PLoS ONE: Den Hæmning af KCa3.1 Kanaler Aktivitet Reducerer Cell motilitet i glioblastoma Afledt Cancer Stem Cells

Abstrakt

I den foreliggende undersøgelse, vi evaluerede udtryk for den mellemliggende ledningsevne calcium-aktiverede kalium (KCa3.1 ) kanal i humane glioblastom stamceller-lignende celler (CSCS) og undersøgt dens rolle i cellemotilitet. Mens KCa3.1 kanalen ikke udtrykkes i neuronal- og gliale-afledte væv af sunde individer, både KCa3.1 mRNA og protein er til stede i glioblastomtumor befolkning, og er signifikant forøget i CSCS afledt fra både etableret cellelinie U87MG og en primær cellelinie, FCN9. I overensstemmelse med disse data blev spændingsafhængige uafhængig og sporvogn-34 følsom kaliumstrømme tilskrives KCa3.1 kanal optaget i den murine GL261 cellelinie og flere primære humane glioblastom cellelinjer. Desuden var der en signifikant højere KCa3.1 strøm registreres i U87MG-CD133-positive celler i sammenligning med U87MG-CD133 negative subpopulation. Endvidere fandt vi, at tumorcellemotilitet er stærkt forbundet med KCa3.1 kanal ekspression. Blokade af KCa3.1 kanalen med den specifikke inhibitor TRAM-34 faktisk har en større indvirkning på motilitet CSCS (reduktion på 75%), som udtrykker et højt niveau af KCa3.1 kanal, end på FCN9 parentale befolkning ( reduktion på 32%), hvor KCa3.1 kanal udtrykkes på lavere niveau. Lignende resultater blev også observeret med CSCS afledt af U87MG. Fordi invasion af omgivende væv er en af ​​de vigtigste årsager til behandlingssvigt i glioblastom, kan disse resultater være relevante for den fremtidige udvikling af nye cancer terapeutiske lægemidler

Henvisning:. Ruggieri P, Mangino G, Fioretti B, Catacuzzeno L , Puca R, Ponti D, et al. (2012) Inhiberingen af ​​KCa3.1 Kanaler Aktivitet Reducerer cellemotilitet i glioblastoma arvet cancerstamceller. PLoS ONE 7 (10): e47825. doi: 10,1371 /journal.pone.0047825

Redaktør: Massimo Avoli, McGill University, Canada

Modtaget: 30. maj 2012; Accepteret: September 17, 2012; Udgivet: 22 oktober, 2012 |

Copyright: © Ruggieri et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Fondazione Cassa di Risparmio, Perugia (FF) og fra COFIN-MIUR (Ministero dell’Università e della Ricerca Scientifica) 812,111, 2007 (AC). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

glioblastoma multiforme (GBM) er den mest almindelige maligne centralnervesystemet (CNS) tumor hos voksne, og den mest vanskelige at helbrede trods for fremskridt inden for kirurgi og adjuverende behandling [1]. Det repræsenterer 30 til 60% af CNS primære tumorer, med en forekomst på 2 til 3 sager pr 100 000 personer om året [2], [3]. Kun 30% af GBM patienterne lever længere end et år efter diagnosen, og den gennemsnitlige levealder er stadig ca. 14-18 måneder [4], [5]. Den dårlig prognose for GBM patienter er ikke væsentligt forbedret i de seneste årtier, hovedsagelig på grund af de vanskeligheder og udfordringer i at opdage og behandle denne dødbringende kræft.

Flere egenskaber for kræft, herunder glioblastom, er påvirket af fejlagtig regulering af ion kanal ekspression eller funktion [6] – [8]. Reduceret udtryk for aktiv ensretter K-kanaler [9], og øget ekspression af amilorid-følsomme Na-kanaler [10], spænding-aktiverede Cl-kanaler [11], og BK-kanaler [12] er blevet rapporteret i flere gliomer, sammenlignet med normale astrocytter. KCa3.1 kanal udtryk kan også dereguleret i glioblastom. The KCa3.1 kanal, også kendt som IK1, SK4, KCNN4, IKCa er medlem af calcium-aktiverede kalium (KCA) kanal familie, med en ensartet konduktans på 20-60 pS i symmetrisk 150 ns [13], [14 ]. Det adskiller sig fra de funktionelt relaterede calcium-aktiverede kaliumkanaler af større (100-200 pS; BK) og mindre (2-20 pS; SK) enhedsstat konduktans af dets farmakologi, biofysik og fysiologi [13], [14]. Alle tre familiemedlemmer KCA kanaler blev vist ved Sontheimer gruppe, der skal transkriberes i gliomceller, selv om kun BK-kanaler var funktionelle i tumoren, og deres inhibering stærkt påvirket cellemigration in vitro [15]. For nylig vores gruppe rapporterede den funktionelle ekspression af KCa3.1 kanal i glioblastom cellelinier og viste, at disse kanaler have dybtgående virkninger i fremme cellemigration som vist ved transwell migration assay i nærværelse af specifikke KCa3.1 kanal blokkere [16]. Efterfølgende blev udtryk og funktionelle aktivitet af KCa3.1 kanalen fast etableret i to gliom cellelinjer og i celler fra en primær kultur [17].

De seneste oplysninger tyder på, at glioblastomer stammer fra en pulje af stem- lignende celler, der deler egenskaber til fælles med neuronale stamceller. Stemness adfærd og migrerende evne er tæt forbundet og reguleret af fælles signalveje [18]. Baseret på disse data, vi satte os for at undersøge, om de KCa3.1 kanaler er involveret i vandrende proces med stamceller-lignende celler isoleret fra tumor afledt primære og permanente cellelinier. Vi fandt en markant udtryk for aktivt funktionelle KCa3.1 kanaler i berigede fraktion af celler med stamceller-lignende egenskaber, og at deres selektive blokering dramatisk hæmmet cellulære motilitet.

Resultater

Funktionel KCa3.1 Kanaler Udtrykt i U87MG og GL261 cellelinier

for at bestemme indholdet af KCa3.1 mRNA i glioblastom kræftceller, vi målte deres udtryk af Real-time PCR på to godt karakteriserede cellelinjer, mennesket U87MG og det murine GL261.

KCa3.1

mRNA er tydeligt påvist i begge cellelinier og udtrykkes ved højere niveauer i forhold til humane og murine normale astrocytter. Deres niveauer var 118.47 ± 14,6 gange højere i U87MG og 76,13 ± 16,52 i GL261 celler (data ikke vist). Western blot analyse af hel-cellelysater, udført for at vurdere proteinekspression, viste et bånd på ~48 kDa i begge cellelinier co-migrerer med den positive kontrol, som den specifikke antistof producent (figur 1A). Mængden af ​​KCa3.1 protein påvist i U87MG tydeligt højere sammenlignet med den observeret fra GL261 cellelinie. Optisk densitet (OD) målinger af band intensitet, efter normalisering, anslog KCa3.1 niveau i U87MG at være omkring 4 gange højere end i GL261. Vi evaluerede også frekvensen af ​​positive celler i de to cellelinier ved cytometrisk analyse (figur 1B, C). Procentdelen af ​​KCa3.1 positive celler var 72,66% i U87MG cellelinie og 37,51% i GL261 cellelinie. Disse frekvenser er relativt høje sammenlignet med den for KCa3.1 positive celler (2,82%) fundet i muse normale voksne astrocytter taget under kontrolceller (figur 1D).

(A) Immunoblotanalyse af U87MG og GL261 viste et udtryk for KCa3.1 kanaler korrelerede til transkriptniveauer. (B) (C) cytofluorimetrisk analyse af KCa3.1 på U87MG, GL261 og mus normale voksne astrocytter (NMA). Celler blev inkuberet med anti-KCa3.1 efterfulgt af AlexaFluor488-konjugeret gede-anti-kanin antistof som rapporteret i afsnittet Materialer og metoder. Ti tusind hændelser blev registreret og analyseret med Cyflogic. Grå histogrammer: cellulær autofluorescens; sorte histogrammer: AlexaFluor488-konjugeret gede-anti-kanin alene; grønne histogrammer: anti-KCa3.1 (D) Typisk tidsforløbet for KCa3.1 strøm fra en GL261 celle, optaget fra IV kurver ved 0 mV, i kontrol betingelser efter anvendelse af DC-EBIO (100 uM) + ionomycin ( 500 nM), og efter anvendelse af 3 uM TRAM-34 i den stadige tilstedeværelse af DC-EBIO + ionomycin. Spænding ramper blev påført hver 5 s. Fyldte cirkler er datapunkter umiddelbart opnået før IV kurver vist i panelet E. (E) Repræsentant IV kurver opnået ved at anvende spænding ramper fra -100 til +50 mV fra en bedrift potentiale 0 mV, i kontrol betingelser (CTRL), efter anvendelsen af ​​DC-EBIO + ionomycin, og efter tilsætning af TRAM-34 i den stadige tilstedeværelse af DC-EBIO + ionomycin. (F) Mean KCa3.1 strømtæthed målt i mus NMA, som kontrol, i GL261 og U87MG glioblastoma-cellelinier ved 0 mV, vurderes som forskellen mellem spidsværdien strømtæthed i DC-EBIO + ionomycin, og den resterende strøm efter tilsætningen af TRAM-34 (jf fyldte cirkler i panelet D).

den funktionelle udtryk KCa3.1 kanaler i U87MG og GL261 glioblastomaceller blev verificeret med patch-clamp målinger i hel-celle perforeret konfiguration. TEA (3 mM) og octanole (1 mM) var til stede i alle opløsninger til at blokere BK og gap forbindelsesepitoper kanaler, normalt co-udtrykkes med KCa3.1 kanaler i glioblastomceller (se Methods, [16]). Et typisk eksperiment illustrerer den anvendte protokol til at vurdere KCa3.1 strøm er vist i fig 1 E og F. Celler blev gentagne gange stimuleret med spænding ramper fra -100 til +50 mV fra et holdepotentiale på 0 mV, og KCa3.1 nuværende blev vurderet ved først at påføre den KCa3.1 /SK kanal aktivator DC-EBIO (100 uM) plus ionomycin (500 nM; DC-EBIO + ionomycin), og derefter tilsætte den specifikke KCa3.1 kanal inhibitor TRAM-34 (3 uM) i den fortsatte tilstedeværelse af DC-EBIO + ionomycin. I begge cellelinier, efter den ekstracellulære perfusion med DC-EBIO + ionomycin, observerede vi udviklingen af ​​en spænding-uafhængig strøm med en reversible potentiale (gennemsnit -85 ± 3 mV for GL261 celler, n = 3, og -82 ± 4 for U87MG celler, n = 4) tæt på K ligevægt potentiale i vores optageforholdene (-90 mV). DC-EBIO + ionomycin-induceret strøm havde i de fleste celler en indledende forbigående fase forud for en vedvarende plateau. Både forbigående og vedvarende komponenter kunne faktisk tilskrives KCa3.1 strøm, da de aldrig blev observeret ved anvendelse af DC-EBIO + ionomycin i TRAM-34-præinkuberede celler. Den gennemsnitlige KCa3.1 strømtæthed af U87MG og GL261 celler (forbigående plus vedholdende, vurderet ved 0 mV) var 16,2 ± 5,0, n = 18, og 11,5 ± 3,9, n = 7, henholdsvis. I modsætning hertil blev der ikke observeret nogen DCEBIO + lonomycin-aktiverede TRAM-34 følsom strøm i normale mus voksne astrocytter (n = 7) (figur 1G).

Induktion af Neurosfærer og CD133 er Efterfulgt af Stimulering af KCa3.1 kanaler Expression, i U87MG Cell Linje

Vi næste forsøgt at undersøge udtryk og funktion KCa3.1 kanaler U87MG celler dyrket i stamcelle eftergivende medium. Celle conditioning blev vurderet med optisk mikroskopi og cytofluorimetri ved at verificere forekomsten af ​​neurosfærer og CD133

+ -celler, som blev overvåget op til tre uger efter (figur 2A, B, C). CD133 er en markør for de fleste tumor stamceller-lignende celler, især i hjernetumorer [19]. CD133

+ -celler kumuleres til højst 6,3% (figur 2D) efter 10 dages konditionering (U87MG-NS), og de var stadig positive efter 16 dage (4,6%, data ikke vist).

(A) fase mikroskopi billede viser U87MG celler subkonfluent og U87MG-afledte neurosfære efter 7 (B) og 14 dage (C) af serum frie medium condition. (D) cytofluorimetrisk analyse af CD133 på U87MG og U87MG-NS. Celler blev farvet med PE-konjugeret anti-CD133 (1) eller histotype matchede antistoffer som beskrevet i Materialer og metoder sektion. Ti tusind hændelser blev registreret og analyseret med Cyflogic. Grå histogram: cellulær autofluorescens; sort histogram: isotypekontrol; appelsin histogram: anti-CD133 (1) (E) Immunoblotanalyse af U87MG og U87MG-NS viste et udtryk for KCa3.1 kanaler korrelerede til transkriptniveauer. (F) Fasekontrast (øverst) og immunofluorescens (bund) billeder af mekanisk dissocierede U87MG-NS-celler efter 30 minutters inkubation med anti-CD133-antistof, der viser CD133

+ og CD133

– celler (angivet med tyk og tynde pile, henholdsvis). (G) Bar plot viser de gennemsnitlige KCa3.1 strømtæthed målt en 0 mV i CD133

+ og CD133

– U87MG-NS celler. Eksperimenter blev udført som beskrevet i teksten i figur 1D-F. * ANOVA test, p. 0,05

For at verificere de stamceller-lignende egenskaber af U87MG-NS vi udførte Real-time PCR til at undersøge ekspressionen af ​​

nestin

GFAP.

Ændringer i ekspressionen af ​​

nestin

, en markør for neurale stamceller, og

GFAP

, en markør for differentierede astrocytter, er tegn på differentiering

i vitro

af stilk-lignende celle afledt af glioblastom [1]. Sammenlignet med ubehandlet U87MG,

nestin

udtryk blev øget 2,68 ± 0,56 gange (p 0,001), mens

GFAP

blev fundet at falde (0,516 ± 0,05, p 0,05). Disse resultater blev bekræftet ved immunfluorescensfarvning af U87MG og U87MG-NS med antistoffer mod CD133, GFAP, og nestin (se Supplerende data).

Vi undersøgte derefter KCa3.1 kanal ekspression i U87MG-NS. Ekspressionen af ​​

KCa3.1

mRNA var 2,02 ± 0,10 gange højere end i de ubehandlede celler (p 0,001). Også mængden af ​​KCa3.1 protein påvist i U87MG-NS er højere end i U87MG (OD-forholdet er 1,8), som forventet ud fra de høje mRNA-niveauer (figur 2E). Den elektrofysiologisk analyse udført på CD133

+ -celler afledt af U87MG-NS viste også den højere aktivitet af kanalerne i disse celler. Specifikt udførte vi patch-clamp målinger på enten CD133 negative eller positive celler, efter farvning med anti-CD133-antistoffer ved immunfluorescens (fig 2F). Som vist i figur 2G, begge celler vises KCa3.1 strømme, som vurderet ved anvendelse af standard protokol i helcelle-konfiguration. Især blev CD133

+ celler fundet at udtrykke et væsentligt højere niveau af KCa3.1 strømtæthed (21,3 ± 3,7 pA /pF, n = 7, vs 8,1 ± 3,5 pA /pF, n = 5, henholdsvis; p 0,05).

den delmængde af CD133

+ U87MG celler udtrykker højere niveauer af

KCa3.1

mRNA

Siden i fokus for vores studier er

KCa3.1

kanal udtryk i hjernen tumorceller med stamceller-lignende egenskaber, vi så instrueret vores undersøgelse mod CD133

+ subpopulationer fraktioneret fra U87MG-NS. Brug cellesortering vi har fået celle fraktioner med op til 32% af CD133

+ celler (figur 3), og med et niveau af

CD133

udskrifter mere end 11 gange højere (11,63 ± 3,23, p 0,001 ).

KCa3.1

mRNA niveau i CD133-berigede fraktioner, også analyseret af Real-time PCR, var omkring 4 gange højere (3,99 ± 0,195, p 0,05). End i CD133-udtømte delmængder

cytofluorimetrisk analyse af konditioneret U87MG-NS blev udført ved farvning af celler med PE-konjugeret anti-CD133-antistof som rapporteret i Materiale og metoder sektion. Procentdel af CD133

+ celler før (venstre panel) og efter sortering procedure (højre panel) er vist med rødt. Ti tusind hændelser blev erhvervet og analyseret under anvendelse af FACS DiVa software.

Den KCa3.1 Specific Inhibitor TRAM-34 Reducerer motilitet af U87 MG-NS

Vi har tidligere vist, at graduering af ionstrømme gennem membranfiltre kanaler er afgørende for stimuleringen af ​​glioblastoma cellemotilitet. Da TRAM-34 selektivt hæmmer ion strøm gennem KCa3.1 kanaler, vi testede den hypotese, at forringe ion strøm med TRAM-34 ville have en effekt på

in vitro

motilitet U87MG-NS (vurderet af fibronectin- overtrukne transwell assays). Som vist i figur 4A fandt vi, at TRAM-34 i en koncentration på 1 og 3 uM inhiberede motilitet med 49,5% ± 21,52 (n = 10, p 0,001), og 65,4% ± 27.46, (n = 10, p 0,001 ), er henholdsvis.

(A) Kvantitativ analyse af celleinvasion med fibronectin-coatede Boyden kammer assay beskrevet i Materialer og metoder sektion. Forskellige koncentrationer af TRAM-34 (1 og 3 uM) inhiberede cellulær motilitet på en dosis-afhængig måde. Inhibering var statistisk signifikant sammenlignet med ubehandlede celler (*** p 0,001). Søjlerne er gennemsnit ± SD. (B, C, D) Repræsentative mikroskopiske felter af U87MG-NS glioblastom stamceller-lignende celler, der er migreret i 48 timer gennem en 8 um porestørrelse i fravær (B) og i nærvær af 1 uM (C) og 3 iM (D) TRAM-34.

KCa3.1 Kanaler er Ingen i voksne sund hjerne og lillehjernen, men stærkt udtrykt i glioblastomtumor prøver og Afledt Primære cellelinier

For at bestemme om vores resultater kan være relevante for studiet af hjernetumorer, vi udvidet vores undersøgelser til KCa3.1 kanal udtryk for normale menneskelige astrocytter (NHA), paraffinindstøbte snit fra humane gliale tumorer, og tre humane primære glioblastom cellelinjer (CRL8 , FCN9 og MZC12). Niveauerne af KCa3.1 udtryk i høj grad afveg blandt de undersøgte prøver. Den gennemsnitlige gange ændring i forhold til NHA var 318,9 ± 21,13 for CRL8, 176 ± 34.64 (FCN9) og 57,6 ± 2,4 (MZC12) (p 0,001) i de tre primære cellelinjer (figur 5A). Immunohistokemisk farvning viste, at KCa3.1 kanaler var fraværende i normal hvid substans hjerne, bortset endotelceller i blodkar (figur 5B), hvorimod de blev højt udtrykt i sektioner fra tre forskellige tumorer (figur 5C, D, E). En klasse I astrocytoma er vist i figur 5F med KCa3.1 positiv farvning begrænset til områder beriget med nye blodkar. I fig 5G et vævssnit fra normal lunge er vist som positiv kontrol

(A) Real-time PCR på tre primære humane cellelinier af glioblastomer (CRL8, bane 1;. FCN9, bane 2, MZC12, lane 3) viste, at KCa3.1 transkripter ekspression er højere sammenlignet med NHA (bane 4). (B-G) Immunohistokemisk farvning på normalt humant hjernevæv afslørede KCa3.1 protein tilstedeværelse kun i endotelceller i blodkar (B), mens vi observeret en diffus farvning i højkvalitets tumorer (CRL8, C, FCN9, D, MZC12, E ) og et KCa3.1 signal kun i neovaskularisering område (glio lav kvalitet, F). Som positiv kontrol anvendte vi fysiologisk lungevæv (G). (H) Typisk tidsforløbet for nuværende registreret ved -40 mV fra et FCN9 celle ved at påføre gentagne (hver 5s) spænding ramper fra -100 til +100 mV. 3 mM TEA og 1 mM octanole blev tilsat til blokere BK og gap junktionel kanal henholdsvis normalt co-udtrykkes med KCa3.1 kanaler i glioblastomceller (21; 22). DC-EBIO (100 uM) + ionomycin (0,5 uM) og DC-EBIO + ion +3 uM TRAM-34 blev påført i rækkefølge for at verificere den funktionelle ekspression af KCa3.1 strømme (jf tekst). (I) Repræsentant I-V relationer i tilstedeværelse af DC-EBIO + ionomycin, og DC-EBIO + ionomycin + TRAM-34. Data i panel (H) og (I) er fra samme eksperiment.

Indsat

: I-V forholdet mellem KCa3.1 strøm opnås ved at trække de nuværende ramper optaget i DC-EBIO + ion + TRAM-34 fra det optaget i DC-EBIO + ion. (L) Plot rapportere KCa3.1 strømtæthed ved 0 mV (vurderet som i panel I) målt i de tre primære glioblastomcellelinier. Eftersom der i flere celler en spændingsstyret K strøm aktivering ved membranpotentialer højere end -20 mV var til stede, i disse tilfælde målinger af KCa3.1 strømtæthed blev udført ved -40 mV, og den vurderede strømtæthed blev derefter ekstrapoleret ved 0 MV ved at antage en lineær strøm-spænding forhold. * ANOVA test, p. 0,05

Funktionelle studier i Primary glioblastomcellelinier

Den funktionelle udtryk KCa3.1 kanaler i de tre primære glioblastom cellelinjer blev verificeret med patch- clamp målinger i helcelle-perforeret konfiguration (fig 5H, i, L). I alle testede celler (CRL8, n = 8; FCN9, n = 5, og MZC12, n = 4) KCa3.1 strøm blev identificeret som den udadgående strøm aktiveres ved ekstracellulær perfusion af DC-EBIO + ionomycin, og inhiberes af det KCa3.1 kanal-selektiv inhibitor TRAM-34 (3 uM) (figur 5H, I). Figur 5L, som viser den gennemsnitlige KCa3.1 strømtæthed vurderet i de tre cellelinier, indikerer, at CRL8 cellelinien har en væsentlig større massefylde end FCN9 og MZC12 cellelinier. Bemærk, at i modsætning til stabile cellelinier, i primære celler de KCa3.1 strømme til at konstruere plottet er blevet taget ved -40 mV i stedet for 0 mV for på dette mere depolariseret spænding en betydelig spænding-gated DRK strøm var til tider præsentere det var fornuftigt hæmmet af KCa3.1 aktiverende opløsning DC-EBIO + ionomycin. Derfor, for at muliggøre en direkte sammenligning med de KCa3.1 strømtætheder vurderet i glioblastoma-cellelinier, data vist i figur 5L er givet ved 0 mV. Dataene blev opnået ved lineær montering ekstrapolation af IV forholdet i -100 /-40 spændingsområde.

motilitet Stem-lignende cellesubpopulationer afledt af primære cellelinjer stærkt hæmmet af TRAM-34

Sidste undersøgte vi

KCa3.1

mRNA ekspression og migration evne under TRAM-34 behandling i en primær cellelinje (FCN9) og dets klonalt afledt subkultur med stamceller-lignende egenskaber (2B5) [ ,,,0],20].

KCa3.1

mRNA transskription og protein-ekspression viste sig at blive styrket i 2B5 celler i forhold til FCN9 (1,5 gange ± 0,2, p 0,05 for mRNA, og se figur 6B for immunoblotting). En væsentlig forskel mellem de to cellelinier blev også fundet ved flowcytometri (en gennemsnitlig fluorescensintensitet af 1061,97 og 1716,37 for KCa3.1 blev fundet i FCN9 og 2B5, henholdsvis). Procentdelen af ​​positive celler var også forskellig mellem de to cellelinier (51,86% i FCN9 og 70,68% i 2B5). Endvidere histogrammet form (dvs. en overlappende bimodal gaussisk kurve i 2B5 sammenlignet med en gaussisk kurve i FCN9) afslører tilstedeværelsen i 2B5 celler af en subpopulation udtrykker høje niveauer af KCa3.1, som er fraværende i FCN9 (figur 6A). Tilsammen indikerer disse resultater, at stænglen-lignende 2B5 afledt klon udtrykker højere KCa3.1 niveauer end de parentale FCN9 celler.

(A) cytofluorimetrisk analyse af KCa3.1 på FCN9 (øverste panel) og afledt 2B5 klon (nederste panel). Celler blev farvet med anti-KCa3.1 efterfulgt af AlexaFluor488-konjugeret gede-anti kanin. Ti tusind hændelser blev registreret og analyseret med Cyflogic software. Grå histogrammer: cellulær autofluorescens; grøn histogram anti KCa3.1; sort histogram: AlexaFluor488-konjugeret gede-anti kanin. (B) Immunoblotanalyse af FCN9 og 2B5 viste en øget ekspression af KCa3.1 kanaler i afledt ved kloning subkultur byder stamceller-lignende egenskaber (2B5). (C) Kvantitativ analyse af celleinvasion udført på fibronectin-coatede Boyden kammer, ved anvendelse af 3 uM TRAM-34. Resultater, repræsenteret som procent af motilitet inhibering sammenlignet med ubehandlede celler, var statistisk signifikant (*** p 0,001). Søjlerne er gennemsnit ± SD.

En betydelig reduktion af motilitet blev induceret af 3 uM TRAM-34 i begge cellelinier. Reduktionen observeret i 2B5-celler (75%) var imidlertid meget større end i FCN9 celler. (32%, figur 6C)

Discussion

Sammen med de fleste faste tumorer bestående af heterogene cancerceller som samt vaskulaturerne, stromale elementer og inflammatoriske celler [21], GBMS vise bemærkelsesværdig intratumoral heterogenitet og cellulær hierarki. Stigende beviser også støtter kraftigt konceptet, at en delpopulation af kræftceller i tumormassen har større potentiale for kræft initiering og genoprettelse af bestanden [22] – [27]. Disse celler er kendt som cancer stamceller (CSCS) eller tumorfremkaldende celler, som de deler flere kritiske egenskaber med typiske stamceller, herunder evnen til selv-fornyelse, multi-slægt differentiering, og vedligeholdt proliferation [28] – [31] . Ifølge nyere litteratur, gliom stamceller også fremme radioresistance, tumor angiogenese [32], [33] og køre metastaser [34]. Et stort problem med GBM celler er deres yderst infiltrativ natur. Som følge heraf aggressiv invasion af GBM cancerceller i den normale hjernevæv og rygmarv ofte forhindrer fuldstændig fjernelse af tumorceller [35]. Migration begynder, når en celle reagerer på et eksternt signal, der fører til polarisering og udvidelse af en “førende front” i retningen af ​​bevægelsen [36]. Stigende beviser for, at ionkanaler er nødvendige bestanddele af komplekse maskiner ansvarlig for cellemigrering. Konkret ionkanaler at migration mulig gennem osmotiske strømme og deraf følgende indskrænkning og hævelse af cellen kroppen. De er placeret både på bagsiden af ​​cellen og på den førende forsiden, hvor de udøver også en invasiv rolle gennem forsuring af ECM område og fremme af metalloproteinase proteolytisk aktivitet [37]. Overtrædelsen af ​​homeostatiske epitel arkitektur, sammen med købet af en vandrende fænotype, er et afgørende øjeblik i tumor progression af alle solide tumorer. Det er endnu ikke klart, om det er primært den stamcelle del af tumor, der allerede viser invasive egenskaber in vivo, som erhverver den vandrende fænotype [34]. Begrænset viden er tilgængelig om migrerende egenskaber gliom tumorceller in vitro i forhold til KCa3.1 kanal aktivitet. Den KCa3.1 kanal er overvejende aktiv i den bageste kant af cellen [38] og letter den cellulære hævelse og krympning i tumorceller under migration [37]. Derudover har KCa3.1 kanalen været involveret i vandrende reaktion anmodet herom CXCL12, at kemokinligand af CXCR4 [39]. For nylig har vi vist, at strømtæthed hæmning af både KCa3.1 og klorid kanaler i U87MG næsten helt hindrer migrering uden at påvirke spredning [40]. Ion kanaler er blevet undersøgt i stamceller fra forskellige typer af normale væv, som KCa3.1 kanaler i mesenkymale stamceller fra mus knoglemarv [41]. Imidlertid er viden i forhold til ionkanaler i CSCS stedet meget begrænsede [41]. Det fik os til at undersøge tilstedeværelsen og funktion KCa3.1 kanal i humane glioblastom CSCS og hvordan de relaterer til den mobile fænotype i disse celler.

Først viser vi, at KCa3.1 kanal udskrifter er udtrykt i forskellige typer af dyrkede celler såsom permanent etableret og primære cellelinier. Niveauerne er optaget med Real Time-PCR er op til 118 gange højere i U87MG, 76 gange i GL261 og 318,9, 176 og 57,6 gange i tre primære cellelinjer, sammenlignet med normale astrocytter. Der er fundet Lavere men lige så væsentlige forskelle mellem CSCS og forældrenes modstykke i U87MG og den primære cellelinie FCN9. Forskelle i fluorescensintensitet KCa3.1 kanal -bundet antistof og den del af positive celler blev også observeret for første gang, ved cytofluorimetri.

I den normale voksne murine hjerne den KCa3.1 strøm har kun blevet rapporteret på aktiverede mikroglia [42], hjerne kapillære endotelceller [43], Purkinje-celler [44], og i en subpopulation af astrocytter er involveret i neurovaskulær kobling [45] – [47] [8]. Tilsammen vil disse data, at den funktionelle ekspression af KCa3.1 kanal i murine hjerne er begrænset til specifikke astrocytiske cellesubpopulationer. Derfor vi her rapport, at normale voksne mus astrocytter behøver næsten ikke udtrykke KCa3.1 strøm. Dette resultat er også i overensstemmelse med den meget lave fraktion (ca. 2,5%) af KCa3.1 positive celler fundet ved FACS-analyse i normale astrocytter. Vi undersøgte også tilstedeværelsen af ​​Ca-aktiverede K-kanaler ved immunoistochemistry i vævssnit fra både humane normale og tumorprøver. Den KCa3.1 kanal præsenteret med et diffust og stærk farvning kun i prøverne fra høje kvalitet tumorer.

udtryk Kanal tilladt os at undersøge spørgsmålet om den rolle, som KCa3.1 kanal på cellen vandrende evne ved udførelse transwell motilitet assays i nærvær og fravær af en specifik inhibitor af kanalen. blev observeret slående forskelle i migration evne under påvirkning af KCa3.1 kanal hæmmer, TRAM-34. I en tidligere papir fandt vi, at 3 pM TRAM-34 inhiberede U87MG motilitet med 58,5% [40]. I dette arbejde viser vi, at den samme koncentration af kanal blokker reduceret motilitet U87MG-NS, stamme-lignende afledt subpopulation af U87MG, med 66%.

Ved anvendelse patch-clamp teknikker, vi har også kunnet at probe for den aktuelle aktivitet forskelle mellem CD133 positive og negative fraktioner til stede i U87MG-NS population. Dette tillod os at estimere en K nuværende 2,6 gange højere i CD133

+ prøve. Endnu mere slående var reduktionen af ​​2B5 motilitet (-75%) under påvirkning af TRAM-34 i forhold til den observeret i FCN9 (-32%) reduktion. Den observerede fald i motilitet godt korrelerer med niveauerne af KCa3.1 kanal ekspression i de to cellelinjer, på grund af den større følsomhed af 2B5 til TRAM-34. Den fundne korrelation vises mere vigtig i betragtning af den kendsgerning, at KCa3.1 kanalen er kun en af ​​en række forskellige typer af ionkanal fremmer celle mobilitet. Samlet set vores resultater viser, at KCa3.1 kanal udtryk og funktion er mere udtalt i de mindre differentierede befolkninger, der fremmer en mere indflydelsesrig rolle på motilitet fænotype.

Den meget invasive evne in vivo er kendetegnende for stilk celler. Endvidere er det også blevet antaget, at der er to typer af CSCS, en stationære og den anden mobile [48]. Dette rejser spørgsmålet om, hvorvidt ion flow reduktion drives af TRAM-34 ændrer cellemotilitet direkte eller via et signal, der virker på den fænotypiske skifte fra stationær til mobil, gennem en ukendt regulatorisk pathway. Denne sidste hypotese er attraktiv i lyset af de meget nylige observationer viser, at blokering af plasmamembranen natriumkanalen kompleks inhiberer proliferation af gliomaceller, udover migration, og at dette højst sandsynligt involverer ændringer i genekspression program via en mekanisme endnu ikke løst [49]. Også for de KCa3.1 kanaler, vi kan ikke udelukke en sammenhæng mellem modulation af aktuelle aktivitet og genekspression omprogrammering. Dette spørgsmål er stadig uløst.

Materialer og metoder

Cell Cultures

Den etablerede muse og humane glioblastom cellelinjer (GL261 og U87MG) blev dyrket i henholdsvis D-MEM F -12 og D-MEM-medium (Invitrogen) suppleret med 1% ikke-essentielle aminosyrer, 1% L-glutamin, 100 IE /ml penicillin, 100 IU /ml streptomycin og 10% føtalt kalveserum (FCS, Flow Laboratories) ved 37 ° C i en CO 5%

2 befugtet atmosfære i luften. Mus og humane glioblastom kulturer GL261 og U87MG blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Rochville, MD, USA). Astrocytoma primære MZC12, CRL8 og FCN9 (WHO grad IV) blev fremstillet i et tidligere arbejde, som vores gruppe fra tumor prøver af patienter [50]. Nærmere oplysninger om institutionel godkendelse udvalg og informeret samtykke fra patienter er angivet i ovenstående reference.