PLoS ONE: vækstdifferentieringsfaktor 15 (GDF-15) Plasma niveauerne stiger under Bleomycin- og Cisplatin-Based Behandling af testikelkræft Patienter og Relate til Endotel Damage

Abstrakt

Introduktion

Kemoterapi -relaterede endotel skader bidrager til den tidlige udvikling af kardiovaskulær morbiditet i testiklerne kræftpatienter. Vi havde til formål at identificere relevante mekanismer og søge efter kandidat biomarkører for denne endotel skader.

Metoder

Humane mikro-vaskulære endotelceller (HMEC-1) blev udsat for bleomycin eller cisplatin med ubehandlede prøver som kontrol. 18k cDNA-mikroarrays blev anvendt. Genekspression forskelle blev analyseret på enkelt gen og i gen-sæt klynger i biologiske veje og valideret af QRT-PCR. Protein niveauer af en kandidat biomarkør blev målt i testikelkræft patient plasma før, under og efter bleomycin-etoposid-cisplatin kemoterapi, og relateret til endotel skader biomarkører (von Willebrand faktor (vWF), høj følsomhed C-reaktivt protein (hsCRP)) .

Resultater

mikroarraydata identificerede flere gener med meget differentieret udtryk; f.eks. Vækstdifferentieringsfaktor 15 (

GDF-15

), Aktivering Transskription Factor 3 (

ATF3

) og Amphiregulin (

AREG

). Pathway analyse viste stærke associationer til “p53” og “diabetes mellitus” gen-sæt. Baseret på kendte funktion, vi målte GDF-15 protein niveauer i 41 testikelkræft patienter under klinisk opfølgning. Pre-kemoterapi GDF-15 niveauer var lig kontroller. Gennem kemoterapi GDF-15, vWF og hsCRP niveauer øges, og blev korreleret på forskellige tidspunkter.

Konklusion

En uvildig tilgang i en præklinisk model afslørede gener relateret til kemoterapi-induceret endotel skade , ligesom

GDF-15

. Stigningerne i plasma GDF-15 niveauer i testiklerne kræftpatienter under kemoterapi og dets samarbejde med vWF og hsCRP tyder på, at GDF-15 er en potentielt nyttig biomarkør relateret til endotel skader

Henvisning:. Altena R, Fehrmann RSN, Boer H, de Vries EGE, Meijer C, Gietema JA (2015) vækstdifferentieringsfaktor 15 (GDF-15) Plasma niveauerne stiger under Bleomycin- og Cisplatin-Based Behandling af testikelkræft Patienter og forholde sig til endotelskade. PLoS ONE 10 (1): e0115372. doi: 10,1371 /journal.pone.0115372

Academic Redaktør: Ramon Andrade de Mello, University of Algarve, Portugal

Modtaget: Maj 27, 2014; Accepteret: November 21, 2014; Udgivet: 15 Jan 2015

Copyright: © 2015 Altena et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. der blev leveret af RUG 2009-4365 fra den hollandske Kræftens Bekæmpelse. Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

indførelsen af ​​platinbaseret kemoterapi i slutningen af ​​halvfjerdserne har resulteret i høje helbrede satser i patienter med metastatisk testikelkræft. Men denne kemoterapi forårsager bivirkninger, hvilket resulterer i sygelighed i velbehandlede overlevende [1]. Relevante spørgsmål er de øgede risici for anden maligniteter og hjerte-kar-sygdom (CVD) [2-5]. CVD kan opstå under eller kort efter behandlingen [6, 7], samt år til årtier senere [3-5, 8-11].

En af de der er involveret i udviklingen af ​​denne mekanismer behandling-relaterede CVD er direkte endotel skade. Udover induktion af endotelcelle død [12-14], såvel bleomycin [14-16] og cisplatin [14, 17-19] indirekte påvirke endotelcellefunktion, fx gennem interferens med inflammatoriske og fibrinolytiske faktorer. I sidste ende kan dette kemoterapi-induceret cellulær aktivering videre til endotel dysfunktion, accelereret åreforkalkning og åbenlys CVD.

Tidlig erkendelse og muligvis forebygge disse behandlingsrelaterede komplikationer er afgørende for at opretholde en optimal helbredstilstand testikelkræft overlevende. Udviklingen af ​​CVD er en gradvis proces, og tidlig indsats eller intensiveret screening kan bremse eller stoppe progressionen mod åbenlys klinisk sygelighed. Biomarkører for behandlingsrelaterede endotel skader kan identificere de patienter med øget risiko for CVD.

I denne undersøgelse vi tilbage-oversat den kliniske fund, at bleomycin og cisplatin inducerer endotel skader. Vi anvendte en objektiv tilgang ved at analysere cDNA microarray resultater at identificere hidtil ukendte gener associeret med kemoterapi-relaterede endotelødelæggelse. Genekspressionsprofiler blev dannet fra den humane mikrovaskulære endotel cellelinie (HMEC-1) før og efter behandling med bleomycin og cisplatin på forskellige tidspunkter og koncentrationer. Kvantitativ Real Time PCR (QRT-PCR) blev udført for at bekræfte gener med signifikante udtryk forskelle i flere eksperimentelle indstillinger. Derefter baseret på kendt funktion af disse gener i litteraturen, valgte vi en af ​​disse kandidatgener for yderligere validering som bevis for princippet på proteinniveauet i en testikelkræft patient kohorte. Med denne translationel tilgang sigter vi på at identificere mekanismer og potentielle biomarkører for kemoterapi-relaterede endotel skader.

Materialer og metoder

Cell line model

HMEC-1 er en udødeliggjort human dermal mikro-vaskulær endotel cellelinje, der bevarer sin morfologiske og funktionelle endotheliale cellekarakteristika under flere passager [20]. Celler blev dyrket som et monolag i MCDB-131-medium (Invitrogen, Merelbeke, Belgien) suppleret med 10% føtalt kalveserum (Bodinco, Alkmaar, Nederlandene), 10 mM L-glutamin (Invitrogen, Merelbeke, Belgien), 1 ug /ml hydrocortison (Sigma-Aldrich, Amsterdam, Holland) og 10 ng /mL human epidermal vækstfaktor (R bleomycin 0,06 ug /mL eller cisplatin 0,52 uM) to gange om ugen; celler blev opsamlet til analyse på dag 30 (S1B Fig.). Administration af cisplatin skulle tilbageholdes på 7

th administration på grund af betydelig celledød, men fortsatte ved fuld dosis derefter. Bleomycin kan administreres uden afbrydelse.

cDNA microarray eksperimenter

Total RNA blev isoleret fra HMEC-1 ved en RNeasy kit (Qiagen, Venlo, Holland) og samlet for hver gang-point og lægemiddel fra 2 uafhængige eksperimenter. Efter oprensning (Qiaquick PCR oprensningskit, Qiagen, Venlo, Nederlandene), amplificeret RNA (cRNA) prøver blev transformeret til cDNA med revers transkriptase, uafhængigt mærket med Cy3 (grøn) og Cy5 (rød), og tilfældigt hybridiseret til kun- lavet 18K cDNA microarrays. Fluorescerende billeder af microarray objektglas blev opnået med Affymetrix GMS428 scanner (Affymetrix, Santa Clara, CA) for begge fluorophorer blev signalintensiteter for hver plet kvantificeret ved dedikeret Imagene 5.6 software (BioDiscovery, Marina del Rey, CA).

fraktilestime normalisering blev anvendt til log2 forvandlet Cy3 og Cy5 intensiteter. Operon v2.0 (Human Genome Oligo Set V2) probe identifikatorer blev konverteret til officielle HUGO gen symboler. Ekspressionsniveauer værdier af multiple prober rettet mod et enkelt gen blev midlet, hvilket resulterer i alt 15,950 unikke gener. Efterfølgende udtryk data indhentet fra flere hybridiseringer (

n

= 4) af de samme HMEC-1 eksemplar blev midlet.

De data er blevet deponeret i NCBI s Gene Expression Omnibus (GEO) og er tilgængelige gennem GEO Series tiltrædelse nummer GSE62523 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE62523).

klasse sammenligning

I den “akutte” indstilling eksponering, differentielt udtrykte gener mellem HMEC-1 ubehandlede prøver og prøver udsat for de forskellige medikamentdoser (dvs. IC

50 og IC

90) blev testet med det ikke-parametrisk Cuzick test for lineær tendens , hvilket resulterer i en

Z

score og en

P Drømmeholdet værdi. Denne test blev udført for celler opsamlet efter 6 (

t

= 6), 24 (

t

= 24) og 48 (

t

= 48) timer. For alle tre tidspunkter

Z

scor følge af Cuzick tester for lineær tendens blev opsummeret (dvs.

ΣZ

=

Z

t = 6 fotos +

Z

t = 24

+

Z

t = 48

); dermed vælge om gener med den begrænsning, at ændringer i udtryk i en konsekvent retning med stigende koncentrationer over tid. Gener blev rangordnet efter deres

ΣZ

score.

I “kronisk” eksponering indstilling blev en T-test udført på genekspression niveauer opnået fra prøver, der er udsat for de lægemidler (IC

10 cisplatin eller IC

10 bleomycin) versus de ubehandlede kontrolprøver, der blev indsamlet efter 30 dages inkubation. Resultater af disse gener blev rangordnet efter

P-

værdi.

Gene Set Berigelse Analyse

Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) [23] blev henrettet med GSEA 2.0-software pakke (Broad Institute, Cambridge, MA). Ekspressionsdata af alle 15,950 gener blev sammenlignet med funktionelt gen sæt til at afgøre, om nogen af ​​disse sæt blev beriget i HMEC-1 behandlet med bleomycin eller cisplatin i “akut” samt den “kronisk” indstilling eksponering. Sammenligningen blev udført under anvendelse af 169 gensæt fra Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes database (Kegg; https://www.genome.jp/kegg/). Statistisk signifikans af berigelse blev bestemt ved anvendelse af en empirisk genbaserede permutation test med 1000 permutationer. En falsk opdagelse sats (FDR) blev beregnet for hver funktionelt gen sæt, som repræsenterer den anslåede sandsynlighed for, at en given berigelse score repræsenterer en falsk positivt fund. Vi rapporterer gen sæt med en FDR ≤ 0,10 og

P

≤ 0,025.

Kvantitativ Real Time PCR

Differentiel udtryk for tre gener blev valideret af QRT-PCR. Til dette formål blev RNA-prøver, der indgår i cDNA microarray analyse. Desuden blev udført to uafhængige forsøg, hvor HMEC-1 blev udsat for cisplatin og bleomycin ifølge “akut” -exposure indstilling. RNA-prøver blev isoleret efter 6, 24 og 48 timers udsættelse for de lægemidler (S1A Fig.). Alle RNA-prøver var DNase behandlet for at udelukke genomisk DNA-kontaminering, og efterfølgende, RNA blev revers transkriberet til cDNA. QRT-PCR blev udført under anvendelse af Applied Biosystems TaqMan assays ifølge producentens protokol. Master Mix, primere og TaqMan prober blev købt fra Applied Biosystems (Nieuwerkerk a /d IJssel, Holland). Tre gener, med meget forskellig ekspression i tre ud af fire eksperimentelle indstillinger, blev anset for plausible kandidater til QRT-PCR validering. Generne og deres respektive Taqman genekspression assay numre var vækstdifferentieringsfaktor 15 (

GDF-15;

Hs00171132_m1), Aktivering Transskription Factor 3 (

ATF3,

Hs00231069_m1), Amphiregulin (

AREG,

Hs00155832_m1); derudover ekspression af housekeeping-genet glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (

GAPDH

; Hs02758991_g1) blev bestemt. Alle eksperimenter blev udført tredobbelt under anvendelse af ABI PRISM 7900 HT Sequence Detection System, med følgende cykliseringsbetingelser: 2 minutter ved 50 ° C, 10 min ved 95 ° C, efterfulgt af 40 cykler af 15 sekunder ved 95 ° C og 1 min ved 60 ° C. Relativ mængde af målgener blev beregnet ved at dividere tærsklen den gennemsnitlige cyklus (CT) for genet af interesse ved middelværdien CT-værdi for husholdning gen

GAPDH

. Relative udtryk-forskelle blev beregnet ved at sammenligne udtryk til baseline tid-point (t = 6, S1A Fig.). Tosidet t-test blev anvendt til at sammenligne forskelle i ekspression. P-værdier 0,05 blev anset for at indikere en signifikant forskel.

GDF-15 protein niveauer i testikelkræft patient plasma under og efter bleomycin- og cisplatin kemoterapi

Til klinisk validere resultaterne fra cellelinje model, brugte vi en kohorte af 41 patienter med testikelkræft, der deltog i et prospektivt studie på tidlige kemoterapi-relaterede kardiovaskulære ændringer under bleomycin- og cisplatin-baserede regimer. Patienter berettiget til undersøgelsen havde metastatisk testikelkræft, var 18-50 år og var modtager første linje cisplatin kemoterapi ved University Medical Center Groningen, Holland. Eksklusionskriterier var tidligere kemoterapi eller strålebehandling, tilstedeværelse af CVD, brug af erythropoietin og glomerulær filtrationshastighed 60 ml /min. Den lokale etiske komité har godkendt undersøgelsen, og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle deltagere. Afhængigt af deres internationale Kimcelle Cancer Collaborative Group (IGCCCG) prognose gruppe modtog patienterne enten tre eller fire BEP kurser varede 3 uger hver (bleomycin-30 USP, dage 2, 8 og 15; etoposid-100 mg /m

2 , dag 1-5) og cisplatin-20 mg /m

2, dag 1-5). I de første 6 dage patienter blev hydratiseret med 4 L NaCl 0,9% /dag og modtaget daglig antiemetisk behandling (dexamethason, ondansetron). Blodprøver blev udtaget på dag 1, 8 og 15 i den første kemoterapi kursus, dag 1 og 8 i den anden og tredje kursus, (c1d1 (= baseline), c1d8, c1d15, c2d1, etc.), en måned efter færdiggørelse og et år efter start på kemoterapi. EDTA-plasma blev serielt opsamlet og opbevaret i -20 ° C indtil analyse. Referencedata blev opnået fra raske mandlige søskende af voksne barndom kræft overlevende, der havde deltaget som kontrolpersoner i en tværsnitsundersøgelse på sen kardiovaskulære følgesygdomme af behandling for kræft hos børn [24]. Ud af disse sunde mandlige søskende blev en kontrolgruppe med en sammenlignelig median alder som testikel kræftpatienter valgt. Målinger i kontrollerne blev udført som beskrevet ovenfor

Plasma GDF-15-protein-niveauer blev bestemt ved sandwich-enzymbundet immunsorbentassay (ELISA) med et kommercielt tilgængeligt kit (R den Wilcoxons signed rank test blev anvendt til parrede ændringer. To-sidede P-værdier ≤ 0,05 blev anset for at indikere signifikans blev SPSS softwarepakke udgave 22 (SPSS Inc., Chicago, IL), der anvendes.

Resultater

cDNA microarray

Class sammenligning. Toppen 50 af de fleste differentielt udtrykte gener i “akut” og “kronisk” eksponering indstilling for bleomycin og cisplatin er opsummeret i tabel 1. Fig. 1 viser et Venn-diagram af de overlappende gener i top 50 s af fire indstillinger for forskellige eksponering. Fra denne analyse tre gener, f.eks

GDF-15

,

ATF3

AREG

, blev fundet i top 50 på tre ud af fire indstillinger for eksponering. På grund af denne overlapning i indstillingerne forskellige eksponering vi overvejet disse tre gener plausible kandidater, og valgt disse til validering af QRT-PCR.

cDNA microarray-GSEA. Veje beriget på en FDR ≤ 0,10 og

P

≤ 0,025 i GSEA er sammenfattet i tabel 2. I “akut” -exposure indstilling til bleomycin blev seks veje beriget (alle opreguleret), mens der ikke veje blev beriget i “kronisk” indstillingen med de indstillede kriterier for FDR. Cisplatin eksponering resulterede i 12 berigede veje i “akut” -exposure indstilling (opreguleret n = 3, nedreguleres n = 9), mens seks veje blev beriget i “kronisk” -exposure indstilling (alle nedreguleret). Den “p53” og “type I diabetes mellitus ‘gen sæt blev beriget i tre ud af fire indstillinger for eksponering; gener, der indgår i dette gen sæt er sammenfattet i S1 tabel.

QRT-PCR

For at validere ændringer i ekspression af

GDF-15

,

ATF3

AREG

QRT-PCR blev udført. I “akut” -exposure indstilling, mRNA-ekspressionen af ​​alle tre gener steg i tid efter udsættelse for bleomycin og cisplatin i overensstemmelse med de i microarray data. Efter 48 timers udsættelse for begge lægemidler, mRNA-ekspression af alle tre gener var signifikant højere sammenlignet med ubehandlede kontrolceller. Ingen ændring i mRNA-ekspression af disse tre gener opstod i ubehandlede kontrolceller i tid (fig. 2).

Plasma GDF-15-protein-niveauer i testikulære kræftpatienter behandlet med BEP-kemoterapi

Baseret på data fra litteraturen, vi udvalgte GDF-15 for yderligere validering på proteinniveau i plasma af testikelkræft patienten under og efter behandlingen, og relaterede GDF-15 niveauer til kendte plasma endotel skader biomarkører (vWF, hsCRP) [25 , 26]. Baseline karakteristika for de patienter er opsummeret i tabel 3. Selv om kort fra signifikans (p = 0,06), basislinie (dvs. før starten af ​​kemoterapi) GDF-15-protein-niveauer i testikulære kræftpatienter ikke var forskellige fra raske alders-matchede hanner (fig. 3A). Patienterne i IGCCCG god prognose gruppe havde lidt lavere baseline GDF-15 protein niveauer end patienter i de mellemliggende eller dårlig prognose grupper (god prognose: median 362,9 pg /ml (interval 197,6-1059,5 n = 33), mellemliggende /dårlig prognose: median 689,1 pg /ml (interval 186,8-1935,0; n = 8);

P

= 0,04). Median baseline GDF-15-niveau var ikke relateret til tumor (stadium 2 sygdom: median 373,0 pg /ml (interval 197,6-1935,0 n = 30), fase 3 4 sygdom: median 486,4 pg /ml (interval 186,8-1875,9; n = 11);

P

= 0,40). Pre-kemoterapi GDF-15 protein niveauer blev ikke relateret til alder (r

s = 0,08;

P

= 0,61).

A. Plasma GDF-15 protein niveauer i patienter med metastatisk testikelkræft (n = 41) før start på bleomycin- og cisplatin kemoterapi, sammenlignet med raske alders-matchede mænd (n = 10); B. Plasma GDF-15 protein niveauer før, under og efter afslutningen af ​​bleomcyin- og cisplatin kemoterapi for testikelkræft. Prøven på c1d1 trækkes før påbegyndelse af kemoterapi. (*) P 0,05 sammenlignet med baseline værdi eller angivet tid-point.

Under BEP-kemoterapi, GDF-15 protein niveauer steg i forhold til baseline, med betydeligt højere niveau 1 måned og 1 år efter kemoterapi ( fig. 3B, tabel 4). Sammenlignet med præ-kemoterapi, plasmaniveauer af vWF og hsCRP ændret sig væsentligt i løbet af behandlingen (tabel 4). Efter endt kemoterapi, vWF-niveauer forblev vedvarende forhøjede, mens hsCRP vendt tilbage til før-kemoterapi værdier. Ved baseline blev niveauer af GDF-15 relateret til niveauet af vWF (r

s = 0,35;

P

= 0,03) og hsCRP (r

s = 0,39;

P

= 0,014). Under kemoterapi, niveauer af GDF-15 korreleret med hsCRP på c1d8 (r

s = 0,44;

P

= 0,01) og med vWF på c3d8 (r

s = 0,40;

P

= 0,017). Ved opfølgende besøg en måned efter afslutningen af ​​kemoterapi, blev niveauer af GDF-15 og vWF stærkt korreleret (r

s = 0,56;

P

= 0,001), mens dette forhold blev ikke fundet for GDF-15 og hsCRP (r

s = 0,18;

P

= 0,28). Et år efter starten af ​​kemoterapi, ingen relation mellem GDF-15 niveauer og vWF eller hsCRP (r

s = 0,28;

P

= 0,12; r

s = 0,10;

P

= 0,57) blev fundet.

diskussion

I dette studie anvendte vi en fordomsfri translationel tilgang med cDNA microarray som et værktøj til at finde nye mekanismer relateret til og vælge kandidat biomarkører involverede i kemoterapi-induceret endotel skade. Med dette

in vitro

strategi, fandt vi flere enkelte gener med væsentlige ændringer i udtryk ved udsættelse for bleomycin og cisplatin. Tre gener med stærke udtryk forskelle i tre ud af fire eksperimentelle indstillinger,

GDF-15

,

ATF3

AREG

blev godkendt af QRT-PCR. Desuden GSEA afsløret klynger af gener involveret i adskillige veje, herunder “p53” og “type I diabetes mellitus” gensæt, som blev ramt i denne model. Desuden viste vi, at BEP-kemoterapi. (Bleomycin, Etoposide, Cisplatin) rent faktisk påvirker plasma GDF-15 protein niveauer i testiklerne kræftpatienter, og at disse niveauer i relation til kendte endotel skader biomarkører såsom vWF og hsCRP

i enkelt gen analyse adskillige gener blev væsentligt udtrykkes forskelligt i de forskellige eksperimentelle indstillinger i HMEC-1

in vitro

model. Generne

GDF-15

,

ATF3

AREG

var i top 50 er de fleste differentielt udtrykte gener i tre eller fire indstillinger eksponering.

cytokinet GDF-15 (også kendt som makrofag inhiberende Cytokine 1 (MIC-1) eller NSAID aktiveret gen (NAG-1)) er et medlem af transformerende vækstfaktor β (TGFP) familie. GDF15 induceres af alle former for stimuli, herunder cytokiner, kemo- og /eller stråleterapi og skader i alle mulige forskellige celler og væv [27-30]. Frigivelse af GDF-15 kan inducere anti-inflammatoriske, anti-apoptotiske og anti-proliferative virkninger, hvorved det vasculoprotective mekanismer. Derfor kan stigninger i GDF-15 plasmaniveauer hos vores patient kohorte vel resultere fra øget produktion af endotelceller og /eller makrofager, for at kompensere for kemoterapi-induceret skade. I en evaluering genekspression ændringer i prøverne prostatacancer før og efter docetaxel /mitoxantron behandling,

GDF-15

var en af ​​højeste up-regulerede gener efter behandling [31], der viser, at cytostatika kan påvirke

GDF-15

ekspression i både maligne og ikke-maligne celler.

Forhøjede niveauer af GDF-15 er blevet forbundet med øget risiko for sygdomme antaget at skyldes kronisk inflammation [29, 32] og talrige undersøgelser har vist, at GDF-15 er et værdifuldt biomarkør for hjertekarsygdomme [29, 30, 32-34]. GDF-15 menes at spille en relevant rolle i kardiovaskulær skade responser [35], eventuelt gennem en pro-angiogen respons som blev påvist i en præklinisk model med HUVEC [36]. GDF-15 er også beskrevet som biomarkør /forudsigelse af albuminuri, kendt for at afspejle etableret mikro-vaskulær skade [37]. Desuden flere undersøgelser implicerer GDF-15 aspekter af metaboliske forstyrrelser, f.eks insulinresistens og fedme [30, 38, 39]. For nylig, højere niveauer af cirkulerende MIC-1 /GDF-15 blev også forbundet med en øget risiko for kolorektal cancer understøtter en rolle for kronisk inflammation i udviklingen af ​​colorectal cancer [40].

ATF3

er en downstream medlem af MAP-kinase signalvej, der koder for en nuklear faktor, der stimulerer transskription på cellulært stress. Hurtig opregulering af

ATF3

er et centralt stressrespons i forskellige endotheliale celle modeller, induceret af forskellige skadelige stimuli [41-46]. Interferens med

ATF3

-levels beskyttede celler fra apoptose induktion, f.eks induceret af TNF i HUVEC [47], af cisplatin i en human glioblastom cellelinie [42], eller relateret til doxorubicin i cardiomyocytter [48]. Interessant, immunhistokemisk målt

ATF3

-expression øges i aterosklerotiske områder af menneskelige iliaca arterier [43]. Få studier rettet

AREG

, et medlem af epidermal vækstfaktor receptorer, der spiller en vigtig rolle i cellulær proliferation og overlevelse. Brystkræft celler udsat for cisplatin udskilles den AREG-protein i længere tid ad gangen, dvs. op til 72 timer efter redegørelsen [49].

På grundlag af de tilgængelige data besluttede vi at studere plasma protein niveauer af GDF-15 i testikulære kræftpatienter før, under og efter behandling med BEP-kemoterapi, og relatere ændringer niveauer af kendte endotelødelæggelse biomarkører [25, 26]. Stigningerne i GDF-15 i hele behandling samt post-kemoterapi kan dels vedrøre kræftrelaterede mekanismer, som GDF-15 protein niveau wasslightly højere hos patienter med mere fremskreden sygdom fase målt ved IGCCCG score, som kan vedrøre frigive af GDF-15 fra apoptotiske tumorceller. Imidlertid er dens rolle i endotelskade understøttes af, at GDF-15 niveauer korrelerede med proteiner, der vides at afspejle kemoterapi-relaterede endotelødelæggelse i testikelkræft patienter, vWF og hsCRP [25, 26]. Det er derfor tænkeligt, at den observerede stigning i plasma GDF15 er involveret i kemoterapi-relaterede endotel skade, men det er formentlig ikke skyldes endotel skade alene. Da dette protein mekanistisk er relateret til kemoterapi-relaterede endotelødelæggelse det kan være et potentielt følsomt biomarkør til detektering disse skader. Yderligere udvidet analyse af GDF15 niveauer i kombination med fænotypebestemmelse af kardiovaskulære risikofaktorer i en større kohorte af patienter er berettiget. Selv om der i denne undersøgelse nogen forbindelse blev fundet mellem forbehandlingsniveauer af GDF15 og alder, er det kendt, at dette er tilfældet i den normale population og bør tages i betragtning, når man analyserer GDF15 niveauer i tide. Endvidere kan det forhold, at TGF-pathway er involveret i denne skade være et fingerpeg om indgreb, der reducerer mængden af ​​endotel skader relateret til behandling med bleomycin og cisplatin.

GSEA viste signifikant beriget af flere veje, herunder “p53” og “Type i diabetes mellitus” i “akut” udsættelse for bleomycin og cisplatin, og “kronisk” udsættelse for cisplatin. Konstateringen af, at p53-relaterede gener påvirket af bleomycin samt cisplatin illustrerer gyldigheden af ​​vores tilgang, da begge lægemidler udøver deres nøgle terapeutisk effekt ved cellulær apoptose induktion. Den berigede ‘Type I diabetes mellitus’ gensæt omfatter flere gener involveret i inflammatoriske processer, f.eks Human leukocyt antigen-molekyler, interleukiner og TNF, hvilket indikerer, bleomycin og cisplatin inducerer et inflammatorisk respons i endotelceller. Dette fund er helt i tråd med studier i testikelkræft kræftpatienter behandlet med cisplatin-baserede regimer, som viste højere systemisk inflammation og endotel dysfunktion [25, 26, 50]. Som cirkulerende platin fortsat kan spores i cirkulationen år årtier efter cisplatin behandling [51-52], kan langsigtede testikelkræft kræft overlevende godt have løbende vaskulær skade og kronisk lav kvalitet endotel inflammation. Når kroniske inflammatoriske responser viser sig at være en vigtig patogen faktor for udviklingen af ​​kemoterapi-induceret endotel beskadigelse, indgriben med anti-inflammatoriske lægemidler er et rationale tilgang til at afhjælpe disse virkninger.

Afslutningsvis vi udnyttet cDNA microarray til opdage en neutral gener og pathways forbundet med kemoterapi-relaterede endotel skader, for at finde biomarkører for og mekanismer, der er involveret i denne skade. I HMEC-1 udsat for bleomycin og cisplatin blev flere gener stærkt differentielt udtrykt, f.eks

GDF-15

,

ATF3

AREG

. I GSEA blev klynger af gener involveret i celledød og inflammation påvirket. De observerede ændringer i plasma GDF-15-protein-niveauer i testikulære kræftpatienter induceret af cisplatin og bleomycin kemoterapi, som indeholder indikerer, at denne informative præklinisk tilgang kan oversættes til et klinisk miljø, og at GDF-15 kan være en potentiel biomarkør for interesse, der er mekanistisk involveret i kemoterapi-relaterede sundt væv skader såsom endotel skade. Yderligere

in vitro

in vivo

efterforskning er berettiget. Dette letter rationale mod udvælgelsen af ​​mål for intervention, med tidlige surrogat biomarkører for kemoterapi-relaterede endotel skader.

Støtte Information

S1 Fig. Eksperimentel design.

A. “Akut” ekponeringsindstilling: immortaliserede HMEC-1 blev udsat for bleomycin (0,3 ug /ml (IC50), 1,5 ug /ml (IC90)) eller cisplatin (2,6 uM (IC50), 12,9 uM (IC90)) for 6, 24 og 48 timer; B. “kronisk” eksponeringsindstilling: i løbet af 30 dage HMEC-1 blev udsat for 0,06 ug /ml bleomycin (IC10) eller 0,52 uM cisplatin (IC10) to gange ugentligt). I begge forsøg tjente ubehandlede prøver som kontroller. (*) RNA-isolation og cDNA microarray eksperimenter; (†) RNA isolering og QRT-PCR

doi:. 10,1371 /journal.pone.0115372.s001

(TIF)

S1 tabel. Gener der indgår i “p53” og “Type I diabetes mellitus ‘gen sæt i Kegg databasen rangeret i alfabetisk rækkefølge

doi:. 10,1371 /journal.pone.0115372.s002

(DOC)

tak

Vi takker Kevin Bouma, Gert jan Meersma, Haukeline Volders og Nynke Zwart for deres teknisk bistand og til indsamling af patientprøver.