PLoS ONE: Undertrykkelse af Cancer Progression af MGAT1 shRNA Knockdown

Abstrakt

Onkogen signalering fremmer tumor invasion og metastase, dels ved at øge ekspressionen af ​​tri- og tetra forgrenede N-glycaner. De forgrenede N-glycaner binder til galectins danner en multivalent gitter, der forbedrer celleoverflade hjemsted vækstfaktorreceptorer, og fokal adhæsion omsætning. N-acetylglucosaminyltransferase I (MGAT1), den første forgreningsenzymet i reaktionsvejen, er påkrævet for tilsætningen af ​​alle efterfølgende brancher. Her har vi introduceret MGAT1 shRNA i humane HeLa cervikale og PC-3-Yellow prostatatumorceller linjer, generere cellelinjer med reduceret transkript, enzymaktivitet og forgrenede N-glycaner på celleoverfladen. MGAT1 knockdown hæmmede HeLa celle migration og invasion, men ændrede ikke celledeling satser. Swainsonine, en inhibitor af α-mannosidase II umiddelbart nedstrøms for MGAT1, også hæmmede celleinvasion og var ikke additiv med MGAT1 shRNA, i overensstemmelse med en fælles virkningsmekanisme. Focal vedhæftning og microfilament organisation i MGAT1 knockdown celler også indikere en mindre motile fænotype.

In vivo

, MGAT1 knockdown i PC-3-Yellow ortotopisk prostatacancer xenograftmodel faldt betydeligt primær tumorvækst og forekomsten af ​​lungemetastaser. Vores resultater viser, at blokering af MGAT1 er et potentielt mål for anti-cancer terapi

Henvisning:. Beheshti Zavareh R, Sukhai MA, Hurren R, Gronda M, Wang X, Simpson CD, et al. (2012) Suppression of Cancer Progression af MGAT1 shRNA Knockdown. PLoS ONE 7 (9): e43721. doi: 10,1371 /journal.pone.0043721

Redaktør: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australien

Modtaget: Maj 4, 2012; Accepteret: 23, 2012; Udgivet: September 5, 2012 |

Copyright: © Beheshti Zavareh et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Research var støttet af tilskud fra den canadiske Institutes of Health Research (CIHR) (MOP-62.975) og Canada Research Chair (CRC) (950-202.079) til JWD og canadiske Institutes of Health Research (CIHR) til ADS, der er en CIHR kliniker Forsker og en leukæmi og lymfom Society Scholar i Clinical Research. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

metastatiske cancere har generelt en dårlig prognose, og vis begrænsede responser på kemoterapi og nyere målrettede behandlinger [1]. Den redundans i vækst receptorer og signalering bidrager til invasion og resistens, et problem, der måtte overvindes ved at overveje yderligere niveauer af feedback-regulering. I denne henseende receptorer er N-glycosyleret i ER og N-glycaner remodeled i Golgi på rute til cellerne overflade [2]. Oncogen transformation forøger Ets-drevet transskription af N-acetylglucosaminyltransferase V kodes af Mgat5, en medial Golgi enzym, der igangsætter β1,6GlcNAc antennen i tri- og tetra forgrenede N-glycaner [3] – [5]. Over-ekspression af Mgat5 i immortaliserede epitelceller er blevet vist at slappe kontroller vækst og fremme tumorogenesis når cellerne injiceres i mus [6]. Den onkogene inducerede ekspression af Mgat5 og dens β1,6GlcNAc tri- og tetra forgrenede N-glycaner produkter korrelerer med fjernmetastaser og nedsat overlevelse i humane mammae og coloncancerformer [7], [8]. Hos mus er tumorudvikling forsinket i polyoma-virus middle T transgene (PyMT) og PTEN

+/- modeller af cancer på et Mgat5 manglende baggrund [9], [10]. Desuden Golgi α-mannosidase II inhibitor swainsonine inhiberer tumorcellemetastase i musemodeller, og blev testet med lovende resultater i kliniske forsøg [11], [12].

Galectins binder til den N-glycaner på receptorer og opløste transportører med tilhørsforhold proportionalt med forgrening og antallet af N-glycaner (NXS /T bindingssteder) [13], [14]. Galectin-3 har vist sig at tværbinde glycoprotein receptorer på celleoverfladen, danner en dynamisk gitter, som bremser trafficking ind overtrukket-pit endosomer og caveolin-1 lipidklumper og derved fremme overflade hjemsted og følsomhed over for ligander [14], [15 ]. Det gitter er heterogene og har vist sig at regulere overflade tilbageholdelse af EGF, TGF-β og VEGF-receptorer [14], [16] samt GLUT-2, -4 glukosetransportører og TRPV5 Ca

++ kanal [13 ], [17], [18] (figur 1). Forgrenede N-glycaner også øge omsætningen af ​​Undergrunden og celle sammenvoksninger, støtter epitel-mesenkymale overgang (EMT) i kræftceller [19], [20]. Desuden Mgat5 transgen ekspression i musehud fremmer EMT-lignende fænotype og sårheling [21]. Mgat5

– /- PyMT-brysttumorceller i kultur viser reduceret overflade hjemsted cytokinreceptorer, som kan reddes af (i) Mgat5 re-ekspression, (ii) inhibering konstitutiv endocytose, (iii) udtømning af caveolin-1 og (iv) ved GlcNAc tilskud til UDP-GlcNAc den fælles donor for Mgat enzymer [13], [14]. GlcNAc tilskud i Mgat5

– /- celler øger indholdet af bi- og tri-antennære N-glycaner, der redder tilhørsforhold til galectin-3 uden Mgat5 produkt [13]. Dette tyder på redundans i N-glycan strukturer og profiler, der kan understøtte den maligne fænotype.

oligosaccharyltransferase (OST) erstatter NXS /T steder af proteiner i det barske endoplasmatiske reticulum (RER), overfører den formonterede glycan fra Glc

3Man

9GlcNAc

2-pp-dolichol til Asn. Glycoproteiner trafik til Golgi, hvor N-glycaner er ombygget, og de strukturelle detaljer afhænger enzymekspression og UDP-GIcNAc forsyning. De forgreningsenzymer Mgat1, Mgat2, Mgat4, og Mgat5 forskellige i Km-værdier for UDP-GIcNAc “D” og for glycoprotein acceptor “A”. Den vej har udviklet sig til sti ultrasensitivity til UDP-GlcNAc. De epitoper er afsluttet i trans-Golgi (lille boks) hvor effektiv substitution med Gal genererer LacNAc epitop, og kan forlænges med poly-LacNAc. Yderligere udvidelse med galactose genererer epitoper for galectin binding, med effekt på receptor dynamik, samspil og menneskehandel.

Mgat1 katalyserer tilføjelsen af ​​den første gren, og produktet er nødvendig for virkningen af ​​α-mannosidase II og Mgat2, og derefter Mgat4 og Mgat5 i en katalytisk ordnet pathway [2] (Figur 1). Lav Mgat1 aktivitet begrænser produktionen af ​​tri- og tetra-forgrenede slutprodukter, men høje niveauer kan også gøre det samme ved at berøve UDP-GlcNAc levering til Mgat4 og Mgat5 enzym senere i forløbet. Faktisk Mgat enzymer display faldende affinitet for UDP-GIcNAc, hvilket resulterer i pathway ultrasensitivity, med en karakteristisk S-formet produktion af Mgat5 produkter som svar på denne delte metabolit [13]. De hexosamin pathway substrater skærer grundlæggende stofskifte, som er kendt for at undergå omfattende ændringer i cancerceller [22]. UDP-GlcNAc syntese af hexosamin pathway afhænger glucose, glutamin og acetyl-CoA levering til hexosamin pathway, samt GlcNAc bjærgning. GlcNAc og GIcNAc-p kan være forhøjet på et mellemstadium i prostatakræft progression [23], og kan spille en rolle i at fremme tumor progression [24]. Derfor hæmme forgrening tidligt i forløbet kan være en levedygtig strategi for at undgå metabolisk kompensation.

For at begynde at udforske rollen som MGAT1, vi genererede humane tumorcellelinier stabilt udtrykker MGAT1 shRNA, og opnåede -70% undertrykkelse af forgrenet

N

-glycans og den invasive fænotype, uden at ændre spredning og levedygtighed i cellekultur. MGAT1 knockdown nedsat vækst og metastase af human prostatacancer-celler i en xenotransplantat ortotopisk musemodel. Selvom MGAT1 er nødvendig for mus udvikling ud over dagen E9.5 [25], [26], vores resultater tyder på, at en delvis systemisk udtømning af MGAT1 hos voksne kan være acceptable og har vigtige anti-cancer effekter.

Materialer og fremgangsmåder

Cellekultur

HeLa humane cervikale cancerceller (indkøbt fra ATCC) blev holdt i Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM). PC-3-celler (Yellow en meget metastatisk klon af PC-3 human prostatacancer-cellelinie stabilt udtrykker rødt fluorescerende protein (RFP) og grøn fluorescerende protein (GFP) som var en gave fra G. Glinsky, Ordway Research Institute, [27 ]) blev opretholdt i RPMI 1640. Alle celler blev suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Hyclone, Logan, UT), antibiotika, dyrket i et standard befugtet inkubator ved 37 ° C i en CO 5%

2 atmosfære.

L-PHA-binding til celleoverflade glycaner

celler blev podet i 96-brønds plader med 500 celler pr. Efter at klæbe natten over blev celler fikseret med 3,7% formaldehyd og vasket. Overflade tri- og tetra forgrenede

N

-glycans blev farvet med L-PHA (20 ug /ml) konjugeret til Alexa Fluor 488 eller Alexa Fluor 647 og kerner blev farvet med 5 ug /ml 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol, dilactate (DAPI, dilactate) (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Den samlede intensitet af L-PHA farvning på hver celle blev kvantificeret ved hjælp Cellomics ArrayScan II (Cellomics, Pittsburgh, PA) [13].

MGAT1 lyddæmpning af lentiviral-leveret RNA-interferens

Konstruktion af hårnål-pLKO.1 vektorer (der bærer en puromycin-antibiotikaresistensgen) indeholdende korte hårnål RNA (shRNA) sekvenser og produktion af shRNA virus er blevet beskrevet detaljeret [28]. De shRNAs rettet mod MGAT1 sekvenser er som følger:

MGAT1

-sh1 (NM_002406), 5′-CCCTGAGATCTCAAGAACGAT-3 ‘; og

MGAT1

-sh2 (NM_002406), 5′-GCACCTCAAGTTTATCAAGCT-3 ‘. Kontrolsekvenserne shRNA kodende sekvenser er som følger: RFP, 5’-CTACAAGACCGACATCAAGCT-3 ‘og LacZ, 5′-CCGTCATAGCGATAACGAGTT-3’. Lentivirale infektioner blev udført i det væsentlige som tidligere [28] beskrevne. Kort fortalt blev adhærente celler behandlet med 0,5 ml af virus efterfulgt af inkubation natten over (37 ° C, 5% CO

2) uden at fjerne virus. Den næste dag blev viralt medium udskiftet med frisk medium indeholdende puromycin (1 ug /ml) for at vælge en population af resistente celler.

Reverse-transkriptase realtids-PCR

Første cDNA blev syntetiseret fra 1 pg DNase-behandlede totalt cellulært RNA under anvendelse vilkårlige primere og SuperScript II revers transkriptase (Invitrogen) ifølge producentens protokol. Real-time PCR assays blev udført tre gange med 5 ng af RNA svarende cDNA, SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) og 400 nM af genspecifikke primere. Reaktioner blev behandlet og analyseret på en ABI 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Frem /tilbage PCR primerpar for menneskelige cDNA var som følger: menneskelig GlcNAc-TI: Forward 5’CGGAGCAGGCCAAGTTC-3 ‘, omvendt 5’CCTTGCCCGCAGTCCTA-3’, 18S: Fremad 5’AGG AAT TGA CGG AAG GGC AC- 3 ‘, omvendt 5′-GGA CAT CTA AGG GCA TCA CA-3’. Relativ mRNA-ekspression blev bestemt ved anvendelse af ΔΔCT fremgangsmåde som beskrevet.

GlcNAc-transferase-aktiviteter

enzymaktivitet MGAT1was målt med en syntetisk receptorer som beskrevet tidligere [29]. Kort fortalt blev cellelysater inkuberet med MGAT1 acceptor Manα (1,3) [Manα (1,6)] Glcβ1-O- (CH

2)

7CH

3 (Toronto Research Chemicals, Toronto, ON ), i en opløsning indeholdende 0,5 mM UDP- [6

3H] GlcNAc (44400 dpm /nmol), 125 mM MES (pH 6,5), 50 mM GlcNAc, 1 mM UDP-GlcNAc, 0,8 mM AMP og 10 mM MnCI2 . Efter inkubation blev reaktionen stoppet ved tilsætning af iskold H

2O. Overførsel af [6

3H] GIcNAc til acceptoren blev kvantificeret ved væskescintillationstælling.

Migration og invasion assays

invasion og migration assays i HeLa-celler blev udført som tidligere beskrevet [30 ]. Kort fortalt HeLa-celler (2 × 10

5) blev høstet og podet i ubestrøget invasion kamre til migration analyse eller i BioCoat Matrigel Invasion Chambers (BD Biosciences, Mississauga, ON) for invasion assays. For både migration og invasion assays, FBS vækst medium indeholdende 10% blev brugt som en chemoattractant i bunden godt. Efter 48 timers inkubation celler, der var migreret eller invaderet den nedre overflade af membranen blev farvet med Diff-Quik Stain (BD Biosciences). Antallet af migrerende eller invaderende celler blev afbildet og talt ved hjælp af Aperio ScanScope CS hele slide scanner (AperioTechnologies, Vista, CA) og Image-Pro Plus software (version 4.5; Media kybernetik Inc., Silversprings, MD). For at teste virkningen af ​​samtidig MGAT1 hæmning og swainsonine behandling blev HeLa-celler behandlet med 2 pM swainsonine i 72 timer før migration og invasion assay som beskrevet ovenfor.

For at vurdere invasion og migration i PC 3-Gule celler, celler serum frataget over natten og podet i det øverste kammer i 16-godt CIM-Plate (Roche Applied Sciences) for migration analyser eller Matrigel (BD Biosciences, Mississauga, ON) belagt plade til invasion assays. Det nedre kammer indeholdende 20% FBS som kemo-tiltrækningsstof, og pladerne blev anbragt i Roche xCELLigence Real-Time Cell Analyzer (RTCA) DP platform (Roche Applied Sciences). Real-time målinger blev foretaget hvert femte minut i 36 timer. Den RTCA Analyzer måler elektriske modstand af celler, der bevæger sig til den nedre overflade af membranen, og sammenligner godt med celle-tælling metode ovenfor.

Immuncytokemi

Celler blev podet på fibronectincoatede dækglas (Sigma-Aldrich, Oakville, ON). Efter at klæbe natten over blev cellerne fikseret med 2% paraformaldehyd i 10 minutter, efterfulgt af permeabilisering anvendelse af 0,2% Triton-X-100. Efter blokering med 5% BSA i 1 time blev cellerne inkuberet natten over ved 4 ° C med muse-anti-β1 integrin (1:200, Millipore) eller anti-phospho-paxillin (pY31) antistof (1:400, Epitomics). Dækglas blev vasket med PBS og derefter inkuberet med æsel-anti-muse-IgG-Cy3 konjugeret sekundært antistof (1:200, Millipore) for β1 integrin eller anti-kanin IgG-FITC-konjugeret antistof (1:500, Millipore) for paxillin. Farvning for actin blev gjort ved phalloidin konjugeret til tetramethylrhodamin B isothiocyanat (TRITC, Sigma-Aldrich) i 10 minutter. Efter vask med PBS blev dækglas monteret på objektglas under anvendelse af fluorescerende monteringsmedium og afbildes ved hjælp af 40 x linse Zeiss LSM700 konfokalt mikroskop (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Jena, Tyskland).

In vivo-model af prostata cancer metastaser

Distant tumordannelse blev evalueret

in vivo

som beskrevet tidligere [31]. Kort fortalt, PC-3-Gule celler stabilt udtrykker RFP med og uden MGAT1 knockdown, blev injiceret orthotopisk i prostata af subletalt bestrålede (3,5 Gy) SCID-mus. Mus injiceret med tumorceller blev opretholdt i 4 uger efter injektion, på hvilket tidspunkt blev dyrene aflivet via cervikal dislokation for komplet behandling. Røde fluorescerende tumorer blev detekteret via hele kroppen billedbehandling og helorgan billeddannelse under anvendelse af et Leica MZ FLIII fluorescerende stereomikroskop med en 100 W kviksølvlampe, en 560/40 excitationsfilter og et 610 lang-pass emission filter. Billeder er erhvervet ved hjælp af et Olympus DP70 digitalkamera ved 0,8 × forstørrelse og analyseret ved hjælp af Image Pro Plus 6,0 (Media Cybernetics). En enkelt fælles tærskel blev påført for at identificere og måle fluorescens i hvert organ som antallet af fluorescerende pletter pr lungelap. Mus blev opnået med en in-house avlsprogram og huse i laminar flow bur stativer under standardiserede miljøforhold med

ad libitum

adgang til mad og vand. Alle forsøg blev godkendt af den lokale institutionelle etik Review Board (University Health Network-Ontario Cancer Institute Animal Care og brug udvalg) og blev udført i henhold til reglerne i den canadiske Rådet om Animal Care. blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

Resultater og Diskussion

MGAT1 shRNAi reducerer N-glycan forgrening, celle migration og invasion

For at vurdere celle autonome virkninger af MGAT1 udtømning på malign cellevækst og invasion, blev HeLa humane cervikale cancerceller inficeret med lentivirus shRNA targeting vektorer MGAT1 eller kontrolsekvenser, og stabile cellepopulationer blev selekteret med puromycin. Target knockdown anvendelse af to uafhængige shRNA sekvenser blev bekræftet ved QRT-PCR (figur 2A). shRNA1 og shRNA2 også reduceret MGAT1 enzymatisk aktivitet og reduceret L-PHA-celle-overflade-farvning i forhold til nedbrydning af mRNA og enzymaktivitet (figur 2B, C). L-PHA binder sig til produkter ned-strøm af MGAT1, den β1,6GlcNAc tri- og tetra forgrenet N-glycaner [32]. MGAT1 knockdown ændrede ikke cellernes levedygtighed eller proliferation (figur 2D og data ikke vist).

A) HeLa-celler blev inficeret med lentivirusvektorer målretning MGAT1 (shRNA1 eller shRNA2) eller kontrol shRNA sekvenser. Stabile cellepopulationer blev udvalgt ved tilsætning af puromycin (1 ug /ml). A) MGAT1 mRNA blev målt ved QRT-PCR, B) MGAT1 enzymaktivitet, C) L-PHA reaktiv overflade N-glycaner efter Array scanning mikroskop, D) Spredning over 4 dage Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SD relative ekspression af mRNA i forhold til kontrol sekvens (n ​​= 3 uafhængige forsøg udført tredobbelt).

for at vurdere virkningerne af MGAT1 shRNA2 knockdown på HeLa celle migration og invasion, blev cellerne podet i kamre på porøse filtre i serum-frit medium, og 10% FBS blev anbragt i det nedre kammer som kemo-tiltrækningsstof. Cellemigrering ind i bunden kammer blev målt 48 timer senere. Lignende undersøgelser blev udført ved anvendelse Matrigelcoatede filtre til at måle celleinvasion selvom en barriere. Knockdown af MGAT1 faldt cellemigrering og invasion, i forhold til MGAT1 depletion (figur 3A, 3B). Blokering reaktionsvejen et trin nedstrøms for MGAT1, ved α-mannosidase II, under anvendelse swainsonine også inhiberede invasion som tidligere rapporteret [33], [34]. Swainsonine behandling alene hæmmede migration og invasion, men i mindre grad end shRNA2. Dette kan skyldes den paralog α-mannosidase IIx, som er mindre følsom over for swainsonine. Vigtigere, swainsonine havde ingen yderligere virkninger i MGAT1 shRNA2 celler, hvilket tyder på, at optimal undertrykkelse af migration og invasion ved at målrette forgreningen vej observeres med -70% udtømning af MGAT1 (figur 3C, 3D).

A) HeLa celler blev udpladet i kamre med 8-um porer og 10% FBS blev anvendt som en kemoattraktant. B) HeLa-celler blev udpladet i invasion kamre med Matrigel. Efter 48 timer blev celler, der var migreret gennem porerne fikseret, farvet og talt automatisk. C) migration og D) invasion analyser med eller uden forbehandling i 72 h med 2 pM swainsonine (SW) i 72 timer før. Det gennemsnitlige antal af migrerede celler ± SD af 3 uafhængige forsøg udført tredobbelt blev afbildet. (E) Cell morfologi ved farvning med phospho-paxillin og TRITC-konjugeret phalloidin for F-actin, vist som en fusioneret billede.

Cell migration satser er delvist afhængige af a5p1 integrin receptor kontakter med substrat fibronektin , som stimulerer fokale sammenvoksninger signalering, omsætning og fremdrift [35]. De forgrenede N-glycaner produkter af MGAT5 er til stede på α5β1, blandt andre receptorer og celleoverfladeproteiner, og er blevet vist at fremme α5β1 aktivering, signalering, og tumorcellemigration [19]. Integrinaktivering resulterer i phosphorylering af paxillin af FAK og Src, hvilket fører til F-actin remodellering og cellemotilitet [36]. I HeLa celler med MGAT1 knockdown, F-aktin stress fibre var mindre i diameter, mindre konvergent på celle fremskrivninger, og en tendens til at afgrænse cellen (figur 3E). Farvning af p-paxillin afslørede mindre og flere klynger på kanten af ​​cellulære fremskrivninger. I modsætning hertil kontrol HeLa-celler havde fremtrædende og lange stress fibre, der rager ind pseudopodia slutter med større phospho-paxillin farvende fokale adhæsioner, karakteristisk for et mere motile fænotype end MGAT1 knockdown celler.

MGAT1 knockdown nedsætter tumorvækst og metastaser

in vivo

for at vurdere virkningerne af MGAT1 knockdown i en dyremodel for kræft metastase, vi brugte de menneskelige pc-3-Gul prostatacancerceller, en veletableret xenograftmodel. PC-3-Gul-celler blev inficeret med lentivirus indeholdende MGAT1 shRNA2 eller kontrolsekvenser, og stabile cellepopulationer blev selekteret som ovenfor. MGAT1 mRNA, enzymatisk aktivitet, og celleoverflade forgrening blev alle udtømt ved -70% (figur 4A-C). MGAT1 knockdown faldet både cellevandring og celleinvasion i et in vitro og in vivo-model (figur 4D, E). MGAT1 knockdown ændrede ikke væksten og levedygtigheden af ​​PC-3-Gul celler (data ikke vist). Således

in vitro

fænotyper var bemærkelsesværdigt lig virkningerne af MGAT1 knockdown i HeLa-celler. For at vurdere virkningerne af MGAT1 knockdown på tumormetastase, kontrol eller MGAT1 knockdown PC-3-Yellow prostatacancerceller blev injiceret orthotopisk i prostata kirtler i sub-letalt bestrålede SCID-mus (n = 15 pr gruppe). Fire uger efter injektion blev musene aflivet, og fjern tumordannelse i organerne blev afbildet af fluorescensmikroskopi. Tumorer, der udvikles i prostata i alle mus injiceret med MGAT1 knockdown og kontrol RFP-mærkede PC-3-Gule celler. I mus injiceret med kontrolceller blev tumordannelse detekteret ved klinisk relevante metastaselokalisationer, herunder lunge, lymfeknuder og lever. Imidlertid blev tumorer volumen reduceres, og færre fjernt lungemetastaser blev observeret i mus injiceret med MGAT1 knockdown celler (figur 4F, G). Samlet set mere af musene i MGAT1 knockdown gruppe var fri for metastaser. Således tilsammen MGAT1 knockdown hæmmer fjernt tumordannelse

in vivo

.

PC-3-Gule celler med MGAT1-shRNA2 eller kontrol shRNA sekvenser blev vurderet for A) MGAT1 mRNA-niveauer ved QRT-PCR. B) MGAT1 enzymaktivitet, C) L-PHA reaktiv overflade N-glycaner ved Arrayscan mikroskop, D) invasion gennem en Matrigel barriere og migration (E) ved hjælp af xCELLigence Real-Time Cell Analyzer. Data repræsenterer gennemsnit ± SD celle indeks (3 uafhængige eksperimenter med firdobbelte). (F) Tumor størrelse og (G) metastaser i mus injiceret med PC-3-Gul celler med MGAT1-shRNA2 eller kontrol- shRNA sekvenser. Musene blev injiceret orthotopisk, med 0,5 × 10

6 celle pr mus, ind i prostata af sub-letalt bestrålede SCID-mus. Fire uger efter injektion blev musene aflivet, og deres organer blev afbildet under anvendelse af et fluorescensmikroskop. Antallet af metastatiske knuder i alle fem kamre af lungerne blev kvantificeret under anvendelse af billedanalysesoftware. Hvert punkt repræsenterer en mus.

Sammenfattende -70% MGAT1 knockdown undertrykke N-glycan forgrening og den invasive fænotype i HeLa og PC-3-Gul celler. Vigtigere er det, MGAT1 knockdown nedsat vækst og metastase af pc-3-Gul celler i en ortotopisk prostatakræft xenograftmodel. Hver af de N-glycan grene er en epitop for galectins, og kumulativt de kan støtte væksten signalering ved celleoverfladen. Kompensation og redning af galectin gitter af epitop overførsel mellem afdelinger er blevet observeret i Mgat5

– /- kræftceller [13], og i Mgat4

– /- mus væv [37]. Onkogen signalering i cancerceller opregulerer transskription og aktiviteter MGAT4 og Mgat5 [4], [5], [38] samt hexosamin pathway mellemprodukter [23], men målrette MGAT1 undgår disse mekanismer redning. Derfor kan MGAT1 være nyttige mål i kræftbehandlingen at blokere metastaser samt tumorvækst.