PLoS ONE: Digitoflavone Forhindrer kBa kinase og Forbedrer apoptose induceret af TNF gennem nedregulering af ekspression af Nuclear Factor xB-Regulerede Gene Produkter i human kræft i bugspytkirtlen Cells

Abstrakt

Tumor nekrose faktor-α (TNF) aktiverer både celledød og celleoverlevelsesforløb. Aktiveringen af ​​overlevelse pathway gør de fleste cancerceller resistente over for TNF-induceret cytotoksicitet. Vi fandt, at forbehandling med digitoflavone, en plante flavonoid, i høj grad sensibiliserede TNFa-induceret apoptotisk celledød i flere humane pankreatiske cancerceller. I søgning af den molekylære basis for sensibilisering virkning digitoflavone blev digitoflavone sig at inhibere TNFa-induceret aktivering af nuklear transkriptionsfaktor-kappa B (NF-KB), som er den vigtigste overlevelsesfaktor i TNFa signalering. NF-KB suppression forekom gennem hæmning af kBa kinaseaktivering, kBa phosphorylering, kBa nedbrydning, og NF-KB nuklear translokation. Denne inhibering korreleret med undertrykkelse af NF-KB-afhængige gener involveret i antiapoptosis (MCL-1, bcl-2, bcl-xl, c-IAP1, c-iap2, flip, og survivin), proliferation (c-myc, cyclin D1 ), og angiogenese (VEGF, cox-2, og MMP-9). Desuden kan digitoflavone aktivere JNK gennem hæmning af NF-KB-signalering, tilvejebringe en kontinuerlig blokade af feedback hæmmende mekanisme, JNK-induceret NF-KB-aktivering. Denne undersøgelse fandt en hidtil ukendt funktion af digitoflavone og øget værdi digitoflavone som et anticancermiddel

Henvisning:. Cai X, Lu W, Yang Y, Yang J, Ye J, Gu Z, et al. (2013) Digitoflavone Forhindrer kBa kinase og Forbedrer apoptose induceret af TNF gennem nedregulering af ekspression af Nuclear Factor xB-Regulerede Gene produkter i Human bugspytkirtelkræftceller. PLoS ONE 8 (10): e77126. doi: 10,1371 /journal.pone.0077126

Redaktør: Wenhui Hu, Temple University School of Medicine, USA

Modtaget: August 8, 2012; Accepteret: September 8, 2013; Udgivet: 11 oktober, 2013 |

Copyright: © 2013 Cai et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr. 30.701.098, 30.873.410 og 81.073.101), Natural Science Foundation i Zhejiang-provinsen (nr Y2090676) og Jiangsu-provinsen fremragende leder Program for traditionel kinesisk medicin. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen er den fjerde hyppigste dødsårsag hos kræftpatienter i USA og er et globalt kræftbehandling problem [1]. Traditionelle modaliteter for inoperabel kræft i bugspytkirtlen behandling omfatter strålebehandling alene, kemoterapi alene eller kombineret chemoradiation. Men etårige og femårige overlevelsesrater kun 15% og 5%, henholdsvis [2], [3]. Det stof øjeblikket anvendes i behandlingen af ​​patienter, der har kræft i bugspytkirtlen er gemcitabin, som har en objektiv responsrate på kun 5% [4]. Kemoresistens af tumorceller er tilsyneladende den største årsag til svigt af konventionel kemoterapi i behandlingen af ​​pancreascancer. Nuclear faktor-KB (NF-KB) er en af ​​de medvirkende faktorer involveret i resistens mod kemoterapi [5], [6]. Mere end 90% af bugspytkirtelkræftceller harbour muterede K-ras [7], og NF-KB er en nedstrøms effektor af dette oncogen Ras [8], [9], [10]. NF-KB er konstitutivt aktiveret i primær pancreasadenocarcinom og bugspytkirtelkræft cellelinjer [8], og nedreguleret NF-KB danner det biologiske rationale for effektiv behandling af patienter med pancreas carcinom ved hjælp af en ugiftig phytochemical [11]. Endvidere er betændelse foreslået at være en kritisk komponent i pancreascancer [12], og NF-KB-aktivering er afgørende i den inflammatoriske proces [13]. Således er udviklingen af ​​forbindelser, som målretter NF-KB foreslået som en fremgangsmåde til behandling af patienter med kræft i bugspytkirtlen [6], [14], [15].

Nuclear transkriptionsfaktor-kappa B (NF -κB) er kritisk vigtigt for tumorcelleoverlevelse, vækst, angiogenese og metastase. Under normale forhold, NF-KB, som består af p50, p65, og kBa, er lokaliseret i cytoplasmaet. Men når det er aktiveret, denne transkriptionsfaktor translokerer til kernen. Som reaktion på et aktiveringssignal, den inhiberende kBa underenheden undergår phosphorylering, ubiquitinering og nedbrydning, og derved udsatte kernelokaliseringssignaler på p50-p65-heterodimer. Den p65 er derefter phosphoryleret, hvilket fører til dets nukleare translokation og binding til en specifik sekvens i DNA, hvilket igen resulterer i gentranskription [16], [17]. NF-KB er blevet vist at regulere ekspressionen af ​​flere gener, hvis produkter er involveret i tumorigenese [17], [18], [19], [20], [21]. Disse indbefatter antiapoptotiske gener (f.eks CIAP, survivin, TRAF, cflip, BFL-1, bcl-2, og bcl-XL), inflammatoriske gener (COX-2, MMP-9, og VEGF), og gener, der koder adhæsionsmolekyler , kemokiner, og cellecyklusregulerende gener (f.eks cyclin D1 og c-myc). Således agenter, der undertrykker NF-KB-aktivering har terapeutisk potentiale for bugspytkirtlen carcinom [22], [23], [24], [25], [26], [27], [28].

Digitoflavone (Dig) er en almindelig flavonoid, der findes i mange typer af planter, såsom frugter, grøntsager og lægeurter. Planter rige på digitoflavone er blevet anvendt i traditionel kinesisk medicin til behandling af forskellige sygdomme, såsom hypertension, inflammatoriske lidelser og cancer. Digitoflavone s anticancer ejendom er associeret med induktion af apoptose og hæmning af celleproliferation, metastase, og angiogenese [29]. Digitoflavone betydeligt sensibiliseret TNF-induceret apoptose i en række humane pancreas cancer cellelinjer, en effekt, der blev opdaget for første gang ved denne undersøgelse. Sådan sensibilisering er tæt forbundet med digitoflavone s inhibitorisk virkning på NF-KB-aktivering, som nedreguleret nogle vigtige antiapoptotiske gener, såsom c-IAP1 og VEGF. Digitoflavone kunne aktivere JNK, en kritisk proces i sensibilisering af digitoflavone på TNF-induceret apoptose. Data fra denne undersøgelse avancerede vores forståelse af den molekylære mekanisme er involveret i anticancer aktivitet digitoflavone.

Materialer og metoder

2.1 Materialer

Digitoflavone blev købt fra Nanjing TCM Institute of Chinese Materia Medica, Kina. Det blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) som en 20 mmol /l stamopløsning og opbevaret ved -20 ° C.

Escherichia coli

-afledt human tumornekrosefaktor-α (TNF-α), som er egnet til celledyrkning, blev opnået fra Sigma blev Inc. Trypsin og MTT opnået fra Sigma, USA. Lysepuffer blev indkøbt fra Beyotime, Kina. Antistoffer (caspase-3, caspase-8, ged anti-mus IgG-HRP og gede anti-kanin IgG-HRP) blev opnået fra Santa Cruz, USA. Antistoffer Cycle D1, COX-2, MMP-9, VEGF, Mcl-1, Bcl-2, Bcl-X

L, c-IAP1, c-IAP2, FLIP, Survivin, PARP, IKKα /β, p- IKKα, p-IKKβ, kBa, p- kBa, JNK, og p-JNK blev indkøbt fra Cell Signaling Technology, USA. Monoklonale muse-anti-glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) blev opnået fra Kangchen, Kina. Den p65 ekspressionsvektoren pCMV-p65, var en slags gave fra Dr. Fang Wang, Harvard Medical School, Boston.

2.2 Cell Culture

Humane bugspytkirtlen cellelinjer PANC-1, Colo-357 , og BxPC-3 blev købt fra Cell Bank of Shanghai Institute for Biokemi og Cellebiologi. Celler blev dyrket i DMEM medium (PANC-1, Colo-357-celler) eller RPMI-1640 (for BxPC-3-celler) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (alle tilgængelige fra Invitrogen, Grand Island, NY, USA). Alle kulturer blev opretholdt i et fugtigt miljø med 5% CO

2 ved 37 ° C.

2.3 Annexin-V /PI Dobbelt Farvning Assay

bugspytkirtelkræft celler blev behandlet med digitoflavone ( 40 uM), TNFa (20 ng /ml) alene eller sammen ved 37 ° C i 24 timer. Cellerne blev derefter høstet, vasket og resuspenderet med PBS. Apoptotiske celler blev bestemt ved anvendelse af et FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences, USA) ifølge producentens protokol. Cellerne blev vasket kortvarigt og efterfølgende inkuberet i 15 minutter i 100 pi 1 × bindingsbuffer, der indeholder 5 pi Annexin V-FITC og 5 pi PI, i mørke ved stuetemperatur. Bagefter apoptose blev analyseret ved FACScan laser flowcytometer (FACSCalibur, Becton Dickinson, USA). Data blev analyseret ved hjælp af softwaren CELLQuest.

2.4 NF-KB Luciferase Reporter Assay

Panc-1-celler blev transient transficeret med NF-KB afhængig ildflueluciferase reporterkonstruktion og konstitutivt udtrykker Renilla luciferase konstruere (40:1) ved anvendelse af lipofectamin 2000 ifølge fabrikantens protokol (Invitrogen, USA). Ildflue-luciferase-aktivitet blev bestemt og normaliseret til kontrol Renilla niveau, ved anvendelse af Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega USA).

2.5 NF-KB-aktivering

DNA bindende aktivitet af NF- KB blev bestemt ved elektroforetisk mobilitet (EMSA) efterfulgt instrukser LightShift Chemiluminescent EMSA Kit (Pierce, USA). Nukleare ekstrakter blev fremstillet under anvendelse af NE-PER Nuclear og cytoplasmiske Extraction Kit (Pierce, USA), ifølge producentens anvisninger. Nukleare ekstrakter blev inkuberet med biotin endemærket, dobbeltstrenget NF-KB oligonucleotid (5′-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGG-3 ‘) eller Oct-1 oligonucleotid (5′-TGTCGAATGCAAATCACTAGA A-3’) (Beyotime, Kina) i 20 minutter ved stuetemperatur. DNA-protein-kompleks dannet blev separeret på 5% nativ polyacrylamidgel. DNA’et blev derefter hurtigt overført til en positiv nylonmembran, UV tværbundet, probet med streptavidin-HRP-konjugat, inkuberet med substrat og eksponeret for røntgenfilm.

2.6 kBa Nedbrydning og phosphorylering

for at bestemme virkningen af ​​digitoflavone på TNFa-afhængig kBa nedbrydning og phosphorylering, blev cytoplasmiske ekstrakter fremstillet som tidligere beskrevet [30] fra bugspytkirtelkræftceller forbehandlet med digitoflavone i 7 timer og derefter udsat for 20 ng /ml TNFa i 5, 10, og 20 min. Ekstrakterne blev derpå opløst på 13% SDS-polyacrylamidgeler. Efter elektroforese blev proteinerne elektrooverført til PVDF-membraner (Millipore, USA), probet med antistoffer mod kBa og phosphoryleret kBa, og påvises ved hjælp af kemiluminescens (Luminata Crescendo Western HRP substrat, Millipore, USA).

2.7 Binding styrken af ​​Digitoflavone til ATP binding site of IKK

for at bestemme bindingen styrken af ​​digitoflavone til ATP bindende site af IKK, vi udførte kinase bindende assay ved KINOMEscan (LeadHunter Discovery Services). Kort fortalt blev kinase-mærket T7 fag stammer udarbejdet i en

E. coli

vært afledt af BL21-stammen.

E. coli

blev dyrket til log-fase og inficeret med T7-fag og inkuberet under omrystning ved 32 ° C, indtil lysis. Lysaterne blev centrifugeret og filtreret for at fjerne cellerester. De resterende kinaser blev produceret i HEK-293-celler og efterfølgende mærket med DNA for qPCR påvisning. Streptavidinovertrukne magnetiske perler blev behandlet med biotinylerede småmolekyle ligander i 30 min ved stuetemperatur for at generere affinitetsresiner for kinaseassays. De ligand-perler blev blokeret med overskydende biotin og vasket med blokerende buffer (SeaBlock (Pierce), 1% BSA, 0,05% Tween 20, 1 mM DTT) for at fjerne ubundet ligand og reducere ikke-specifik binding. Bindingsreaktioner blev samlet ved at kombinere kinaser, ligand affinitetsperler, og testforbindelser i 1 × bindingspuffer (20% SeaBlock, 0,17 × PBS, 0,05% Tween 20, 6 mM DTT). Alle reaktioner blev udført i polystyren plader med 96 brønde i et slutvolumen på 0,135 ml. Assaypladerne blev inkuberet ved stuetemperatur med omrystning i 1 time og affinitetsperlerne blev vasket med vaskebuffer (1 x PBS, 0,05% Tween 20). Perlerne blev derefter resuspenderet i elueringsbuffer (1 × PBS, 0,05% Tween 20, 0,5 uM ikke-biotinyleret affinitetsligand) og inkuberet ved stuetemperatur med omrystning i 30 minutter. Koncentrationen af ​​kinase i eluaterne blev målt ved qPCR.

2.8 JNK Activation Assay

For at bestemme virkningen af ​​digitoflavone på TNFa-induceret JNK-aktivering, blev Western blot bruges til at udføre JNK assay. Kort fortalt blev cytoplasmatiske ekstrakter fremstillet fra bugspytkirtelkræftceller behandlet med 40 pM digitoflavone i 7 timer og derefter behandlet med 20 ng /ml TNFa i 5, 10, og 20 min. Ekstrakterne blev derpå opløst på 13% SDS-polyacrylamidgeler og analyseret ved Western-blot ved anvendelse af et antistof mod JNK og p-JNK.

2.9 Transfektion af p65

Transfektion blev udført i 6- brønds plader under anvendelse af Lipofectamin 2000 reagens (Invitrogen, Paisley, UK) ifølge producentens instruktioner. Kort beskrevet blev celler dyrket i plader med 6 brønde og transficeret med den egnede vektor (2 ug) den følgende dag. Efter 4 timer Transfektionsblandingen blev fjernet og erstattet med komplet medium. Cell behandlinger blev derefter udført 24 timer efter transfektion som angivet.

2.10 NF-KB Målrettet genanalyse

For at bestemme virkningen af ​​digitoflavone på TNFa-induceret NF-KB målrettet genekspression , Western blot blev anvendt til at udføre protein-ekspression assay. Kort fortalt blev cytoplasmatiske ekstrakter fremstillet fra bugspytkirtelkræftceller ubehandlede eller forbehandlede med 40 pM digitoflavone i 7 timer og derefter behandlet med 20 ng /ml TNFa i 2, 4, 8, 12, og 24 h.

2.11 Real-Time Quantitative PCR (qPCR)

Samlet RNA blev ekstraheret under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge producentens instruktioner. 2 ug totalt RNA blev anvendt til cDNA-syntese med tilfældige hexamere primere. qPCR blev udført under anvendelse af en ABI PRISM 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Reaktioner blev udført pr SYBR Green instruktioner (Thermo videnskabelige, USA) i tre eksemplarer på tre uafhængige forsøg. Primersekvenserne er tilvejebragt i tabel 1. ΔΔC

T metoden blev anvendt til qPCR bestemmelse. GAPDH blev anvendt som housekeeping-gen til at normalisere variabilitet i ekspressionsniveauer.

2.12 VEGF Påvisning ved ELISA

koncentration VEGF i det konditionerede medium fra humane pancreas carcinomaceller blev målt ved anvendelse af en kommercielt tilgængeligt ELISA-kit (R 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

3.1. digitoflavone potenseret apoptotiske effekter af TNF

virkningerne af digitoflavone på de apoptotiske virkninger af TNF blev undersøgt. TNF sig selv ikke medføre en betydelig mængde af apoptose; men når kombineret med digitoflavone, de cytotoksiske virkninger af TNFa blev forøget (fig. 1). Digitoflavone kombineret med TNF steget med omkring 180-240% apoptose end TNF alene.

Cell apoptose blev bestemt ved Annexin V FITC Apoptose Kit. *

P

0,05 sammenligne med ubehandlet kontrol; og #

P

. 0,05 sammenligne med gruppen med TNF kun

3.2 Digitoflavone Fortrængte NF-KB-afhængige Reporter Gene Expression induceret af TNF

Vi undersøgte den inhibitoriske virkning af digitoflavone på NF-KB transkriptionel aktivitet i Panc-1-celler ved hjælp af NF-KB luciferase reporter assay. Som vist i figur 2, behandling med TNFa væsentligt forbedret NF-KB transkriptionel aktivitet og digitoflavone forbehandling markant undertrykte transaktivering af NF-KB induceret af TNFa. Den reducerede luciferaseaktivitet ved digitoflavone kan skyldes dens direkte hæmning af luciferase enzymaktivitet. For at udelukke en sådan mulighed, blev digitoflavone efterbehandling udført. Celler blev først behandlet med TNFa (20 ng /mL) i 2 timer efterfulgt af digitoflavone (40 uM) behandling i yderligere 2 timer. Det er temmelig interessant at finde, at digitoflavone efterbehandlingen undladt at inhibere transaktivering af NF-KB induceret af TNFa, hvilket antyder, at digitoflavone ikke undertrykke NF-KB-aktivering efter transkriptionelt og ikke udgør nogen direkte inhibering til luciferase enzymaktivitet.

PANC-1-celler blev cotransficeret med NF-KB afhængig ildflueluciferase reporterkonstruktion og konstitutivt udtrykker Renilla luciferase-konstruktion. Cellerne blev derefter behandlet med digitoflavone (40 uM) i forskellige tidsrum (1H, 3H, 5H, 7H). En anden gruppe celler (forbehandlingen gruppe) blev behandlet med digitoflavone (40 uM) i forskellige tidsrum (1 time, 3 timer, 5 timer, 7 timer), efterfulgt af TNFa (20 ng /mL) i 2 timer. Efterbehandlingen gruppe blev behandlet med TNFa (20 ng /mL) i 2 timer, efterfulgt af digitoflavone (40 uM) i forskellige tidsrum (1 time, 3 timer, 5 timer, 7 timer). Luciferaseaktivitet blev udtrykt som fold forøget over kontrol efter normaliseret med Renilla luciferaseaktivitet. Data er præsenteret som middelværdi ± standardafvigelse. fra mindst tre uafhængige forsøg. *

P

0,05 sammenligne med TNF-ubehandlet kontrol (0 h);

#

P

0,05 sammenligne gruppen med TNFa kun vejledende, og

△

P

0,05 sammenligne med gruppen TNF-ubehandlede Dig-behandlede kontrol (7 h).

3.3 Digitoflavone Hæmmet Inducerbar NF-KB-aktivering af TNF

TNF er en aktivator af NF-KB, og mekanismen for NF-KB-induktion sigende varierer blandt forskellige celle typer. [31], vi undersøgte således, om digitoflavone var effektivt til at blokere NF-KB-aktivering i tre humane bugspytkirtelkræft cellelinjer. Ifølge resultaterne, digitoflavone helt hæmmede TNF-induceret NF-KB-aktivering i alle tre cellelinjer (Fig. 3), hvilket indikerer, at digitoflavone var effektivt til at hæmme TNF-inducerbar NF-KB i bugspytkirtelkræft cellelinjer af varierende differentiering.

bugspytkirtelkræftceller blev præinkuberet med digitoflavone (40 uM) i 7 timer og derefter behandlet med 20 ng /ml TNFa i 30 min ved 37 ° C. Nukleare ekstrakter blev fremstillet og derefter testet for NF-KB-aktivering af EMSA. Bund, EMSA ved hjælp af en Oct-1 sonde til en lastning kontrol.

3.4 Digitoflavone Hæmmet TNF-afhængige kBa Phosphorylering og Nedbrydning

kBa fosforylering er nødvendig for NF-KB-aktivering. Derfor vi havde til formål at afgøre, om digitoflavone påvirkede TNF-induceret kBa fosforylering som er en anden betingelse for NF-KB-translokation. Ifølge Western blot-analyse, som anvendes et antistof, som kun detekterer serin-phosphoryleret form af kBa, digitoflavone fuldstændig undertrykt TNFa-induceret kBa phosphorylering (fig. 4A). KBa nedbrydning kræves typisk for translokationen af ​​NF-KB til kernen. Derfor var det et mål at bestemme, om inhibering af TNFa-induceret NF-KB-aktivering ved digitoflavone skyldtes inhibering af kBa nedbrydning. Vi fandt, at TNFa induceret kBa nedbrydning i kontrolceller og digitoflavone forsinket TNFa-induceret kBa nedbrydning på PANC-1 og Colo-357-celler (fig. 4A). På den anden side, digitoflavone forbehandling inhiberede delvist ekspressionen af ​​kBa (tidspunkt 0).

A, digitoflavone inhiberede TNFa-induceret phosphorylering af IKKα /β og kBa. Bugspytkirtelkræftceller blev inkuberet med 40 pM digitoflavone i 7 h før udsættelse for TNFa i forskellige tidsrum, og derefter testet for phosphoryleret IKKα /β og kBa i cytosoliske fraktioner ved Western blotting-analyse. B, digitoflavone havde en god bindingspotens til ATP bindende site af IKK, med Kds på 7,3 uM og 5,2 uM for IKKα og IKKβ hhv.

3.5 Digitoflavone Hæmmet TNF-induceret IKK Aktivering

IKK-aktivering er kritisk for TNFa-induceret NF-KB-aktivering. Digitoflavone fuldstændig undertrykt TNFa-induceret aktivering af IKK. Hverken TNF eller digitoflavone udøvede nogen direkte effekt på ekspressionen af ​​IKK proteiner (fig. 4A). Resultater fra KINOMEscan assay viste, at digitoflavone havde en god bindingspotens til ATP-bindingsstedet af IKK, med Kds på 7,3 uM og 5,2 uM for IKKα og IKKβ (fig. 4B). Disse resultater viste, at digitoflavone meget sandsynligt nedreguleret ekspression af NF-KB-regulerede genprodukter gennem hæmning af IKK.

3.6 Digitoflavone Kunne Aktiv JNK og denne Effect blev blokeret af overekspression af p65

Vi undersøgte virkningen af ​​digitoflavone forbehandling på TNFa-induceret JNK-aktivering. TNF alene forårsagede hurtig og forbigående aktivering JNK i bugspytkirtelkræftceller, som påvist ved øget JNK fosforylering. Digitoflavone kunne aktivere JNK, samt TNFa, og aktiveringen virkning blev ikke svækket, når de bruges sammen (fig. 5). At bestemme virkningerne af overekspression af p65 på JNK-aktivering, vi forbigående transficeret Panc-1-celler med p65 eller tom vektor og vurderes helcellelysater fra digitoflavone-behandlede celler ved western blotting-analyse under anvendelse af et antistof, som specifikt genkender den phosphorylerede form af JNK . Som vist i figur 6, digitoflavone behandling resulterede i vedvarende phosphorylering af både P46 og P54 isoformer af JNK. Overekspression af p65 blokeret digitoflavone induceret JNK-aktivering.

pancreascancer celler blev inkuberet med 40 pM digitoflavone i 7 timer ved 37 ° C, og derefter testet for phosphoryleret JNK i cytosoliske fraktioner ved Western blotting-analyse.

Panc-1-celler blev transficeret med pCMV-p65 eller tom vektor og behandlet med digitoflavone (40 uM) i 3 timer eller 7 timer. JNK-aktivitet blev bestemt ved western blotting i helcellelysater.

3.7 Digitoflavone Hæmmet NF-KB-regulerede genprodukter Ekspression

COX-2, MMP-9, og vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) vides at være reguleret af NF-KB. Cyclin D1 og c-Myc regulere cellulær proliferation og reguleres af NF-KB. NF-KB opregulerer ekspressionen af ​​et antal gener impliceret i lette tumorcelleoverlevelse, såsom Mcl-1, Bcl-2, Bcl-X

L, c-IAP1, c-IAP2, FLIP og survivin. Således blev virkningen af ​​digitoflavone på ekspressionen af ​​disse NF-KB-regulerede gener og genprodukter også undersøgt. TNFa behandling inducerede ekspressionen af ​​MMP-9, cyklin D1, Mcl-1, Bcl-2, c-IAP1, c-IAP2, Flip og overlevende genprodukter, og digitoflavone afskaffede TNFa-induceret ekspression af disse genprodukter (fig. 7A -C). Vores resultater også angivet, at digitoflavone afskaffet TNFa-induceret mRNA-niveauet af COX-2, MMP-9, VEGF, cyklin D1, c-Myc, Mcl-1, Bcl-2 og Bcl-X

L (fig. 7D) .

bugspytkirtelkræftceller blev efterladt ubehandlet eller inkuberes med 40 pM digitoflavone for 7 timer og derefter udsat for TNF for forskellige tidspunkter. Hele celleekstrakter blev fremstillet og analyseret ved Western blotting (fig. 7A-C) eller qPCR (fig. 7D).

3.8 Digitoflavone Fortrængte VEGF-sekretion fra bugspytkirtlen carcinomceller

VEGF som aktivt secerneres fra hypoxiske tumorceller kunne udløse tumorangiogenese. Reduktion VEGF svækker dens evne til at stimulere tumorangiogenese. Derfor undersøgt vi virkningen af ​​digitoflavone på VEGF-sekretion fra pancreatiske carcinomceller ved anvendelse af ELISA-analyse. Resultaterne indikerede, at digitoflavone behandling i 24 timer faldt VEGF-sekretion sammenlignet med køretøjet kontrolgruppen (

P

0,05). Stimulering med TNF forøget VEGF-sekretion sammenlignet med køretøjet kontrolgruppen (

P

0,05). Imidlertid forbehandling med digitoflavone blokeret den stimulerende effekt af TNFa (fig. 8).

Repræsentative data blev vist fra tre uafhængige forsøg med identiske resultater. VEGF blev udtrykt i picogram af VEGF-protein per milliliter medium og per 10

5-celler. *

P

0,05 sammenligne med ubehandlet kontrol; og #

P

. 0,05 sammenligne med gruppen med TNF kun

Diskussion

Bugspytkirtelkræft adenocarcinom er en aggressiv og meget dødbringende malignitet. I øjeblikket er gemcitabin almindeligt anvendt i patienter med kræft i bugspytkirtlen. Men den forventede levetid for patienter med pancreascancer stadig ringe. Tsutom har rapporteret, at intratumoral injektion af rekombinant human TNFa inoperable tilfælde af bugspytkirtelkræft medført regression af tumoren eller et fald i tumormarkører [32]. Men et komplet svar ikke var nået, i nogen af ​​disse tilfælde, og det samlede resultat ikke var tilstrækkelig, muligvis fordi cytobeskyttende faktorer såsom enTNF og MnSOD er ​​rigelige i bugspytkirtelkræftceller [33], eller fordi TNF-receptorer næppe blev udtrykt. Denne resistens over for TNFa kan overvindes ved kombination med en lav cytotoksisk forbindelse, som kan sensibilisere virkningen af ​​TNFa.

Digitoflavone er en almindelig plante flavonoid, som besidder anticancer egenskaber, der blev påvist i tidligere undersøgelser [29]. Digitoflavone kan findes i en stor mængde af planter og fødevarer, herunder roer, kål, blomkål, selleri, grøn peber, Perilla blad, olivenolie og te [34]. I cellulære studier har digitoflavone vist sig at have anti-oxidant, anti-inflammatorisk /antiallergisk, anti-tumorigene, og radikale foranstaltninger [35], [36], [37]. Digitoflavone blev rapporteret at inhibere udviklingen af ​​en række faste tumorer [38], [39], [40], [41], [42], [43], [44], [45], [46], [ ,,,0],47]. I denne undersøgelse, vi dokumenteret, at digitoflavone sensibiliserer TNF-induceret apoptose i humane bugspytkirtelkræftceller. Sådan sensibilisering opnås via sin inhibitoriske virkning på NF-KB-aktivering, hvilket igen resulterer i reduceret ekspression af anti-apoptotiske NF-KB målgener. Data fra denne undersøgelse afslørede en hidtil ukendt funktion af digitoflavone og øge værdien af ​​digitoflavone som et nyttigt middel mod cancer.

NF-KB-aktivering fører til ekspression af gener, der er involveret i proliferation og metastase af cancer. I denne rapport, viste vi, at digitoflavone hæmmer ekspressionen af ​​cyklin D1, som reguleres af NF-KB. Derudover vores resultater viser, at digitoflavone nedregulerer ekspressionen af ​​COX-2, MMP-9, og VEGF, som alle er reguleret af NF-KB. Disse resultater yderligere underforstået at digitoflavone udøvet sine anticancer egenskaber gennem NF-KB-hæmning. NF-KB reguleret ekspression af Mcl-1, Bcl-2, Bcl-X

L, c-IAP1, c-IAP2, FLIP, og survivin, og deres overekspression i talrige tumorer er blevet forbundet med tumorcelleoverlevelse, kemoresistens, og radioresistance. Vores resultater viser, at digitoflavone behandling nedregulerer alle disse genprodukter. Digitoflavone har vist sig at hæmme væksten af ​​mange forskellige tumorceller såsom leukæmiceller og ikke-småcellet lungekræft celler [30]. Denne vækstinhibering kan medieres gennem nedregulering af forskellige gener. Nedregulering af forskellige anti-apoptotiske gen produkter af digitoflavone også sensibiliserede cellerne til de apoptotiske virkninger af TNFa. Yderligere undersøgelser har vist, at digitoflavone havde en god bindingspotens til ATP-bindingsstedet af IKK, hvilket viste, at digitoflavone meget sandsynligt inhiberede NF-KB-vejen gennem hæmning af IKK. Digitoflavone kunne aktiv JNK og overekspression af p65 forhindrede digitoflavone-induceret JNK-aktivering. Dig kan være en roman stof til at give en kontinuerlig blokade af feed-back hæmmende mekanisme JNK-induceret NF-kB-aktivering. Dette kan være den mekanisme, hvorfor digitoflavone kan sensibilisere TNFa. Selvfølgelig mere eksperimentel verifikation, herunder

in vivo

undersøgelse var nødvendig.