PLoS ONE: MicroRNA miR-34 hæmmer human bugspytkirtelkræft tumorfremkaldende celler

abstrakt

Baggrund

MikroRNA’er (miRNA) er blevet impliceret i cancer initiering og progression via deres evne til at påvirke ekspression af gener og proteiner, der regulerer celleproliferation og /eller celledød. Transkription af de tre miRNA MIR-34 familiemedlemmer blev for nylig fundet at blive reguleret direkte af p53. Blandt de målproteiner reguleres af miR-34 er Notch pathway proteiner og Bd-2, hvilket tyder muligheden for en rolle for miR-34 i vedligeholdelse og overlevelse af kræft stamceller.

Metode /vigtigste resultater

Vi undersøgte roller miR-34 i p53-mutant humane bugspytkirtelkræft cellelinier MiaPaCa2 og BxPC3, og det potentielle link til kræft i bugspytkirtlen stamceller. Restaurering af miR-34 ekspression i bugspytkirtelkræftceller ved enten transfektion af miR-34 efterligner eller infektion med lentiviral miR-34-MIF nedreguleret Bcl-2 og Notch1 /2. MIR-34 restaurering inhiberede signifikant klonogenisk cellevækst og invasion, apoptose og G1 og G2 /M standsning i cellecyklus, og sensibiliserede cellerne til kemoterapi og strålebehandling. Vi identificerede, at CD44 + /CD133 + MiaPaCa2 celler er beriget med tumorsphere-dannende og tumor-initierende celler eller cancer stamceller /progenitorceller med høje niveauer af Notch /Bcl-2 og tab af MIR-34. Mere væsentligt, miR-34 restaurering ført til en reduktion 87% af tumor-initierende celle population, ledsaget af signifikant hæmning af tumorsphere vækst

in vitro

tumordannelse

in vivo

.

konklusioner /Signifikans

Vores resultater viser, at mIR-34 kan genoprette, i det mindste delvis, tumor undertrykke funktionen af ​​p53 i p53-deficiente humane pankreatiske cancerceller. Vore data understøtter den opfattelse, at MIR-34 kan være involveret i bugspytkirtelkræft stamcelle selvfornyelse, potentielt via den direkte modulering af downstream mål Bcl-2 og Notch, hvilket indebærer, at MIR-34 kan spille en vigtig rolle i bugspytkirtelkræft stamcelle selv-fornyelse og /eller celle skæbne beslutsomhed. Restaurering af miR-34 kan holde betydelig løfte som en ny molekylær terapi til human bugspytkirtelkræft med tab af p53-miR34, potentielt via hæmme kræft i bugspytkirtlen stamceller

Henvisning:. Ji Q, Hao X, Zhang M, Tang W, Yang M, Li L et al. (2009) MicroRNA miR-34 hæmmer human bugspytkirtelkræft tumorfremkaldende celler. PLoS ONE 4 (8): e6816. doi: 10,1371 /journal.pone.0006816

Redaktør: Eric J. Bernhard, National Cancer Institute, USA

Modtaget 22. januar 2009; Accepteret: August 5, 2009; Udgivet: 28 August, 2009

Copyright: © 2009 Ji et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist understøttet af NIH tilskud CA121830-01, CA128220-01 og CA134655-01A1 (L. Xu.), og ved NIH gennem University of Michigans Cancer center Support Grant (P30 CA46592). JTD er en University of Michigan Undergraduate Research Opportunity Program (UROP) studerende. De finansieringskilder havde ingen rolle i udformningen og gennemførelse af undersøgelsen, i dataindsamling, analyse og fortolkning, og beslutning om at offentliggøre, revision, godkendelse, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklærede, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

MikroRNA’er (miRNA) er en konserveret klasse af ikke-kodende 20-22 nt små RNA, der regulerer gen og protein-ekspression ved at binde til mRNA, der fører til mRNA nedbrydning eller inhibering af translation [1], [2]. miRNA sandsynligt regulerer forskellige biologiske processer, herunder vævsdifferentiering og vedligeholdelse, og har bidrager roller i forskellige sygdomsprocesser, herunder cancer [2], [3], [4]. Nye beviser tyder på, at miRNA også spille en væsentlig rolle i stamcelle selv-fornyelse og differentiering ved negativ regulering af ekspressionen af ​​visse vigtige gener involveret i selv-fornyelse og overlevelse, såkaldte “stamceller gener” [1], [2] [4], [5]. For nylig blev der fundet tre medlemmer af MIR-34 familien skal reguleres direkte af p53 og den funktionelle aktivitet af MIR-34 indikerede en potentiel rolle som tumorsuppressor [6], [7], [8], [9] [10], [11], [12]. Vi har tidligere rapporteret, at Bcl-2-proteinet reguleres direkte af MIR-34 [10]. Rapporten fra He et al. indikerede, at ektopisk ekspression af MIR-34 inducerer standsning af cellecyklus i både primære og tumorafledte cellelinjer, som er i overensstemmelse med evnen hos MIR-34 at nedregulere et program af gener, der fremmer cellecyklusprogression [11]. Vi har for nylig vist, at ekspression af MIR-34s er drastisk reduceret i p53-mutant gastriske cancerceller og at genoprettelsen af ​​MIR-34 ekspression inhiberede cancercellevækst [6]. Tab af MIR-34 er blevet forbundet med kemoresistens af cancer [13]. MIR-34a er blevet rapporteret at være involveret i p53-medieret apoptose i tyktarmskræft og kræft i bugspytkirtlen [8], [9]. Chang et al. rapporterede, at 15 pancreas cancer cellelinjer har mindst 2 gange reduktion i MIR-34a-ekspression i sammenligning med ekspression i normale pankreatiske duktale epiteliale cellelinier [8]. Tilsammen de offentliggjorte undersøgelser tyder MIR-34 familiemedlemmer kan have tumorsuppressorfunktion nedstrøms for p53. Hertil kommer, fordi mere end 50% af primære humane kræftformer har mutationer inaktivere p53-funktion, resultaterne forudsat skub til at udforske den funktionelle restaurering af miR-34 som en ny tilgang til at hæmme kræft med p53 tab af funktion.

en anden potentiel rolle for miR-34 i kræft initiering og progression kan være et link til tumor-initierende celler eller cancer stamceller (CSC). Det er blevet rapporteret, at MIR-34-mål Notch, c-Met og Bcl-2, gener involveret i selvfornyelse og overlevelse af cancer stamceller [10], [11], [14]. På nuværende tidspunkt er forbindelsen mellem p53, downstream target miR-34 og formodede bugspytkirtelkræft stamceller er ukendt. I den aktuelle undersøgelse har vi undersøgt virkningerne af funktionelle restaurering af miR-34 af MIR-34 efterligner og lentiviral miR-34a på humane p53-mutant bugspytkirtelkræft MiaPaCa2 celler, samt den mulige forbindelse til kræft i bugspytkirtlen stamcelle selv -fornyelse. Afgrænse rolle miR-34 i regulering af cellevækst og tumor progression, og dens potentielle link til tumor-initierende celler eller cancer stamceller kan danne grundlag for at udforske sit potentiale som en ny behandling strategi.

Materialer og metoder

Cell kultur og reagenser

humane bugspytkirtelkræft cellelinjer og den normale menneskelige lunge fibroblast cellelinje WI-38 blev indkøbt fra American Type Culture Collection og dyrket i DMEM (HyClone, Logan, UT), suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS; HyClone, Logan, UT). mi

RIDIAN

miRNA miR34a, b, c efterligner og negativ kontrol miRNA mimic (NC efterligne), mi

RIDIAN

miR-34-hæmmere og negative kontroller blev opnået fra Dharmacon (Chicago, IL) [ ,,,0],6]. Bcl-2 3’UTR luciferasereporterplasmid eller dens mutant har tidligere [10] blevet rapporteret. QRT-PCR-primere og antistoffer til Western blot er beskrevet i vores nylige publikation [6].

Transfektion af MIR-34 efterligner

MiaPaCa2 celler blev transficeret 24 timer efter at være udsået i 6-brønds plader. miRNA efterligner (100 pmol) i 200 pi serumfrit, antibiotika-fri, medium blev blandet med 5 pi Lipofectamine 2000 transfektionsreagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) opløst i 200 pi af det samme medium og fik lov til at henstå ved stue temperatur i 20 min. De resulterende 400 pi transfektions- opløsninger blev derefter tilsat til hver brønd indeholdende 1,6 ml medium. Seks timer senere blev kulturerne erstattet med 2 ml frisk medium suppleret med 10% FBS og antibiotika. For Western blot blev celler opsamlet efter yderligere 48 timer.

Lentiviral miR-34a infektion

Den feline immundefekt virus (FIV) lentiviral system, der udtrykker miR-34a (miR-34a-MIF) eller vektor kontrol (MIF), samt en lentiviral pakkesystem, blev købt fra System Biosciences (SBI, Mountain View, CA). MiaPaCa2 og BxPC3 celler blev inficeret med FIV lentiviral systemet udtrykker MIR-34a (MIR-34a-MIF) eller vektorkontrol (MIF), og de inficerede celler blev selekteret via antibiotikaresistens (Zeocin 50 ug /ml, Invitrogen), som vi beskrev for nyligt [6].

mIR-34 Bcl-2-3’UTR reporter assay

MiaPaCa2 celler blev transficeret i plader med 6 brønde med 2 ug Bcl-2 3’UTR luciferase reporterplasmid eller dens mutant [6], [10], og 2 ug af kontrol β-galactosidase-plasmid, per brønd under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Celler blev også cotransficeret med 100 pmol af hver MIR-34 efterligner eller NC efterligning, som indikeret ved hjælp af Lipofectamine 2000. Luciferase-assays blev udført 24 timer efter transfektion under anvendelse af Bright-Glo Luciferase Assay System (Promega). Luciferaseaktivitet blev normaliseret i forhold til p-galactosidase-aktivitet detekteres af β-galactosidase Assay System (Promega). I hvert tilfælde mutant Bcl-2 3’UTR viser indførelsen af ​​ændringer i frø komplementære steder af Bcl-2 3’UTR [10].

Kolonidannelse og klongenicitetsassayet

I kolonidannelse assayet blev celler transficeret med mIR-34 efterligner eller NC efterligne i 24 timer, og derefter podet i en 6-brønds plade i tre eksemplarer. 0,2 ml FBS tilsat per brønd på dag 5. Efter 9-10 dages inkubation blev pladerne forsigtigt vasket med PBS og farvet med 0,1% af krystalviolet. Kolonier med over 50 celler blev manuelt talt. Udpladningseffektivitet blev beregnet ved at dividere antallet af kolonier dannet i den behandlede gruppe ved at i kontrol. For klonogene overlevelse assay blev cellerne transficeret med MIR-34 efterligner eller NC efterligne i 24 timer, og derefter podet i plader med 6 brønde i tre eksemplarer ved den ønskede celledensitet (200~10,000 celler /brønd), efterfulgt af røntgenstråling . De celle overlevelseskurver blev afbildet ved hjælp af en lineær-kvadratisk model og strålingen enhancement ratio (ER) blev beregnet som vi tidligere beskrevet [15], [16], [17].

Kvantitativ realtid RT- PCR (QRT-PCR)

QRT-PCR blev udført for at bestemme ekspressionsniveauerne af potentielle mIR-34 målgener [6]. Fireogtyve timer efter MIR-34 efterligner transfektion af MiaPaCa2 celler med MIR-34 efterligner (100 pmol per brønd i 6-brønds plader), ekspressionen af ​​potentielle målgener blev målt ved QRT-PCR med SYBR Green PCR System (TaqMan) . Kort beskrevet blev totalt RNA ekstraheret fra de transficerede celler under anvendelse af TRIZOL (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Revers transkription blev udført ved anvendelse af et TaqMan Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). For QRT-PCR blev 1 pi af gen primere med SYBR Green (Applied Biosystems) i 20 ul reaktionsvolumen anvendt. Primere blev designet som: Bcl-2, fremad, 5′-CAT GCT GGG GCC GTA CAG-3 ‘, reverse, 5′-GAA CCG GCA CCT GCA CAC-3′; HMGA2, fremad, 5’-TTT GTA ATC FTT TCA CAG TCC-3 ‘, omvendt, 5′-TTT CTC ACC CGC CCA C-3′; Notch1, fremad, 5’-ATC CAG AGG CAA ACG GAG-3 ‘, omvendt, 5′-CAC ATG GCA ACA TCT AAC CC-3′; Notch2, fremad, 5’-GGA CCC TGT CAT ACC CTC TT-3 ‘, omvendt, 5′-CAT GCT TAC GCT TTC GTT TT-3′; Notch3, fremad, 5’-TGA TCG GCT CGG TAG TAA TG-3 ‘, omvendt, 5′-CAA CGC TCC CAG GTA GTC A-3′; Notch4, fremad, 5’-TGC GAG GAA GAT ACG GAG TG-3 ‘, omvendt, 5′-CGG GAT CGG AAT GTT GG-3′; β-actin, fremad, 5’-ATG CAG AAG GAG ATC ACT GC-3 ‘, reverse, 5′-TCA TAG TCC GCC TAG AAG CA-3’. Alle reaktioner med TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) blev udført på Mastercycler Realplex 2 (Eppendorf, Westbury, NY). Målgen mRNA niveauer blev normaliseret til actin mRNA efter følgende formel: [2- (C

T

target – C

T

Actin)] x 100%, hvor C

T er tærsklen cyklus. Den relative ekspression blev beregnet ved at dividere den normaliserede målgenekspression af den behandlede prøve med den for den ubehandlede kontrol, med værdien fra NC efterligner angivet som 1 arbitrær enhed. For målgener udtryk i de sorterede celler, data blev normaliseret til den for actin (sæt Actin = 1000 arbitrær enhed).

Caspase-3-aktivering assay

caspase aktivering i de transfekterede MiaPaCa2 celler blev bestemt efter instruks fra en Caspase-3-aktivering assay kit (BioVision, Mountain View, CA). Fireogtyve timer efter transfektion blev cellerne lyseret, og hele cellelysater (20 ug) blev inkuberet med 25 pM fluorogent substrat DEVD-AFC i en reaktionsbuffer (indeholdende 5 mM DTT) ved 37 ° C i 2 timer. Proteolytisk frigivelse af AFC blev overvåget ved X ex = 405 nm og Aem = 500 nm under anvendelse af en fluorescensmikropladelæser (BMG LABTECH, Durham, NC). Relativ caspase-3-aktivering blev beregnet ved at normalisere fluorescenssignalet i hver behandlede prøve med den for NC efterligner eller MIF kontrol sat til 100 vilkårlig enhed [16]. Salg

cellecytotoksicitetsassay

MiaPaCa2 celler blev transficeret med mIR-34 efterligner eller NC efterligne i 24 timer, udpladet i plader med 96 brønde (5000 celler /brønd) og behandlet med serielt fortyndede kemoterapeutiske midler, tredobbelt. Efter 96 h inkubation blev 20 pl /brønd CCK-8 reagens tilsat og inkuberet ved 37 ° C i 1-3 timer. Optisk densitet blev målt ved 450 nm og 650 nm under anvendelse af en mikropladelæser (BMG LABTECH, Durham, NC). IC

50, blev det stof koncentration, der hæmmer 50% cellevækst beregnet af GraphPad Prism 5.0 (San Diego, CA), som vi beskrev tidligere [18].

Cell cyklus og apoptose analyse

i cellecyklus og apoptose analyse ved flowcytometri blev MiaPaCa2 celler transficeret med mIR-34 efterligner eller NC efterligner i 6-brønds plader, trypsiniseret 24 timer senere og vasket med phosphatpufret saltvand og fikseret i 70% ethanol på is . Efter centrifugering blev celler farvet med 50 pg /ml propidiumiodid og 0,1 ug /ml RNase A, og analyseret ved flowcytometri under anvendelse af et FACStar Plus ™. Hver histogram blev bygget med data fra mindst 5.000 arrangementer. Data blev analyseret for at beregne procentdelen af ​​cellepopulation i hver fase under anvendelse af CellQuest software, samt% af cellerne i sub-G1 (Becton Dickinson) [18].

CD44 og CD133-farvning og cellesortering Salg

MiaPaCa2 celler blev inkuberet med PE-konjugeret anti-humant CD133 /1-antistof og APC-konjugeret anti-humant CD44-antistof (Miltenyi Biotec, Aubum, CA, USA) i PBS indeholdende 2% FBS. Isotype-matchet muse immunoglobulin tjente som kontroller. Til flowcytometri blev prøver analyseret under anvendelse af et FACSCalibur flowcytometer og CellQuest software (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). For cellesortering med flowcytometri blev prøver analyseret og sorteret på en BD FACSVantage SE (BD Biosciences). Portioner af CD133

+ og CD133

– sorterede celler blev bedømt for renhed med en FACSCalibur maskine og CellQuest software (BD Biosciences), ved anvendelse af PE-konjugeret anti-humant CD133 /2-antistof (Miltenyi Biotec) [19].

Tumorsphere kultur

De sorterede MiaPaCa2 celler blev suspenderet i serumfrit kulturmedium DMEM indeholdende 1% N2 supplement, 2% B27 supplement, 1% antibotic-antimycotisk (Invitrogen), 20 ng /ml humant FGF-2 (Sigma), og 100 ng /ml EGF (Invitrogen) og udpladet i 24-brønds ultralav montagepladerne (Corning) 2.000 celler pr. 7-10 dage senere blev pladerne analyseret for tumorsphere dannelse og blev kvantificeret under anvendelse af et omvendt mikroskop (Olympus) ved 100X, 200X og 400 × forstørrelser. Til efterfølgende kvantificering af celleantal pr tumorsphere blev tumorspheres opsamlet med en 40 um sigte (BD Biosciences, San Jose, CA) og adskilles med trypsin for at gøre en enkelt cellesuspension. De levedygtige celler blev derefter talt ved anvendelse af trypan blue eksklusion.

Animal model og in vivo tumordannelse undersøgelse

fem- til seks uger gammel kvinde athymiske ncr-nu /nu nøgne mus blev købt hos NCI. MiaPaCa2 celler blev transficeret med MIR-34a efterligner eller NC efterligne i 24 timer. Celler blev opsamlet og inokuleret i nøgne mus subkutant (s.c.) på begge flanker, efter alkohol forberedelse af huden, under anvendelse af en steril 22-gauge kanyle med 0,2 ml cellesuspension af 1 × 10

6 celler, med manuel tilbageholdenhed. Tumorstørrelserne blev målt ved anvendelse af en skydelære. Tumor volumen blev beregnet ved hjælp af formlen: (længde × bredde

2) /2. På dag 38 blev alle tumorer opsamlet for at måle tumorvægte. Alle eksperimenter dyr blev udført i overensstemmelse med protokollen er godkendt af University of Michigan Retningslinjer for brug og pasning af dyr.

Statistisk analyse

To-vejs ANOVA og tosidede

t

-tests var ansat til at analysere

in vitro

in vivo

data ved hjælp af Prism 5.0 software (GraphPad, San Diego, CA).

P

. 0,05 blev defineret som statistisk signifikant

Resultater

Angivelse af MIR-34s i humane bugspytkirtelkræft cellelinjer

Vi undersøgte en række af humane pancreas cancer cellelinjer, MiaPaCa2, BxPC3, Capan1, Capan2, Panc-1, og den normale menneskelige lunge fibroblast cellelinje WI-38, for miR-34a, b, c udtryk. Vi har også vurderet i parallel ekspressionen af ​​formodede MIR-34-regulerede målgener og proteiner, under anvendelse af primerne og metoder, som vi beskrev for nylig [6]. MiaPaCa2 og BxPC3 celler har meget lave ekspressionsniveauer af både primær og modne miR-34a, b, c, men høje niveauer af MIR-34 målgener

BCL2

og

Notch1

, og forskellige niveauer af

Notch2-4

(figur 1). De har også lave ekspressionsniveauer af p21 (figur 1

C

), en anden mRNA mål for p53, i overensstemmelse med den cellelinie er p53-mutant status. Baseret på disse data og vores observation, at de er meget tumorgene og reproducerbart danner tumorspheres

in vitro

, valgte vi de to cellelinjer for den aktuelle undersøgelse.

A

, Western blot-analyse.

B

, QRT-PCR-analyse af relative ekspressionsniveauer af MIR-34s.

C

, QRT-PCR-analyse af ekspressionsniveauerne af miR-34 målgener i humane pancreas cancer cellelinjer samt normale menneske fibroblast WI-38 celler. Cellerne blev lyseret at ekstrahere total RNA for QRT-PCR blev data normaliseret med den for actin og de relative niveauer er vist (Actin = 1000). Bemærk p21 er et target-gen af ​​p53.

miR-34 restaurering ved transfektion af MiaPaCa2 celler med MIR-34 efterligner

For at undersøge virkningerne af miR-34 restaurering på kræft i bugspytkirtlen celler, vi transficeret de MiaPaCa2 cellerne med miR-34 efterligner eller ikke-specifik kontrol miRNA mimic (NC mimic). Western blot-analyse (figur 2

A

) viste, at transfektion af MIR-34 efterligner nedregulerede ekspression af målgener, Bcl-2, Notch1 og Notch2 på proteinniveauet, men havde ingen virkning på Bd-XL og Mcl -1 udtryk, der angiver målgenet knock-down af miR-34 efterligner påvirker udskrifter huser miR-34 målområder. miR-34a, miR-34b og miR-34c efterligner alle havde lignende aktiviteter. Figur 2

B

viser QRT-PCR-analyse af de potentielle target gener; miR-34 efterligner potent hæmmet

BCL2

Notch1

genekspression, i overensstemmelse med de Western blot data. De har også hæmmet udtryk for p21 (figur 2

B

), et andet mål af p53, men har begrænset effekt på Notch3 og cMET. Interessant nok blev den Notch2 udtryk hæmning på proteinniveauet ved miR-34 ikke ledsaget af hæmning på mRNA niveau efter aftale med tidligere rapporter, at miRNA hæmmer target genekspression post-transkriptionelt, med eller uden mRNA nedbrydning [11], [20 ].

En

, miR-34 restaurering nedregulerer målproteiner bcl-2, Notch1 og Notch2, ingen virkninger på Mcl-1. MiaPaCa2 celler blev transficeret med MIR-34 efterligner eller ikke-specifik kontrol miRNA mimic (NC mimic) (100 pmol per brønd i plader med 6 brønde ved Lipofectamine 2000) i 48 timer, derefter opsamlet for Western blot-analyse.

B

, Kvantitativ real-time PCR-analyse af de potentielle målgener ‘mRNA-niveauer efter miR-34 efterligner transfektion i MiaPaCa2 celler. **

P

0,01, ***

P

0,001, Students

t

-test, n = 2.

C

, bcl-2 3’UTR Luciferase Reporter Assay viser, at de transficerede mIR-34 efterligner er funktionelle. MiaPaCa2 celler blev co-transficeret med Bcl-2-3’UTR Luciferase Reporter eller dens mutant, b-gal vektor, sammen med enten MIR-34 efterligner eller NC mimic. Luciferase assay blev udført 24 timer efter transfektion under anvendelse af Bright-Glo Luciferase Assay System. Luciferaseaktivitet blev normaliseret i forhold til b-gal-aktivitet. Fejl bar indikerer s.e.m.

For at vurdere, om de transfekterede miR-34 efterligner er funktionelle, vi udført Bcl-2 3’UTR reporter assay, som vi for nylig beskrevet [6], [10]. De transficerede MIR-34 efterligner inhiberede luciferase reportergenekspression, som kontrolleres af Bcl-2 3’UTR i promotorregionen (figur 2

C

). Imidlertid mutation i Bcl-2 3’UTR komplementært til MIR-34 frø sekvens afskaffet denne virkning, hvilket indikerer, at den observerede aktivitet er sekvensspecifik. Resultaterne viser, at de transficerede MIR-34s er funktionelle og bekræfte, at Bcl-2 er et direkte mål for miR-34, i overensstemmelse med tidligere rapporter [8], [10], [21].

For at evaluere de langsigtede virkninger af miR-34 restaurering, vi også ansat en lentiviral system til at udtrykke miR-34a. Den felint immundefektvirus lentiviral systemet udtrykker MIR-34a (MIR-34a-MIF), eller vektorkontrol (MIF), blev anvendt til at inficere MiaPaCa2 og BxPC3 celler og den inficerede cellepopulation blev valgt via Zeocinresistens [6]. Figur S1 viser karakteriseringen af ​​udtryk ændringer i miR-34a-MIF celler. Western blot-analyse afslørede, at Bcl-2-protein blev nedreguleret i MIR-34a-MIF-celler sammenlignet med de MIF vektor kontrolceller (Figur S1

A

), i overensstemmelse med QRT-PCR-analyse af Bcl- 2 mRNA-niveau (figur S1

B

). Bcl-2 3’UTR Luciferase Reporter Assay viste, at miR-34a er funktionel i miR-34a-MIF-celler (Figur S1

C

).

miR-34 restaurering hæmmer MiaPaCa2 celle klonogene vækst og fører til caspase-3 aktivering og apoptose

Efter validering, at de transficerede miR-34 efterligner var funktionelle, vi foretaget en klongenicitetsassayet at undersøge virkningerne af miR-34 restaurering på cellevækst. Som vist i figur 3

A-B

, MIR-34 restaurering inhiberede signifikant klonogene cellevækst, med MIR-34a efterligne inducerende 80% inhibering af kolonidannelse i forhold til NC efterligner (18,3 ± 3,8 kolonier /såvel vs. 95,3 ± 1,8% kolonier /brønd). Lignende resultater blev observeret i de MIR-34a-MIF-celler der voksede langsommere end MIF kontrolceller, som angivet ved både betydeligt reduceret trypanblåt-eksklusive levedygtige celler i cellevæksten assay (figur S1

D

) og den reducerede koloni dannelse (figur S1

E

). Vi undersøgte også effekten af ​​hæmning af endogen miR-34 på cellevækst af mi

RIDIAN

miR-34-hæmmere. De er enkeltstrengede kemisk forbedrede oligonukleotider, der effektivt kan inhibere den endogene modne MIR-34. MIR-34 inhibitorer inducerede en stigning i klonogene vækst næsten 20% i forhold til kontrol (120,3 ± 2,9 kolonier /brønd vs. 95,3 ± 1,8 kolonier /brønd) (figur 3

A-B

). Vi foretog også en celle invasion assay i MiaPaCa2 celler med miR-34 restaurering af både miR-34a efterligner og miR-34a-MIF. MIR-34 inhiberede invasion potentiale MiaPaCa2 celler (figur S2) betydeligt. Vores resultater viser, at miR-34 er involveret i MiaPaCa2 cellevækst; MIR-34 restaurering hæmmer klonogene vækst, og inhibering af endogen MIR-34 ved MIR-34 inhibitorer fremmer væksten. Vore data er i overensstemmelse med de rapporterede tumorsuppressorfunktion af MIR-34 [6], [8], [9], [11], [22].

MiaPaCa2 celler blev transficeret med MIR-34 efterligner eller inhibitorer, 24 timer senere blev cellerne udsået i 6-brønds plader (200 celler /brønd, i triplikater). Efter 12-14 dages inkubation blev pladerne vaskes forsigtigt med PBS og farvet med 0,1% krystalviolet.

En

, repræsentative billeder af kolonierne.

B

, Kolonier med over 50 celler blev talt.

C

, Restaurering af miR-34 fører til caspase-3-aktivering. Caspase-3-aktivering assay blev udført som beskrevet i i

Materialer og fremgangsmåder

. Gange forøgelse af fluorescenssignalet blev beregnet ved at dividere det normaliserede signal i hver behandlet prøve med det i den ubehandlede kontrol. **

P

0,01, ***

P

0,001, Students

t

-test, n = 3.

D

, cellecyklusfordeling af MiaPaCa2 celler transficeret med mIR-34 efterligner. Cellecyklusanalyse blev udført 1 dag efter transfektion. Celler blev farvet med propidiumiodid efter ethanol fiksering og analyseret ved flowcytometri.

Eftersom p53 tumorsuppressorfunktion medieres delvist via induktion af apoptose [23], [24], undersøgte vi virkningen af mIR-34 restaurering på apoptose-induktion i MiaPaCa2 celler transficeret med mIR-34 efterligner. Som vist i figur 3

C

, forbigående transfektion af MIR-34 efterligner resulterede i signifikant forøget aktivering af caspase-3, en central angivelse af cellerne undergår apoptose [25]. Vi evaluerede også virkningen af ​​miR-34 efterligner på cellecyklus. miR-34 efterligner resulterede i signifikant G1 og G2 /M anholdelse og en reduktion af celler i S-fasen (Figur 3

D

), i overensstemmelse med andre rapporter om miR-34 restaurering i forskellige kræftmodeller [6], [7], [8], [10], [11], [21], [22], [26]. Denne effekt på cellecyklus svarer til den af ​​p53 genoprettelse som vi tidligere rapporteret [23], [24], [27], [28], hvilket indikerer, at MIR-34 restaurering kan udøve virkninger beslægtet med genoprettelse af p53 tumorsuppressorfunktion, i det mindste delvis, i cellerne med p53 tab af funktion.

mIR-34 restaurering sensibiliserer MiaPaCa2 celler til kemo- og stråleterapi

Dernæst undersøgte vi, om mIR-34 restaurering kunne sensibilisere bugspytkirtelkræftceller med et højt niveau af endogent Bcl-2-ekspression til kemo- og stråleterapi. WST-1-baserede cytotoksicitet assay blev anvendt som vi for nylig beskrevet [6], [18] til at evaluere cellernes respons på tre kemoterapeutiske midler, docetaxel, cisplatin og gemcitabin, som alle for tiden anvendes for kræft i bugspytkirtlen kemoterapi. Som vist i figur 4

A

, MIR-34 restaurering i MiaPaCa2 celler gjort cellerne 2-3 gange mere følsomme over for kemoterapeutiske midler, sammenlignet med vektoren kontrolceller, baseret på IC50 data. I apoptose analyser, miR-34a restaurering signifikant øget Gemcitabin eller stråling induceret caspase-3-aktivering (Figur 4

B

) og sub-G1 celler (Figur 4

C

). Vi har også gennemført klonogene assay, miR-34a efterligne sensibiliserede MiaPaCa2 celler til røntgenstråling, med en stråling enhancement ratio (ER) = 1,3 (Figur 4

D

). Vore data viser, at MIR-34 restaurering kan overvinde kemo /radioresistance af bugspytkirtelkræftceller, der har høje niveauer af Bcl-2 og lave basale niveauer af MIR-34s, og er afhængige af Bcl-2 for overlevelse og resistens over for behandling.

En

, miR-34 restaurering sensibiliserer cellerne til kemoterapeutiske midler. MTT-baserede cytotoksicitet assay blev udført under anvendelse af Zeocinresistente stabile MiaPaCa2-MIR-34a-MIF og MiaPaCa2-MIF-celler.

B

, miR-34 restaurering øger caspase-3-aktivering induceret af gemcitabin eller røntgenstråling i MiaPaCa2 celler. Relativ caspase-3-aktivering blev beregnet ved at normalisere fluorescenssignalet i hver behandlede prøve med den for NC mimic eller MIF kontrol som 100. *

P

0,05, ***

P

0,001, Students

t

-test, n = 3.

C

, miR-34 restaurering øger stråling-induceret apoptose i MiaPaCa-2 celler. Celler blev transficeret med MIR-34a efterligner eller NC mimic. 24 timer senere blev cellerne underkastet røntgenstråling. Cellerne blev opsamlet efter den anden 48 timer, farvet med propidiumiodid efter ethanol fiksering, og analyseret ved flowcytometri for% af cellerne i sub-G1-fasen. *

P

0,05, t-test, n = 2.

D

, miR-34 restaurering radiosensitized MiaPaCa-2 celler. Den klonogene assay blev udført som beskrevet i

Materialer og metoder

Data er vist som middelværdi +/- SD (n = 3).

CD44 + /CD133 + celler er tumorsphere-dannende og tumor-initierende celler med høj Bcl-2 og tab af miR-34 udtryk

for at undersøge den potentielle virkning af miR-34 restaurering på tumor-initierende celler i MiaPaCa2 cellelinje, vi først undersøgt tumor- initierende celle eller cancer stamcellepopulation i MiaPaCa2 celler med forskellige celleoverflademarkører. Både CD44 [29] og CD133 [19], [30] er blevet brugt som markører til at identificere de bugspytkirtelkræft stamceller fra humane tumorvæv. Der er imidlertid ingen rapport om cancer stamceller i MiaPaCa2 celler. Vi evaluerede CD44 og CD133 status i MiaPaCa2 celler ved immunfluorescensfarvning og FACS-sortering. Omkring 60% celler er CD44 + og 3-5% celler er CD133 +, dog kun 1-2% celler er CD44 + /CD133 + dobbelt-positive (Q2 i figur 5

A

). For at undersøge selvfornyelse potentiale af cellerne med forskellige overflade markør profiler, vi foretog den tumorsphere kultur af de sorterede celler i en særlig ultralav vedhæftet kultur plade med betinget medium for tumorsphere kultur [29]. Syv til ti dage senere, CD44 + /CD133 + dobbelt positive MiaPaCa2 celler voksede typiske tumorspheres men ikke de CD44- /CD133- dobbelt-negative celler, mens CD44 + /CD133- eller CD44- /CD133 + single-positive celler havde færre og mindre kugler (figur 5

B-C

). En repræsentativ tumorsphere fra CD44 + /CD133 + celler er vist i figur 5

B

(insertet). Vi gennemførte også en begrænsende fortynding tumor-initiering assay i nøgne mus under anvendelse af de sorterede celler, og data er opsummeret i tabel 1. CD44- /CD133- celler dannede ikke tumor, hvorimod 1 × 10

4 CD44 + /CD133 + -celler dannet tumor i 4 ud af 4 mus, 1 × 10

3 CD44 + /CD133 + celler dannet tumor i to ud af fire mus, og ingen tumor dannet med 1 × 10

2 celler. Således er vores data viser, at CD44 + /CD133 + dobbelt positive MiaPaCa2 celler beriget med tumor-initierende celler eller kræft stamceller /stamceller i stand til selv-fornyelse, men CD44- /CD133- dobbelt-negative population indeholder ikke sådanne celler. Vores resultater antyder også, at CD44 /CD133 er egnede markører for tumor-initierende celler i MiaPaCa2 cellelinje.

En

, CD44 og CD133 farvning af MiaPaCa2 celler. MiaPaCa2 celler blev farvet med anti-CD44-APC og anti-CD133-PE og sorteres ved FACS. Omkring 1-2% celler er CD44 + /CD133 + dobbelt-positive (Q2).

B-C

, Tumorsphere kultur af de sorterede celler. De sorterede celler blev udpladet for tumorsphere kultur som beskrevet i

Materialer og fremgangsmåder

. 7-10 dage senere blev tumorspheres talt (

B

). Indsatsen viser et repræsentativt tumorsphere fra CD44 + /CD133 + MiaPaCa2 celler.

C

. C-D.