-array specifik for JAK /STAT signalering, som rapporteret under Materialer og metoder. Folden regulering af de 83 gener analyserede, udtrykt i logaritmisk skala, er repræsenteret i en farvemaalingsskala. Figuren er middelværdien af ​​4 forsøg. B. Cellerne blev lyseret og udsat for Western blot analyse for phospho (Tyr 1022/1023) -JAK1, JAK1, phospho (Tyr701) -STAT1, STAT1, phospho (Tyr705) -STAT3, STAT3. * P * P * P * P * P 0,05, ** p * P * P