PLoS ONE: Det hensigtsmæssige i Brug Patient-Afledt xenograftmodeller for farmakologisk Evaluering af nye behandlingsformer for Esophageal /gastro-esophageal Junction Kræft

Abstrakt

Den høje morbiditet og mortalitet hos patienter med esophageal (E) og gastro-esophageal krydset (GEJ) kræftformer, garanterer nye prækliniske modeller for test af lægemidler. Nytten af ​​primære tumorxenoplantater (PTXGs) som prækliniske modeller blev vurderet. Klinisk-patologisk, immunhistokemiske markører (p53, p16, Ki-67, Her-2 /

neu

og EGFR), og globale mRNA overflod profiler blev evalueret for at afgøre udvælgelsesskævhed prøver implanteret eller indpodede, sammenlignet med den underliggende befolkning . Ni primær E /GEJ adenocarcinom xenograft linjer blev yderligere karakteriseret for spektret og stabilitet gen /protein-ekspression i løbet af passager. Syv primære esophageal adenocarcinom xenograft linjer blev behandlet med individuelle eller kombinationskemoterapi. Tumorer, der blev implanteret (n = 55) i NOD /SCID mus havde funktioner, der tyder på mere aggressiv biologi end tumorer, der aldrig blev implanteret (n = 32). Af dem implanteret, 21/55 indpodet; indpodning var forbundet med dårligt differentieret tumorer (p = 0,04) og ældre patienter (p = 0,01). Angivelse af immunhistokemiske markører var ens mellem patientprøve og tilsvarende xenograft. mRNA forskelle observeret mellem patient tumorer og første passage xenografter var stort set på grund af tab af menneskelig stroma i xenografter. mRNA mønstre af tidlige vs sene passage xenotransplantater og af små vs store tumorer i samme passage var ens. Komplet modstand var til stede i 2/7 xenotransplantater mens de resterende tumorer viste forskellige grader af følsomhed, der forblev konstant på tværs passager. På grund af deres evne til at rekapitulere primære tumor egenskaber under transplantation og tværs seriepassage kan PTXGs være nyttige kliniske systemer til vurdering af narkotika følsomhed menneskelig E /GEJ kræftformer

Henvisning:. Dodbiba L, Teichman J, Fleet A , Thai H, Starmans MHW, Navab R, et al. (2015) hensigtsmæssigt at anvende Patient-Afledt xenograftmodeller for farmakologisk Evaluering af nye behandlingsformer for esophageal /gastroøsofageal Junction Kræft. PLoS ONE 10 (3): e0121872. doi: 10,1371 /journal.pone.0121872

Academic Redaktør: Wayne A. Phillips, Peter MacCallum Cancer Center, AUSTRALIEN

Modtaget: 13 juli, 2014 Accepteret: 17 Februar 2015; Udgivet: Marts 31, 2015

Copyright: © 2015 Dodbiba et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle mRNA-ekspression filer er tilgængelige fra GEO-databasen (tiltrædelse nummer: GSE58870).

Finansiering: GL blev støttet af Alan B. Brown Chair i Molecular Genomics, Posluns Family Fund og CCO Chair i Experimental Therapeutics og Population Studies. Denne undersøgelse blev udført med støtte fra Ontario Institute for Cancer Research til PCB gennem finansiering fra regeringen i Ontario. LEA blev støttet af en Ontario Institute for Cancer Research New Investigator Award. PCB blev understøttet af en Terry Fox Research Institute New Investigator Award. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i de seneste årtier har esophageal (E) og gastro-esophageal krydset (GEJ) kræft set en dramatisk stigning i forekomsten i de udviklede lande, mens den femårige overlevelse er fortsat lav på 19% [1]. Identificering metoder til at vælge passende lægemiddelbehandlinger er derfor berettiget. Traditionelt har cellelinje paneler blevet anvendt til hurtigt at teste anticancermidler [2,3]. Desuden injektioner af cellelinier til immunkompromitterede mus er almindelige

in vivo Salg modeller af lægemiddeleffektivitet [4,5]. Selvom cellelinje tilgange i høj grad har bidraget til udvikling af medicin og kræft biologi, de er ufuldkomne modeller til test af lægemidler [6]. Endvidere blev tre udbredte E /GEJ cancercellelinier nylig fundet at være blevet forurenet med andre cellelinier tidligt i kultur [7]. Således idetifying hensigtsmæssige prækliniske lægemiddel-testning modeller af denne kræft er en udfordring.

Primære tumorxenoplantater (PTXGs) viser lovende som alternative prækliniske modeller for narkotika følsomhed testning. PTXGs er skabt ved at implantere et stykke tumor direkte fra en patient ind i immunkompromitterede mus og ved hjælp af den resulterende xenograft til eksperimenter. Primær tumor xenograftmodeller af lunge [8], bryst [9], colon [10], hoved og hals [11] og E /GEJ cancere [12] har vist sig at rekapitulere patienten tumorhistologi og cellemorfologien i varierende grad. Fysiologiske forhold såsom temperatur, iltindhold, indhold af næringsstoffer

etc

. mere ligner de tilstedeværende hos cancerpatienter [6]. Desuden har PTXGs ikke har undergået den udvælgelse og væsentlige molekylære ændringer, der er involveret i celle linje etablering og langsigtet vækst [6], [13,14]. Således kan PTXGs være mere tilbøjelige til at forudsige narkotika reaktioner end cellelinjer dyrket enten

in vitro

eller

in vivo

. Men mens PTXGs er blevet vist at efterligne den oprindelige tumor respons på behandlingen temmelig nøjagtigt [15-17], er de stadig udsat for udvælgelseskræfter relateret til forskelle mellem humane og murine mikromiljøer [18]. Det er således vigtigt at vurdere, i hvilken grad PTXGs afviger fra de primære patient tumorer på genomiske og protein niveau, inden der iværksættes omfattende narkotika studier.

Vi har tidligere beskrevet PTXG model udvikling [12]. Det næste logiske skridt er det overordnede mål med denne undersøgelse: at vurdere nytten og begrænsninger for at bruge PTXG modeller til test af lægemidler. Specifikt hvad grad er E /GEJ tumorer repræsenterer patientens tumorer, i forbindelse med farmakologisk evaluering? Vores egne eksperimenter på tværs af flere typer kræft har identificeret almindelige PTXG emner som: (i) manglende transplantation af mange tumorer; (Ii) uventede muse dødsfald, hvilket fører til behovet for at ændre og køre eksperimenter på tværs af forskellige passager; (Iii) tekniske grunde, såsom behovet for at udvide xenografter i store kohorter og fastfryse ned tidligere passager for at sikre tilgængelighed for fremtidige undersøgelser, hvilket resulterer i at skulle bruge senere passager for narkotika eksperimenter; og (iv) en lejlighedsvis manglende evne til at identificere specifikke PTXG modeller med samme molekylære karakteristika observeret i en patient

Disse tekniske spørgsmål rejser fire vigtige model-relaterede spørgsmål, som kan angives som testbare hypoteser:. (a) PTXG modeller er repræsentative for den underliggende population af gastro-esophageal kræft (dvs. vurdere engraftment bias), og hvis ikke helt repræsentativ, er vi i stand til at beskrive, hvad fordomme er til stede, og hvordan de kan påvirke konklusioner; (B) PTXG modeller er anvendelige i almindelighed, selv ved senere passager, som deres gen /protein ekspressionsmønstre forbliver stabile; denne hypotese måler graden af ​​confounding ved udvælgelse pres under passage; (C) PTXGs kan rekapitulere det brede spektrum af molekylære egenskaber er repræsentative for deres underliggende primære kræftformer; dette løser bekymringer ikke at finde den inter-tumor heterogenitet nødvendigt at udvikle skræddersyet medicin tilgange til terapi; og (d) PTXGs reagerer på farmakologisk terapi stabilt på tværs af flere passager. Således har vi vurderet potentialet i E /GEJ PTXGs at kopiere hvad der er fundet klinisk i menneskets E /GEJ tumorer, og de betingelser, hvorunder disse PTXGs er passende at bruge som prækliniske narkotika testning modeller.

Materialer og metoder

klinisk og patologisk Patientinformation

Alle patienter blev rekrutteret gennem skriftlig tilladelse. Patientinformation, herunder behandling og udfald (

jeg

.

e

. Samlet overlevelse) blev opnået via den elektroniske patientjournaler system på University Health Network (UHN), Toronto, Canada, ved mave -intestinal onkologer. Den UHN Research Ethics Board (REB #: 06-0982-CE). Godkendte undersøgelsen

Dyr og Tissue Processing

Ikke-Obese Diabetic-Severe Combined Immune Mangelfuld (NOD /SCID) mus blev avlet internt i Ontario Cancer Institute (OCI) Animal Care facilitet. Alle dyr blev holdt i et patogen fri miljø på en standard 12 timer-dage /12 hr-nat cyklus og blev fodret med en standard steriliseret pellet kost og vand

ad libitum

. Dyr blev aflivet under anvendelse af carbondioxid efterfulgt ved cervikal dislokation. Alle procedurer blev godkendt af de etiske retningslinjer i OCI Animal Care udvalget (dyr protokol #: 1293,16).

Menneskelig E /GEJ kræft væv blev opnået fra patienter, der gennemgår kirurgisk resektion på UHN, Toronto, Ontario og blev behandlet som tidligere beskrevet [12]. Sammenfattende blev frisk væv opbevaret i RPMI 1640-medium (ingen FBS tilsat), indtil den blev skåret i stykker af ca. 5 mm dimensioner og implanteret subkutant i flanken af ​​NOD /SCID-mus (inden for 24 timer efter resektion, dog blev cancervæv tilføjet i vævskultur medier inden for en median på 45 minutter efter resektion, og holdes i medierne indtil implantation). To repræsentative stykker blev reddet i Optimal Cutting Temperatur (OLT) forbindelse (nedfrosset ved -80 ° C i molekylær arbejde) og formalin fikseret paraffinindlejret (FFPE) blokke til molekylær og patologisk analyse henholdsvis.

Behandling

kohorter af 10 implanterede mus per behandling arm blev overvåget for tumorvækst. Når synlig, blev tumorer målt ved hjælp af metriske skydelære (Scienceware, kat: 134160001) to gange om ugen. Musene blev aflivet, når tumorerne nåede 15-20 mm på den længste dimension, betragtes som en human endepunkt af Animal Care udvalget. Når tumorer nåede ca. 300-750 mm

3, mus blev randomiseret i kontrol- og kemoterapi arme. For enlige eksperimenter behandling blev mus kohorter injiceret en gang intraperitonealt med 6 mg /kg cisplatin (1 mg /ml, Hospira, DIN: 02.126.613), 9 mg /kg paclitaxel (2 mg /ml, Hospira, DIN: 02.296.624) eller 100 mg /kg af 5-fluoruracil (15 mg /ml, Hospira, DIN: 021.827.420), mens kontrolgruppen blev injiceret med saltvand. For kombinerede eksperimenter behandling blev kemoterapi gruppe behandlet en gang med 5.4mg /kg cisplatin (1 mg /ml, Hospira, DIN: 02.126.613) og 9 mg /kg paclitaxel (2 mg /ml, Hospira, DIN: 02.296.624), baseret på mus toksicitet eksperimenter. Mus blev aflivet 24 timer efter den første behandling (mærket som små tumorer) og ved afslutningen af ​​forsøget (store tumorer). En median af to mus (1-3) pr arm blev ofret til sammenligninger. Tumorer blev høstet og gemt i OLT og FFPE blokke for molekylær /patologisk karakterisering.

Immunhistokemi af molekylære markører

Vi evaluerede et panel af molekylære markører ved immunhistokemi (IHC) at undersøge deres stabilitet inden for hver xenograft. Markører blev valgt ud fra deres betydning for E /GEJ kræft. FFPE vævssnit blev farvet med antistoffer mod p53 (klon DO-7, Vector Laboratories, Burlington, Canada, fortynding: 1: 250), p16

INK4a (MTM laboratorier AG, Heidelberg, Tyskland, Not- udvandet), Ki 67 (klon SP6, NeoMarkers, Rockford, USA, fortynding: 1: 500), EGFR (Clone 31G7, Zymed, San Fransisco, USA, fortynding: 1: 100), Her-2 /

neu

(klon A0485, Dako, Burlington, Canada, fortynding: 1: 25), HIF-1α (klon 54, BD Biosciences, Franklin Lakes, USA, fortynding: 1: 50) og CD31 (klon PECAM1, Santa Cruz, USA, fortynding: 1 : 1000). En farvning indeks blev anvendt til at evaluere CD31 og HIF-1α ekspression under anvendelse Aperio ImageScope viewer. Alle andre molekylære markører blev evalueret af en blindet team af patologer. En kombination af en andel score og en intensitet score blev anvendt. Andelen score (andelen af ​​positive tumorceller) var: 0: ingen, 1: 1-24%, 2: 25-49%, 3: 50-74, 4: ≥75%. Intensiteten score (intensiteten af ​​farvning af tumorceller) var: 0: ingen, 1: svag, 2: moderat, 3: stærk. En samlet score blev opnået ved at kombinere de to scorer. Kort fortalt blev p53 og p16 være positiv, hvis farvning optrådte mens Ki-67 blev evalueret baseret på procentdelen af ​​positive tumorceller. EGFR membran-ekspression bestemmes EGFR-positivitet. Her-2 /

neu

standard scoring blev brugt; prøver blev anset for at have tilsvarende udtryk, hvis de adskiller sig med mindre end én plet intensitet score (f.eks. 2+ vs 3+). To sidet t-test blev anvendt til at evaluere forskelle i udtryk for disse parametre.

RNA Extraction

RNA blev ekstraheret fra OLT indlejret xenograft og humant væv (ti x 10 um tykke frysemikrotomsnit skiver) ved hjælp af RNeasy Mini-kits (Qiagen, 74.104). RNA integritet blev vurderet ved hjælp af Agilent-2100-Bioanalyzer og RNA Nano-6000-kit (Agilent Technologies, 5067-1511) og kvantificeres ved hjælp af et NanoDrop-ND-1000 spektrofotometer (Thermo-Scientific). RNA integritet numre (RIN) på 7 + eller 8 + var som kvalitet cutoffs for patient og PTXG prøver henholdsvis.

Mærkning og hybridisering

Prøverne blev mærket efter den GeneChip WT Terminal Mærkning og hybridisering manual, hybridiseret til human Gene-1.1-ST arrays (Affymetrix) og scannes med GeneChip Scanner 3000-7G (Affymetrix). Alle arrays kriterier bestået kvalitetskontrol (Expression Console software, Affymetrix).

Statistisk analyse

For kemosensitivitet analyse blev forsinkelsen i tid til en tumor at blive fordoblet i volumen i forhold mellem behandlede linjer og deres tilsvarende ubehandlede kontroller. Tidsforsinkelser blev bestemt ved at plotte tumor volumen på en logaritmisk y-skala og trække en vandret linje ved fordobling volumen, der opfanget kontrol- og behandlingsgruppen vækstkurver. Tidsforsinkelsen blev bestemt som forskellen i tid mellem de to aflytninger og blev omtalt som fordobling tidsforsinkelse. Den gennemsnitlige fordobling tidsforsinkelsen for resistente vs. sensitive linjer blev beregnet ved at samle alle kontrol mus og sammenligne dem med de puljede værdier behandlede mus.

Yderligere statistiske analyser blev udført på klinisk-patologiske faktorer til at bestemme skævhed i undersøgelsen prøve , og til at bestemme faktorer forbundet med transplantation. Tosidede t-tests blev anvendt i alle tilfælde. Resultaterne blev betragtet som signifikante, når

s

-værdi 0,05. Statistiske analyser blev udført ved hjælp SAS.v.9.2 (Cary, NC).

Gene profilanalyse

Både primær patient tumor og matchede xenograft prøver blev brugt til transkriptom analyser (i alt, 51 prøver blev analyseret for mRNA overflod). Enogtyve adenocarcinom tumorer blev profileret (12 indpodet /9 ikke-indpodet). For otte indpodede primære adenokarcinomer blev en én (P1) xenograft prøve passage profileret. Derudover blev analyse udført på 21 senere passage xenografter (P3 gennem P12), hvoraf ni var fra små (tidligt i vækstkurven) tumorer og 12 var fra store tumorer.

Vi vurderede forskelle i mRNA-profiler mellem (a) patient tumorer, der indpodede

vs

dem, der ikke gjorde det, (b) P1 implanteret

vs

P0 (primær) tumorer, (c) senere passage implanteret

vs

P1, og (d) store

vs

små xenotransplantattumorer inden for samme passage. For hver sammenligning, et gen-wise lineær model var egnet til at sammenligne de to betingelser, justeret for matrix parti og i givet fald, til passage. En falsk-discovery korrektion blev udført for at tage højde for flere test [19].

Alle analyser blev udført ved hjælp af R (v2.15.3). Den pakker gitter (v0.20-15) og latticeExtra (v0.6-24) blev anvendt til grafisk gengivelse. Data, forbehandling blev udført ved hjælp af RMA-algoritmen [20] (Affymetrix pakke, v1.36.0) kombineret med opdaterede ProbeSet anmærkninger (hugene11stv1hsentrezgcdf pakke, v15.0.0) [21]. Et udtryk filter blev anvendt til at fjerne eksperimentelle støj. En tærskel lav intensitet blev sat baseret på kromosom-Y gen intensiteter af de fem kvindelige patientprøver som tidligere [22] beskrevne. Sonder med en gennemsnitlig log

2-transformerede udtryk værdi under fem blev fjernet. I alt blev ~ 15.500 prober bibeholdt.

En magt analyse blev udført med power.t.test funktion (statistik pakke v.2.15.3) at estimere sandsynligheden for, at forskelle i ekspressionsniveauer kunne identificeres mellem grupper. Eftersom udtrykket data var i log

2-rum, en forskel i den gennemsnitlige ekspression svarede til log

2-transformeret fold-change. Antallet af observationer i hver gruppe blev sat til 10, og signifikansniveauet blev sat til 0,05 /15.500 = 3×10

-6 (

jeg

.

e

., Bonferroni korrigeret). Strøm blev beregnet for en række fold-ændringer (