PLoS ONE: Overekspression af CD157 Bidrager til Epithelial kræft i æggestokkene Progression ved Fremme Mesenchymale Differentiering

Abstrakt

Epitelial ovariecarcinom (EOC) er en aggressiv tumor ofte diagnosticeret på et fremskredent stadium, hvor der er ringe eller ingen udsigt til helbredelse. Trods fremskridt i kirurgiske og kemoterapeutiske strategier, er blevet opnået kun marginale forbedringer i patientens udfald. Derfor optrevling de biologiske mekanismer der ligger til grund EOC progression er afgørende for at forbedre patienternes overlevelse. Vi har for nylig rapporteret, at CD157 (en ectoenzyme regulering leukocyt diapedesis) udtrykkes i EOC og at høj ekspression af molekylet er negativt korreleret med sygdommen resultat i patienter. Her viser vi, at tvungen overekspression af CD157 i OVCAR-3, TOV-21G, A2780 og OV-90 ovarian cancer cellelinjer fremmer morfologiske og fænotypiske ændringer karakteriseret ved forstyrrelse af intercellulære junctions, nedregulering af epiteliale markører og opregulering af mesenchymale dem. Disse ændringer i celleform og fænotype bringe til nedsat følsomhed over for anoikis, øget forankringsuafhængig vækst, cellemotilitet og mesotelial invasion. Omvendt knockdown af CD157 i OV-90 og OC314 celler vender den mesenkymale fænotype og reducerer cellernes vandrende potentiale. Transkriptom profilering analyse fremhævet 378 betydeligt differentielt udtrykte gener, der repræsenterer underskrift CD157-overekspression OVCAR-3 og OV-90 celler. Modulering af udvalgte gener udslag i ændring af proteinekspression, der giver cellerne en meget malign fænotype. Det samlede billede udledt fra analysen af ​​de modulerede transkripter er, at høj ekspression af CD157 styrker en række biologiske processer, der fremmer tumor progression (herunder udvikling og cellemotilitet), og svækker flere biologiske processer, der hindrer tumorudvikling (såsom apoptose, celledød og reaktion på stress). Tilsammen udgør disse fund implicerer CD157 i udviklingen af ​​EOC til metastatisk sygdom og foreslå, at CD157 kan repræsentere en værdifuld terapeutisk mål

Henvisning:. Morone S, Lo-Buono N, PARROTTA R, Giacomino A, Nacci G, Brusco A, et al. (2012) Overekspression af CD157 Bidrager til Epithelial kræft i æggestokkene Progression ved Fremme Mesenchymale Differentiering. PLoS ONE 7 (8): e43649. doi: 10,1371 /journal.pone.0043649

Redaktør: Sandra Orsulic, Cedars-Sinai Medical Center, USA

Modtaget: April 3, 2012; Accepteret: 23, 2012; Udgivet: 20 August, 2012

Copyright: © Morone et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Støttet af tilskud fra den italienske sammenslutning for Cancer Research (AIRC, MFAG6312 og IG 11602 til EO), fra det italienske ministerium for University og videnskabelig forskning (PRIN og 60% Projekter til aF) og fra International Foundation for Forskning i Experimental Medicine. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Epithelial ovariecancer (EOC) er en aggressiv og dødelig gynækologisk malignitet. Over 70% af patienterne til stede med fremskreden sygdom, og trods aggressiv behandling, de 5-års overlevelsesraten for patienter med EOC er under 50%. Denne dårlig prognose skyldes vanskeligheden ved diagnose i de tidlige kliniske faser og manglen på en effektiv behandling for avanceret-trins tumorer. Forståelse af de biologiske mekanismer, der regulerer udviklingen af ​​EOC er derfor afgørende for at udtænke nye behandlingsmuligheder og forbedre patienternes overlevelse.

EOC menes at opstå fra æggestokkene overfladeepitelet at linjer ovarie. EOC celler kan kaste fra den primære tumor og, fordi ingen anatomiske barriere er til stede, spredes direkte i hele den peritoneale kavitet og derefter formidle hovedsageligt via det lymfatiske system, udvikle de nødvendige forsvarsmekanismer for overlevelse under forankringsuafhængige vej [1]. I tumoren miljø, lokaliseret proteolytisk nedbrydning af den ekstracellulære matrix (ECM) letter migreringen af ​​flydende celler, så de kan forankre til mesothelium og efterfølgende invadere det, oprettelse tumorer ved sekundære steder. formidling Tumor indebærer en fænotypisk omdannelse af epitelceller, som ikke motile, i mesenchymale celler. Denne proces har bemærkelsesværdige ligheder med epitelial-mesenkymale overgang (EMT) opstår under embryonale [2] udvikling. Faktisk er type 3 eller onkogen EMT i stigende grad anerkendt som en dynamisk og forbigående mekanisme, hvorved celler i primære ikke-invasive tumorer erhverve egenskaber afgørende for migration, invasion, metastatisk spredning og modstandsdygtighed over for apoptose [3]. EMT program kan være fremkaldt af en række kontekstuelle signaler, som cellerne kan opleve i tumoren mikromiljø; uanset triggersignaler, er aktivering af EMT forbundet med dårlig klinisk resultat i forskellige typer af tumorer, herunder ovariecancer [4]. Celleoverflademolekyler involveret i styring af processer såsom celle-celle, celle-ECM vedhæftning, lokaliseret intraperitoneal migration og invasion af bughinden ved flydende celler eller celle aggregater (sfæroider) menes at spille en ledende rolle i EOC progression og i sidste ende i patienternes resultat.

CD157 /BST-1, et GPI-forankret medlem af en familie af NADase /ADP-ribosyl cyclase, er en ectoenzyme der spalter ekstracellulær nikotinamidadenindinukleotid (NAD

+) , genererer cyklisk ADP ribose (cADPR) og ADPR [5], [6]. Desuden CD157 fastlægger funktionelle og strukturelle interaktioner med andre transmembrane molekyler og dermed får evnen til at transducere intracellulære signaler [7] – [9]. Selv CD157 oprindeligt blev karakteriseret som en stromal [10] og myeloid overflade glycoprotein [11] er involveret i kontrollen af ​​cellevandring og diapedese [12] har vi for nylig påvist, at CD157 også er udtrykt ved 90% af den primære EOC og at høje niveauer af CD157 er forbundet med hurtig tumor tilbagefald hos patienter med EOC. Konsekvent med disse resultater, hæmning af CD157-aktivitet, ved et specifikt monoklonalt antistof (mAb)

in vitro

eller ved dens svage udtryk i patienter, der er forbundet med nedsat tumorceller invasion og migration. Foreningen af ​​CD157 med EOC aggressivitet er blevet yderligere underbygget af den iagttagelse, at eksogen udtryk for CD157 i næppe motile, CD157-negative EOC-celler i væsentlig grad øger celle motilitet, en forudsætning for invasion tumorceller i omgivende væv [13].

Implikationen af ​​CD157 i tumorcellemotilitet og invasiv, og dens association med dårligt resultat i æggestokkene kræftpatienter, fik os til at yderligere at undersøge sin biologiske rolle i EOC progression hjælp manipuleret æggestokkene kræft cellelinjer som en eksperimentel model. Det endelige mål var at forstå, hvordan funktionen af ​​CD157 kan bidrage til en mere aggressiv kræft i æggestokkene, og om CD157 kan være nyttigt i bistå forvaltningen af ​​disse patienter.

Materialer og metoder

cellelinier og reagenser

de humane EOC cellelinier OVCAR-3 og OV-90 og den ikke-malign pleural mesothelial cellelinie Met-5A blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). De EOC cellelinjer TOV-21G og A2780 blev leveret af M. F. Di Renzo (universitetet i Torino, Italien) og OC314 blev leveret af S. Ferrini (Institute for Cancer Research og behandling, Genova, Italien). Den anti-CD157 mAb (SY /11B5, venligst stillet til rådighed af F. Malavasi, universitetet i Torino, Italien) blev produceret i forfatternes laboratorier og affinitet renset på protein G (Sigma-Aldrich). Alexa-488 mærket F (ab ‘)

2 brøkdel af gedeantistoffer til muse IgG eller til kanin-IgG var fra Molecular Probes (Milano, Italien). Anti-E-cadherin mAb var fra BD Biosciences (Milano, Italien), anti-snail, anti-Zeb1, anti-EpCAM, anti-VCAN, anti-BMP7, anti-tubulin, anti-β-catenin, anti-N- cadherin og anti-β-actin-peberrodsperoxidase (HRP) mAb var fra Santa Cruz Biotechnologies (Santa Cruz, CA), anti-lamin B1 var fra Abcam (Cambridge, UK). TRITC-mærkede phalloidin anvendes til påvisning F-actin var fra Sigma-Aldrich. GM6001 (matrixmetalloproteaser hæmmer) var fra Enzo Life Science (Vinci Biochem, Vinci, Italien).

CD157 Gene Transfektion og shRNA Lentiviral Particle Transduction

Celler blev transficeret med den eukaryote ekspressionsvektor pcDNA3. 1 indeholdende cDNA for fuld-længde CD157 eller intet insert (mock), som beskrevet [13]. Celler blev dyrket i RPMI-1640 eller MCDB131 /M199 (vol /vol) dyrkningsmedium (Sigma-Aldrich, Milan, Italien) suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS, Biochrom Seromed, Milano, Italien). Celler blev holdt ved 37 ° C og 5% CO2 og testet for

Mycoplasma

forurening.

CD157 ekspressionen i OV-90 og OC314 celler bragt til tavshed af lentiviral levering af PLV-puro (Biosettia, San Diego, CA), der koder en kort hårnål RNA (shRNA) målretning BST-1-mRNA (målsekvenser 5′-GAGTCAGACTGCTTGTATA-3 ‘(shCD157) og 5′-CCTGAGCGATGTTCTGTAT-3’ (shCD157 # 2); krypteret sekvens 5 ‘ -TTCTCCGAACGTGTCACGTT-3 ‘). Partikler blev dannet som beskrevet tidligere [14]. Celler blev inkuberet med passende lentivirale supernatanter og Polybrene (8 ug /ml, Sigma-Aldrich). Transducerede celler undergik udvælgelse i 2 ug /ml puromycine (Santa Cruz Biotechnologies) i 3 dage.

(A) SQRT-PCR af ektopisk CD157 ekspression i OVCAR-3 celler (top). GAPDH blev anvendt som en intern kontrol. Western blot analyse af CD157 i OVCAR-3 /CD157 og OVCAR-3 /mock celler (nederst). Den anti-β-actin mAb blev anvendt som en loading kontrol. (B-C) Morfologi af OVCAR-3 /mock og OVCAR-3 /CD157-celler. Repræsentative kolonier visualiseret efter krystalviolet farvning under anvendelse af et IX70 omvendt mikroskop udstyret med et UC30 kamera og CellF analyse software (Olympus Biosystems) er vist. (B, skala bar: 200 uM, C, skala bar: 20 uM). (D) Konfokal mikroskopi-analyse af F-actin. Celler blev dyrket på gelatineovertrukne dækglas, fikseret med 2% PFA, permeabiliseret med 0,2% Triton-X 100 og farvet med phalloidin-TRITC. Prøver blev analyseret under anvendelse af et Olympus FV300 laser scanning konfokal mikroskop. Celler blev afbildet under anvendelse af et 60 x olie nedsænkning objektiv (1,4 NA). (Scale bar: 20 uM). Mikrofotografier i B, C og D blev derefter gengivet i sort og hvid. (E) OVCAR-3 celler blev underkastet en celle-celleadhæsionsassay og klynger ( 5-celler) blev talt i 20 forskellige felter /skål. Resultaterne repræsenterer middelværdien ± SEM af fire uafhængige forsøg. ** P 0,01, to-halet t-test. (F) Aggregater dannes ved anvendelse af hængende dråbe-metoden og inkubation natten over ved 37 ° C blev mekanisk spredt og derefter fotograferet under fasekontrastmikroskop (skala bar: 50 uM). (G) Induktion af anoikis i OVCAR-3 /CD157 og OVCAR-3 /mock celler efter 72 timers dyrkning på poly-HEMA-coatede plader. Fasekontrastmikroskopi billeder viser dannelsen af ​​store flydende aggregater i OVCAR3 /mock celler og små aggregater eller enlige isolerede celler i OVCAR3 /CD157-celler (skala bar: 200 uM). (H) Efter 24, 48 og 72 timer af forankringsuafhængig vækst blev celler fikseret, permeabiliseret, farvet med propidiumiodid og analyseret med et FACSCanto. Dataanalyse blev udført med ModFit LT ™ cellecyklusanalyse software. Anoikis i OVCAR-3 /mock og OVCAR-3 /CD157-celler blev bestemt ved måling af procent af sub-G1 celler. Resultaterne repræsenterer middelværdien ± SEM for tre uafhængige forsøg. * P 0,05; ** P 0,01, to-halet t-test. (I) Repræsentative histogrammer af cellecyklus status mock og CD157-positive OVCAR-3 celler efter 48 timers forankringsuafhængig vækst. (J) forankringsuafhængig vækst af OVCAR-3 /CD157 og mock celler blev analyseret ved blød agar-kolonidannelse assayet. Graf repræsenterer det gennemsnitlige antal kolonier dannet ud fra tre uafhængige eksperimenter ± SEM efter 3 uger inkubering af celler i blød agar. * P. 0,05, to-halet t-test

Western blot-analyse

Totale cellelysater blev opnået ved inkubering i RIPA-lysepuffer (50 mM Tris HCI, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% natriumdeoxycholat, 1 mM EDTA, 0,1% SDS suppleret med 1 mM Na

3VO

4, 5 mM NaF, 50 ug /ml aprotinin og leupeptin). Cytosoliske ekstrakter blev opnået ved inkubering af celler i 10 minutter ved 4 ° C med hypotonisk pufferopløsning indeholdende 20 mM Tris-HCI pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCb

2 og 50 ug /ml proteaseinhibitorcocktail (Sigma-Aldrich ). Suspensionen blev behandlet med en 0,5% NP40 opløsning, og den opnåede homogenat blev centrifugeret (3.000 rpm, 10 minutter ved 4 ° C). Nukleare ekstrakter blev fremstillet ved inkubering pelleten opnået som beskrevet ovenfor i RIPA lysepuffer i 30 minutter. Efter 30 minutters centrifugering ved 14.000 rpm ved 4 ° C blev proteinkoncentrationen bestemt ved anvendelse af Bradford-assayet (Bio-Rad Laboratories). Western blotting blev udført som tidligere beskrevet [13]. Kort fortalt blev lige store mængder (30 mg) af proteinekstrakter fra celler separeret ved 10% SDS-polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) under ikke-reducerende betingelser og elektro-overført på en polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner, derpå blokeret og probet med angivet mAb. Efter inkubering med de passende HRP-konjugeret antistoffer (Santa Cruz bioteknologi) blev immunreaktive bånd detekteret ved forøget kemiluminescens (Perkin Elmer, Monza, Italien). Billeder blev taget med en ChemiDoc ™ XRS + System og densitometri analyse blev udført med Image Lab ™ Software (Bio Rad, Milano, Italien).

Cell Colony Spredning Assay og blød agar Colony Formation

Celler (500 /brønd) blev podet i plader med 6 brønde og opretholdt i dyrkningsmedium suppleret med 5% FCS i 14 dage, derefter vasket, fikseret i methanol i 30 minutter, farvet med krystalviolet (Sigma-Aldrich) og visualiseret under anvendelse af et IX70 omvendt mikroskop udstyret med et UC30 kamera og CellF analyse software (Olympus Biosystems).

i blød agar assays 6 × 10

2-celler blev blandet med 0,45% agar opløsning i RPMI indeholdende 10% FCS og lagdelt oven på 0,9% baseagar lag i plader med 24 brønde. Analyser blev udført tre gange. Efter 2-3 uger ved 37 ° C i en CO 5%

2 inkubator blev kolonier visualiseret med et inverteret mikroskop og talt.

Cell-celleadhæsion og celleaggregering Assays Salg

blev udført celle-celle-adhæsion eksperimenter som beskrevet [15]. Kort fortalt blev enkeltcellesuspensioner podet på 0,5% agarose-coatede dyrkningsskåle (1 ml /brønd, 30 minutter ved 37 ° C) for at forhindre celleadhæsion og langsomt rystet i 2 timer ved 37 ° C.

celleaggregering assays blev udført ved anvendelse af hængende dråbe-metoden, som beskrevet [16]. Kort beskrevet blev celler (5 x 10

3/25 pi RPMI 1640 medium med 5% FCS) blev podet på den indre overflade af låget af en petriskål. For at forhindre fordampning, blev 10 ml phosphatpufret saltvand (PBS) anbringes i skålen. Efter inkubation natten over ved 37 ° C, blev celleaggregater mekanisk spredt og fotograferet ved hjælp af et fasekontrast-mikroskop.

anoikis Assay

Celler (5 x 10

5 /brønd) blev dyrket på 20 mg /ml poly-HEMA (polyhydroxyethylmethacrylat, Sigma-Aldrich) -behandlede 6-brønds plader i 24 til 72 timer. Derefter blev celleaggregater dispergeret, og cellerne blev fikseret med iskold 75% ethanol (volumen /volumen) natten over ved 4 ° C. Celler blev behandlet med 100 ug /ml RNase A (Sigma-Aldrich, 30 minutter ved 37 ° C), farves med 10 ug /ml propidiumiodid (10 minutter ved 4 ° C), og prøver blev analyseret med et FACSCanto (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA). Dataanalyse blev udført ved hjælp ModFit LT ™ cellecyklus analyse software (Verity Software House, Topsham, ME). Anoikis blev bestemt ved måling af procent af sub-G1 celler.

immunfluorescensfarvning og konfokal mikroskopi

I konfokal mikroskopi eksperimenter blev celler dyrket til subkonfluens på gelatineovertrukne dækglas, fikseret med 4% paraformaldehyd (PFA) i 30 minutter ved 20 ° C, vasket og permeabiliseret med 0,1% Triton X-100 i phosphatpufret saltvand med 1% normalt gedeserum og 1% BSA i 15 minutter ved 20 ° C. Celler blev inkuberet med de angivne primære antistoffer, efterfulgt af Alexa Fluor-488-konjugerede sekundære antistoffer. Prøverne blev analyseret med et Olympus FV300 laserscanning konfokal mikroskop udstyret med en Blue Argon (488 nm) laser, en grøn Helium Neon (543 nm) laser, og FluoView 300 software (Olympus Biosystems, Hamburg, Tyskland). Celler blev afbildet under anvendelse af et 60 x olie nedsænkning objektiv (1,4 NA) og 10 × okulær linse. Nomarski billeder blev opnået ved differentiel interferens kontrast (DIC) optiske komponenter, der er installeret på en IX71 omvendt mikroskop. Semikvantitativ analyse af E-cadherin junktionel farvning blev udført ved at tælle mindst 10 felter per prøve (mindst 200 celler overordnede) og scorede så positivt antallet af celler med to resterende fluorescerende celle-celle grænser.

RNA udvinding og revers transkriptase-PCR

Totalt RNA (2 ug) udvundet fra 70-80% konfluerende kulturer ved hjælp TRIZOL® reagens (Invitrogen, S. Giuliano Milanese, Italien) blev omvendt transskriberet med M-MLV Reverse transcriptase (Invitrogen) og Oligo-dT-primere. cDNA blev amplificeret under anvendelse KAPA2G Fast HotStart DNA Polymerase (Kapa Biosystems, Cambridge, MA). Hver cyklus bestod af denaturering ved 94 ° C i 10 sekunder, annealing i 10 sekunder og forlængelse ved 72 ° C i 1 sekund. I semi-kvantitativ analyse (SQRT-PCR), blev det passende antal cyklusser for forblive inden den eksponentielle fase bestemt for hvert substrat. De anvendte primere er rapporteret i tabel S1. PCR-produkter blev derefter analyseret ved agarosegelelektroforese.

SYBR Green Real-time RT-PCR (QRT-PCR)

Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af RNeasy mini kit (Qiagen, Milano, Italien ) ifølge producentens anvisninger. QRT-PCR blev udført under anvendelse af SYBR Green JumpStart Taq Readymix (Sigma-Aldrich) og en ABI 7500 Fast Sequence Detection System (Applied Biosystems-, Foster City, CA, USA). PCR cyklingsbetingelser blev udført for alle prøver som følger: 95 ° C i 10 minutter efterfulgt af 40 cyklusser ved 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 1 minut. De anvendte primere er anført i tabel S2. PCR-reaktioner for hver skabelon blev udført tre gange i 96-brønds plader. Den sammenlignende CT metode (Applied Biosystems) blev anvendt til bestemmelse af genekspression i CD157-transficeret i forhold til den observeret i de tilsvarende kontrolceller værdi ved anvendelse TBP som normalisering kontrol.

(A) Konfokal mikroskopi-analyse af E- cadherin og (B) β-catenin ekspression i OVCAR-3 /CD157 og mock celler. Celler blev dyrket på et gelatineovertrukket dækglas, fikseret, permeabiliseret og farvet med anti-E-cadherin, og anti-β-catenin antistoffer efterfulgt af sekundær Alexa Fluor-488-mærket antistof. Prøver blev analyseret med et Olympus FV300 laser scanning konfokal mikroskop og ved Nomarski differentiel interferens kontrast (DIC) optik. For E-cadherin, en fluorescens billede fusioneret med DIC billede vises (skala bar: 50 uM). Semikvantitativ analyse af E-cadherin junktionel farvning blev bestemt ved at tælle mindst 10 felter /prøve (mindst 200 celler overordnede) og scorede så positive celler med to resterende fluorescerende intercellulære grænser. For β-catenin, er en fluorescerende billede vist. Indsat: amplificeret afbildning af en individuel OVCAR-3 /CD157 celle udviser diffus β-catenin-farvning i planen fokus skære gennem kernen. Stjerner svarer til nukleoler. (C) Western blotting for E-cadherin og β-catenin i OVCAR-3 /CD157 og mock celler. Densitometri kvantificerer ekspressionsniveauet af E-cadherin og β-catenin i forhold til p-actin. (D) β-catenin-niveauer i nukleare og cytoplasmiske fraktioner af OVCAR-3 /mock og OVCAR-3 /CD157-celler blev bestemt ved western blot-analyse. α-tubulin og lamin B1 (LamB1) blev anvendt som cytoplasmatiske og nukleare loading kontrol hhv. Densitometri kvantificerer ekspressionsniveauet af β-catenin i forhold til den korrekte kontrol. (E) SQRT-PCR for E-cadherin, N-cadherin, β-catenin og for E-cadherin transkriptionelle repressorer i OVCAR-3 /CD157 og mock celler. Densitometri kvantificerer niveauet af ekspressionen af ​​E-cadherin repressorer forhold til GADPH. (F) QRT-PCR for Zeb1, Sneglen og Twist1. Den sammenlignende CT metode blev anvendt til bestemmelse af genekspression i CD157-transficerede celler i forhold til den observeret i mock celler værdi ved anvendelse TBP som normalisering kontrol. Histogrammer rapporterer middelværdier ± SEM af tre QRT-PCR uafhængige forsøg, hver udført in triplo. * P 0,05, *** P 0,001;

ns

, ikke signifikant; to-halet t-test. (G) Western blot analyse, der viser niveauet for Sneglen og Zeb1 i OVCAR-3 /mock og OVCAR-3 /CD157 celler. Densitometri kvantificerer ekspressionsniveauet af begge proteiner i forhold til p-actin. Resultater, der er vist i hvert panel er repræsentative for tre uafhængige forsøg med lignende resultater.

sårheling Assay

Celler blev podet i seks brønde til sammenløb og en ridse blev derefter gjort tværs monolaget, som tidligere beskrevet [13]. Billeder af de sårede område blev registreret på de angivne tidspunkter. Hvert forsøg blev udført i fire eksemplarer og gentaget mindst tre gange.

Transmesothelial Migration assays og konfokal mikroskopi analyser

Met-5A-celler (2 x 10

5) blev mærket under anvendelse af et CellBrite ™ Red cytoplasmatiske membran Staining kit ifølge producentens anvisninger (Biotium Inc. Hayward, Californien), derefter podet på fibronectincoatede (10 ug /ml) dækglas og får lov at vokse til konfluens. Ovariecancerceller (1,5 × 10

5) blev farvet med 5 uM CFSE (carboxyfluorescein succinimidylester, Molecular Probes) og podet på Met-5A monolag i 6 timer (OVCAR-3 celler) eller 2,5 timer (OV-90 celler) ved 37 ° C. Ikke-adhærente tumorceller blev omhyggeligt fjernet, prøven fikseret med 2% PFA og derefter analyseret ved anvendelse af et Olympus FV300 laser scanning konfokal mikroskop. Celler blev afbildet under anvendelse af et 60 x olie nedsænkning objektiv (1,4 NA) ved sekventiel skanning af XY fly konstateret langs Z-aksen (trinstørrelse: 1,25 um). Celler blev talt på toppen, median og nederste fase og forholdet mellem celler på bunden etape til totale celler repræsenterer procentdelen af ​​celler, der migrerede gennem monolaget [17]. Hvor det er angivet, blev cellerne behandlet i 1 time med GM6001 (25 ug /ml) før podning på Met-5A mesothelial cellemonolag.

Gelatine og kaseinzymografi Assays Salg

OVCAR-3 og OV -90-transficerede celler blev podet i 48-brønds plader og dyrket til 80% konfluens og derefter inkuberet i yderligere 48 timer i FCS-frit medium. Matrixmetalloproteinaser (MMP’er) MMP2 og MMP9-aktivitet i det konditionerede medium blev analyseret ved anvendelse af 10% SDS-PAGE indeholdende 1 mg /ml gelatine (gelatine zymografi) [18], og MMP7 aktivitet blev visualiseret ved anvendelse af 12% SDS-PAGE indeholdende 1 mg /ml casein (kaseinzymografi) [19]. Geler blev farvet med Coomassie Brilliant Blue G-250 at visualisere proteaseaktivitet. Billeder blev taget med en ChemiDoc ™ XRS + System og densitometri analyse blev udført ved hjælp af billede Lab ™ Software.

Sfæroide Disaggregation Assay

Spheroids blev genereret med hængende dråbe metoden og deres opdeling på fibronectin-coatede plader (10 ug /ml) blev målt efter 12 timers inkubation ved 37 ° C, som beskrevet andetsteds [13]. Kort fortalt blev 96-brønds plader coatet med 10 ug /ml fibronectin og blokeret med BSA (1 mg /ml) i 1 time ved 37 ° C. Sfæroider (8-10 sfæroider /brønd) blev podet i serumfrit RPMI-1640 medium. For at spore individuelle sfæroider over tid, blev hver brønd fotograferet 30 minutter efter såning (tid 0) og efter 12 timer. Pixelarealet af sfæroiderne blev målt ved tiden 0 og 12 timer, og folden ændring i området blev beregnet som forholdet mellem pixel område af sfæroiderne efter 12 timer og ved tid 0.

Microarray hybridisering Dataindsamling og analyse

Total RNA blev ekstraheret fra dobbelte 70-80% sammenflydende kontrol cellelinier (OVCAR-3 /mock og OV-90 /mock) og afprøvning cellelinier (OVCAR-3 /CD157 og OV 90 /CD157), blev microarray probe forberedelse, hybridisering, scanning og billedanalyse udført som tidligere beskrevet [20]. To replikater, med farvestof swap, blev udført for hver prøve. Rå data udarbejdelse blev udført med BioConductor [21], ved hjælp af R statistisk sprog [22] anvendelse af et cut-off på P-værdi, justeret for multipel testning af Benjamini-Hochberg tilgang ( 0,01), efterfulgt af filtrering på ekspressionsniveau (logFC 1 eller -1 i mindst én cellelinje, eksklusive transkripter med modsat fortegn). Dette kriterium tillod identifikation af udskrifter med overensstemmende modulation og tog hensyn iboende biologiske forskelle i distinkte cellelinier, der måtte blive afspejlet i amplituden af ​​fold ændringer.

Gene ontologi, kanoniske vej, og funktionelle netværk blev udført hjælp både DAVID Knowledgebase [23] og MetaCore software fra GeneGo Inc., anvende en cut-off på berigelse P-værdier ( 0,05). Genekspression datasæt er deponeret i genekspression Omnibus (GEO) database, ID: GSE36364.

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=flktjkcsuyygcrm acc=GSE36364).

Statistical Metoder og Dataanalyse

Medmindre andet er angivet, værdier er udtrykt som middelværdi ± SEM. Sammenligninger mellem to grupper blev udført ved anvendelse af en uparret tosidet Students

t

test for normalfordelte variable. Statistiske analyser blev udført ved anvendelse SPSS Statistics 17 software (Chicago, IL) og GraphPad Prism 5 software (San Diego, CA). Alle statistiske tests var to-sidet. For alle analyser blev forskelle betragtes som signifikante ved P 0,05 (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001

versus

kontrol) og

ns

for ikke at væsentlig .

(A) KVROD-PCR (til venstre) og western blot analyse (til højre) af CD157 i OV-90 /CD157 og OV-90 /mock celler. GAPDH og β-actin blev anvendt som interne kontroller, hhv. (B) Morfologi af kolonier dannet af OV-90 /mock og OV-90 /CD157-celler. Repræsentative kolonier visualiseret efter krystalviolet farvning er vist. Målestok: 200 uM. (C) SQRT-PCR-analyse af E-cadherin og N-cadherin i OV-90 /mock og OV-90 /CD157-celler. Densitometri kvantificerer niveauerne af mRNA-ekspression af de angivne molekyler i forhold til GAPDH. (D) Effekt af CD157 overekspression på anoikis. Efter 48, 72. 96 og 192 timers forankringsuafhængig vækst, cellerne blev fikseret, farvet med propidiumiodid og analyseret med en FACSCanto. Anoikis i OV-90 /mock og OV-90 /CD157-celler blev bestemt ved måling af procent af sub-G1 celler. Resultaterne repræsenterer middelværdien ± SEM for tre uafhængige forsøg. * P 0,05; ** P 0,01, to-halet t-test. (E) forankringsuafhængig vækst af OV-90 /CD157 og mock celler blev analyseret ved blød agar-kolonidannelse assayet. Graf repræsenterer det gennemsnitlige antal kolonier dannet ud fra tre uafhængige eksperimenter ± SEM efter 3 uger inkubering af celler i blød agar. *** P 0,001, to-halet t-test. (F) Effekt af CD157 ekspressionen på celle migration i en ridse-sår assay i OV-90 /CD157 og mock celler. Celler blev dyrket som monolag, såret, og fotograferet ved tid 0 og efter 24 timer. Sårkanterne er angivet med sort stiplet linier (skala bar: 200 uM). (G) Cellernes evne til at lukke såret blev beregnet ved at måle 20 tilfældigt udvalgte afstande langs sårkanten ved tid 0 og efter 24 timer. Resultaterne repræsenterer den procentvise reduktion af den gennemsnitlige såret bredde og er udtrykt som middelværdien ± SEM af tre uafhængige forsøg. * P 0,05; to-halet t-test.

(A) SQRT-PCR (til venstre) og Western blot-analyse (til højre), der viser OV-90 celler retroviralt transduceret med en shRNA der retter sig mod den menneskelige CD157 mRNA, hvilket resulterer i effektiv knockdown af CD157 ekspression. GAPDH og β-actin blev anvendt som interne kontroller, hhv. (B) Morfologi af kolonier dannet af OV-90 /scramble og OV-90 /shCD157 celler. Repræsentative kolonier visualiseret efter krystalviolet farvning er vist. Målestok: 200 uM. (C) SQRT-PCR for E-cadherin, N-cadherin og Snail, Twist1 og Slug transkriptionelle repressorer i OV-90 /scramble og OV-90 /shCD157 celler. Densitometri kvantificerer niveauerne af mRNA-ekspression af de angivne molekyler i forhold til GAPDH. (D) anoikis assay. Efter 48, 72, 96 og 192 timer under forankringsuafhængig vækst blev celler fikseret, farvet med propidiumiodid og analyseret med et FACSCanto. Dataanalyse blev udført med ModFit LT ™ cellecyklusanalyse software. Anoikis i OV-90 /scramble og OV-90 /shCD157 celler blev bestemt ved at måle procentdelen af ​​sub-G1 celler. Resultaterne repræsenterer middelværdien ± SEM for tre uafhængige forsøg. * P 0,05; ** P 0,01, to-halet t-test. (E) forankringsuafhængig vækst af OV-90 /scramble og OV-90 /shCD157 celler blev analyseret ved blød agar-kolonidannelse assayet. Graf repræsenterer det gennemsnitlige antal kolonier /felt dannet af tre uafhængige eksperimenter ± SEM efter 3 uger inkubering af celler i blød agar. * P 0,05, to-halet t-test. (F) Effekt af CD157 knockdown på OV-90 celle migration i en ridse-sår assay. Cellerne blev dyrket som monolag, såret, og fotograferet på tidspunkt 0 og ved 24 timer (skala bar: 200 uM). Sårkanterne er angivet med sorte stiplede linier. (G) evne OV-90 /scramble og OV-90 /shCD157 celler til at lukke såret blev beregnet ved at måle 20 tilfældigt udvalgte afstande langs sårkanten ved tid 0 og ved 24 timer. Resultaterne repræsenterer den procentvise reduktion af den gennemsnitlige såret bredde og er udtrykt som middelværdien ± SEM af tre uafhængige forsøg. ** P. 0,01, to-halet t-test

Resultater

CD157 Expression Modulerer ovariecancerceller morfologi og celle-celle interaktion

Vi valgte OVCAR- 3 ovariecancerceller som den mest passende model til undersøgelse af virkninger induceret af CD157 ekspression, da de har en epitelial fænotype [24], er dårligt invasive, næppe motile på plastik og næppe forankringsuafhængig [25]. At undersøge den biologiske betydning af CD157 i ovariecancer progression, vi stabilt transficeret fuldlængde CD157 i CD157-negative OVCAR-3 celler (figur 1A). Lysmikroskopi billeder viste, at mock celler voksede som tæt knyttet klynger bestående af celler med typisk brosten-lignende epitel-morfologi. I modsætning hertil OVCAR-3 /CD157-celler udviste en mere spredt fordeling og aflange et særligt kendetegn ved fibroblastlignende celler, og dannede dårligt organiserede samlinger mellem tilstødende celler (figur 1B, C).