PLoS ONE: A Novel MMP-2 Inhibitor 3-azidowithaferin A (3-azidoWA) ophæver Cancer Cell Invasion og angiogenese ved Modulerende Ekstracellulær Par-4

Abstrakt

Baggrund

Withaferin A, som er en naturligt afledt steroidt lacton, har vist sig at forebygge angiogenese og metastase i forskellige tumormodeller. Det er også blevet anerkendt af forskellige grupper for fremtrædende anti-kræftfremkaldende roller. Men på trods af disse undersøgelser withanolides, deres detaljerede anti-metastatisk virkningsmekanisme forblev ukendt. Den aktuelle undersøgelse har klar til at tage fat på maskiner involveret i invasion regulering ved stabil derivat af Withaferin A, 3-azido Withaferin A (3-azidoWA) i humane cervikale HeLa og prostata PC-3 celler.

Metoder og Principal fund

Sub-toksisk koncentration af 3-azidowithaferin A (3-azido WA) inhiberede cancer cellemotilitet og invasion i sårheling og Boyden kammer invasion ved at undertrykke MMP-2-aktivitet i gelatinezymografi og dets ekspression har vist sig at være en stor hindring i kemo-følsomhed. Vi har afsløret en ny mekanisme af 3-azidoWA induceret ekstracellulær pro-apoptotisk kandidat tumor suppressor Par-4 protein stimulering i konditionerede medier og også bemærket en samtidig markant reduktion i Pakt og pERK signalering ved immunoblotanalyse. Endvidere vores zymografi resultater tyder, 3-azidoWA induceret MMP-2 inhibering blev medieret gennem sekretorisk Par-4. Inhiberingen af ​​apoptose med 3-azidoWA kunne ikke gendanne MMP-2 gelatinase-aktivitet. Ud over dette, vores

in vivo

dyreforsøg data viste 3-azidoWA ophævet neovaskularisering i dosisafhængig måde i muse Matrigel stik assay.

Konklusion /Betydning

Til dette rapport, fandt vi, at 3-azidoWA undertrykt motilitet og invasion af HeLa og PC-3-celler i MMP-2-afhængig måde. Vores

in vitro

resultat tyder stærkt på, at sub-toksiske doser af 3-azidoWA forbedret udskillelse af ekstracellulære Par-4, der afskaffede sekretorisk MMP-2 ekspression og aktivitet. Udtømning af sekretorisk Par-4 restaureret MMP-2-ekspression og invasion evne HeLa og PC-3-celler. Endvidere vores iagttagelser medførte, at 3-azidoWA svækkede indre phospho-ERK og phospho-Akt ekspression på dosisafhængig måde kan spille en central rolle i inhibering af muse angiogenese med 3-azidoWA

Henvisning:. Rah B, Amin H, Yousuf K, Khan S, Jamwal G, Mukherjee D, et al. (2012) A Novel MMP-2 Inhibitor 3-azidowithaferin A (3-azidoWA) ophæver cancercelleinvasion og angiogenese ved Modulerende Ekstracellulær Par-4. PLoS ONE 7 (9): e44039. doi: 10,1371 /journal.pone.0044039

Redaktør: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, USA

Modtaget: 23. maj 2012; Accepteret: August 1, 2012; Udgivet: 4. september, 2012 |

Copyright: © Rah et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ekstracellulære sekretoriske veje anses for at spille central rolle i. human fysiologi. Kroppens vitale hormoner og vækstfaktorer udskilles og de kontrollerer udviklingen og differentieringen af ​​organer i normal fysiologisk tilstand. Ligeledes systemiske (ekstracellulære) proteiner tilskriver stor

in vivo

funktion under vækst af væv og apoptose [1]. Prostata apoptotisk respons 4 (Par-4) udtrykkes ubikvitært og evolutionære konserverede pro-apoptotisk protein, hvis ekspression blev hovedsagelig korreleret med de celler, der undergår apoptose grund eksogene fornærmelser [2]. Bortset fra dens intracellulære funktion, har den nye perspektiv af ekstracellulær sekretion i forskellige cancerceller augmented terapeutiske potentiale Par-4 [3]. For nylig Burikhanov et al. har vist, at pattedyrceller i almindelighed forårsaget sekretion af Par-4. konstateredes imidlertid den apoptotiske induktion af ekstracellulær Par-4 foregik over celle- overflade GRP-78 for at fremme celleinvasion og tumorigenese [3]. Stabiliseringen af ​​pro-angiogen GRP-78 ved Par-4 er blevet udpeget en anti-invasiv rolle af ekstracellulært Par-4.

Metastase er en multi-trins proces, der involverer celle migration og pericellulære proteolyse af ECM, der medierer cancerceller fremspring [4]. Matrixmetalloproteinaser (MMP’er) er ansvarlige for nedbrydningen af ​​miljømæssige barrierer, såsom den ekstracellulære matrix og basalmembran [5], [6]. Blandt de MMP familiemedlemmer, MMP-2 og -9 er generelt anses for at være malignitet af forskellige tumorer samt dårlig prognose af mange cancere [6]. Således MMP’er kan spalte type IV basalmembran kollagen (MMP-2 og -9) og tilsæt værdi for lægemiddeludvikling. Overbevisende prækliniske studier fra forskellige laboratorier har givet overvældende støtte til direkte sammenhæng mellem MMP-2 overekspression og tumor invasion /metastase [7], [8]. Under udviklingsfase, mange af MMP-inhibitorer til kroppen i de kliniske tidlige fase forsøg på grund af omfattende homologi mellem katalytiske domæner af MMP’er. Desuden er de fleste af de syntetiske /semi-syntetiske hæmmere af MMP’er blev trukket tilbage under kliniske forsøg på grund af uventede langsigtet stof intolerance reduceret overholdelse narkotika [9]. På den anden side, for nylig, naturprodukter eller naturproduktet derivater blevet betragtet yderst potentiale at ophæve MMP-2 og -9 medieret invasion /metastase enten

in vitro

eller

in vivo

oprettet . Disse omfatter vandig kanel ekstrakt [10], grøn te-ekstrakt [11], curcumin [12], og steroide saponin fra bukkehorn [4], chitooligosacharides (COS) fra marine naturlige produkter [13].

Withaferin A (WFA) er en prototype af withanolide klasse af naturlige produkter, der udviser forskellige farmakologiske aktiviteter, herunder antitumor, antiangiogene, hjertebeskyttende, anti-inflammatoriske og immunmodulerende effekter [14], [15]. De bioaktive egenskaber Withaferin A indbefatter cytoskeletal remodeling ved binding til Annexin II [16], antiangiogenisk [17], [18] og antitumoraktivitet [19], [20] ved inhibering af proteasomalaktivitet chymotrypsin [21] og apoptotisk induktion ved hæmning af proteinkinase C [22]. For nylig, Oh et al har demonstreret caspase-3-aktivering gennem Withaferin A [23]. Bortset fra sin anti-kræft aktivitet, har Withaferin A også blevet dokumenteret for sin anti-inflammatorisk egenskab ved at undertrykke alfa-2-makroglobulin [24]. Med vores seneste succes til udvikling af et bibliotek af Withaferin et semisyntetisk analoger, rationel screeningsstrategi føre til dannelse af 3-azidoWA, den potente anticancer kandidat [25]. Selv om betydningen af ​​α-β-umættede funktionalitet ring A i Withaferin A og anticancer potentiale 3-azidoWA blev klart, stadig sin virkemåde var ikke klart.

I denne undersøgelse evaluerede vi det mekanistiske rolle af 3-azidoWA (3-azido WA), en azido Withaferin derivat på motilitet og invasion af cancerceller. Vi ønskede også at co-relatere dette studie med signalveje

nemlig

, ERK, Akt, der aktiveres i forskellige kræftformer og forstærker invasion og metastase af forskellige kræftceller. Resultaterne af disse undersøgelser giver os vigtige oplysninger om mekanistiske rolle 3-azidoWA om ophævelse af invasion af livmoderhalskræft og prostata celler kræft, der kan være en-dirigeres gennem ekstracellulær Par-4.

Materialer og metoder

Cell Kultur og antistoffer

Alle cellelinier blev købt fra European Collection of Cell Culture (ECACC), kalvefosterserum (FBS), RPMI-1640, Minimum Essential Medium (MEM), penicillin G , streptomycin, Trypsin-EDTA blev opnået fra Invitrogen Corp. 5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT), paraformaldehyd Crystal violet, Staurosporin, phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), Dithiothretol (DTT), NP-40, Protease Inhibitor Cocktail, gelatine, Brij- 35, Comassie Brilliant Blue (R-250), Brefeldin A (BFA), Tunicamycin, TRAIL, Annexin V-FITC apoptosis afsløring assaykit, dimethylsulfoxid (DMSO), Bradford reagens blev opnået fra Sigma Chemicals Co. (St. Louis, MO ) Propedium iodid og Ultracruz DAPI monteringsmedium blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA), Z-VAD Pan caspaseinhibitor, rekombinant human VEGF-165 og rekombinant human FGF (basic 146 aa) blev opnået fra R 0,05 værdier blev tildelt betydning

Resultater

3-azidoWA er en anti-proliferativ Agent og inducerer apoptose i PC-3 og HeLa-celler

Withaferin A er en. potent cytotoksisk middel og viste vækst-hæmmende egenskaber i tumor cellekultur eksperimenter [19], [26]. Så godt som modermolekylet Withaferin A, differentialkvotienten af ​​Withaferin, 3-azidoWA (. Figur 1, A) signifikant udviste antiproliferativ virkning i et panel af cellelinier testet (med IC

50 inden for en afstand af 800 nM – 1,0 uM) [25] (fig. 1, B). For yderligere bekræftelse af apoptose med 3-azidoWA udførte vi Annexin V-FITC-farvning af 3-azidoWA behandlede HeLa-celler. Som afbildet i fig. 1, C 59,1% tidlig apoptotiske celler sammenlignet med 72,5% med 25 nM staurosporin, optrådte når HeLa-celler blev behandlet med 1,0 pM 3-azidoWA i 24 timer. Ved DAPI-farvning observerede vi, at 1,0 uM 3-azidoWA, ikke 0,5 uM induceret apoptose i HeLa og PC-3-celler inden for 24 timer inkubation i sammenligning med positiv kontrol staurosporin (figur 1, D). Et resterende overførselsteknikker relateret tidlige apoptoic celler blev observeret i FACS data (ved lavere koncentration på 0,25 uM 3-azidoWA behandling) imidlertid højere koncentration (1,0 uM) 3-azidoWA, føre cellerne mod apoptose med chromatinkondensering omkring nukleare periferi ledsaget af reduktion nuklear størrelse (hvide pilespidser, fig. 1, D). Aktiv caspase-3, kvantificeret ved western blot analyse viste spaltning af caspase-3 ved 1,0 uM 3-azidoWA behandling men ikke på sub-toksiske doser (0,5 uM) (fig. 1, E). Kollektivt, disse resultater, at 3-azidoWA er en prospektiv cytotoksiske og apoptoseinducerende naturprodukt derivat.

(A) Syntese af 3-azidoWA. (B) Virkningerne af 3-azidoWA på celleproliferation af A549 (lungecancer), PC-3, DU-145 (prostatacancer) og HeLa (livmoderhalskræft) cellelinjer blev bestemt ved MTT-assayet. (C) 3-azidoWA sammen med køretøjet DMSO og positive kontrol STAUROSPORIN behandlede celler blev analyseret ved FACS, (som anført); grafisk gengivelse af resultaterne viser andel af ikke-apoptotiske celler (Q3), tidligt apoptotisk (Q4), nekrotisk (Q1) og sent apoptotiske (Q2) celler. (D) HeLa-celler (5 x 10

4) blev dyrket i kammerskiver og behandlet med 3-azidoWA (0,25, 0,50 og 1,0 uM) langs med køretøjet DMSO og positiv kontrol staurosporin (25 nM) i 24 timer. Efter fiksering blev celler farvet med nuklear farvning DAPI og fotograferet under fluorescensmikroskop (100x forstørrelse) for at identificere de apoptotiske kerner (hvide pilespidser). (E) HeLa-celler blev behandlet med stigende koncentrationer af 3-azidoWA som indikeret, procaspase-3 og spaltes caspase-3 udtryk blev bestemt ved Western blotting sammen med ladningskontrol β-actin.

3- azidoWA hæmmer cellemotilitet, invasion og kolonidannelse

Som withanolides var kendt for at inhibere invasion evne af cancerceller [27], vi bestemt at undersøge effekten af ​​3-azidoWA på den invasive potentiale HeLa og PC-3 celler

in vitro.

Sårhelende assays blev anvendt til at bestemme, om sub-toksisk koncentration af 3-azidoWA kunne hæmme motilitet Hela og PC-3-celler. Efter 48 timer, cellemonolaget s blev såret, køretøjets DMSO behandlede celler havde fuldstændigt fyldt i blokerede område (figur 2, A.), Hvorimod behandling med 0,50 og 0,75 uM 3-azidoWA signifikant (p 0,05) inhiberede motilitet Hela og PC-3 celler, som gjorde behandling med staurosporin (fig. 2, A og B) (fig. S1, A og B).

(A) HeLa-celler (0,5 x 10

5 celler /brønd) blev dyrket til konfluens i seks-brønds vævskulturplade og ridset med sterilt spids; 3-azidoWA blev tilsat til kulturer som indikeret. Ridsede steder blev fotograferet (forstørrelse 100x) ved nul timer og derpå efterfølgende igen 24 timer senere for at vurdere graden af ​​sårheling. (B) De ridsede områder blev kvantificeret i tre tilfældige felter i hver behandling, og data blev beregnet ud fra tre uafhængige forsøg. (C) HeLa (1 × 10

3) celler /brønd blev dyrket og behandlet med forskellige koncentrationer af forbindelse 3-azidoWA i 5 dage ved 37 ° C og derefter farvet med krystalviolet (for detaljer se materialer og metoder), antal farvede kolonier blev talt, blev fotograferet (100x) og (D) data beregnet ud fra tre uafhængige eksperimenter. Kolonner betyder; barer SD af tre uafhængige forsøg. P 0,05, ** P 0,01 sammenlignet med ubehandlet kontrol. (E) Cellemigrering bestemt via det modificerede Boyden kammer assay som beskrevet i Materialer og Metoder. HeLa-celler (2 x 10

5) blev podet i øverste kammer i nærvær eller fravær af 0,25, 0,50, og 0,75 uM 3-azidoWA. Cellerne fik lov til at migrere i 24 timer, på hvilket tidspunkt migrerende celler på den nederste halvdel af indsatsen membranen blev farvet med 0,1% krystalviolet og talt under 200x forstørrelse. (F) Invasive celler blev talt under anvendelse billedsoftware som antallet af migrerede celler pr høj effekt felt (HPF). Fem felter blev talt i tre eksemplarer (n = 3) fra hver indsats. Cell billeder blev opnået under anvendelse af mikroskop Nikon Eclipse E200 indbygget med kameraet. Kolonner betyder; barer SD af tre uafhængige forsøg. P 0,05, ** P 0,01 sammenlignet med ubehandlet kontrol

Kolonidannelse evne HeLa og PC-3-celler blev svækket ved 3-azidoWA behandling på en dosisafhængig måde.. Som vist i fig. 2, C subletale doser af 3-azidoWA nedsat kolonidannelse evne HeLa-celler i statistisk signifikant måde (P 0,05). (. Figur 2, D) (. Fig S1, C og D)

En kritisk hændelse i tumorinvasion og metastase er evnen af ​​tumorceller at invadere gennem den ekstracellulære matrix, hvilket tillader tumorceller at bevæge sig ud over grænserne for primær tumor miljøet [28]. For at undersøge effekten af ​​3-azidoWA på celle invasion, blev Boyden kammer invasion assay udført for at bestemme evne HeLa og PC-3 celler til at invadere gennem biologiske matricer

in vitro

. Som vist i fig. 2, E og F, (fig S1, E og F, P. 0,01) behandling med 3-azidoWA (0,50 og 0,75 uM) inhiberede celleinvasion (P 0,05) .For at tilsidesætte mulighed for ændringer af celleinvasion grund programmeret celledød, vi omhyggeligt vælge de fysiologisk relevante koncentrationer af 3-azidoWA. Alle disse resultater kollektivt indikerer, at sub-toksiske doser af 3-azidoWA ændre vækst kinetik HeLa og PC-3 celler. Dette kunne være en positiv indikator for kontrol af dets antineoplastisk aktivitet i cervicale og prostatacancerceller.

Inhibering af matrixmetalloproteinase 2 Gelatinaseaktivitet og ekspression af 3-azidoWA

Tumorcelleinvasion gennem matricen og væv obstruktion brug de kombinerede virkninger af øget cellemotilitet og kontrolleret proteolytisk nedbrydning af matrix. Høje niveauer af MMP’er i tumorvæv er blevet korreleret med cancercelle matrixnedbrydning, invasion og metastase [29]. Som 3-azidoWA inhiberede cellemotilitet, undersøgte vi, om 3-azidoWA udøver anti-gelatinase-aktivitet. Som det ses i fig. 3, A og B (fig. S2, A), øverste række, stigende koncentration af 3-azidoWA selektivt ophævet gelatinaseaktivitet og ekspression af 72 kDa MMP-2-båndet som bekræftet ved gelatinezymografi og Western blot analyse. Virkningen af ​​MMP-2-inhibering med 3-azidoWA var mere udtalt end modermolekylet withaferin A (fig. 3, C) (fig. S2, B) Længere vi undersøgt, om 3-azidoWA kunne hæmme andre gelatinase (MMP-9) og resultaterne viste, at 3-azidoWA specifikt blokere MMP-2-aktivitet i HeLa og PC-3-celler, men ikke MMP-9 (fig. 3, A midterste række) (fig. S2, A midterste række). Sammen disse resultater tyder på, at 3-azidoWA stærkt og selektivt ophæver MMP-2 ekspression og aktivitet på en dosisafhængig måde.

(A) HeLa-celler blev efterladt ubehandlet eller behandlet med 0,50 uM og 0,75 uM 3- azidoWA i 48 timer blev konditionerede medier analyseret for MMP-2 -9 Gelatinaseaktivitet. (B) HeLa-celler blev efterladt ubehandlet eller behandlet med 0,25, 0,50, 0,75 og 1,0 uM 3-azidoWA i 48 timer, at konditionerede medier blev opnået, blev anvendt til western blot-analyse efterfulgt af Coomassie blue-farvning afslører 68 KDa BSA bånd for ladningskontrol . (C) HeLa-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af forælder withaferin A i 48 timer, og aktiviteten af ​​MMP-2 blev bestemt ved gelatinezymografi. (D) (E) HeLa-celler blev behandlet med TRAIL i 180 minutter og med Tumicamycin i 60 minutter (som angivet). Konditionerede medier blev underkastet gelatinezymografi analyse for MMP-2-aktivitet og Western blot-analyse for ekstracellulær Par-4, efterfulgt af coomassie blue farvning for ladningskontrol.

3-azidoWA inducerer Ekstracellulære Par-4 Sekretion ved klassiske forløb

som par af apoptoseinducerende midler letter udskillelsen af ​​ekstracellulær par-4 [3], forsøgte vi at undersøge et panel af medicinske planter afledt rene naturprodukter, der kan fremme apoptose og /eller forøger sekretion af par-4 (data ikke vist). Overraskende fandt vi, at så lave som 0,5 um (langt under cytotoksiske dosis) 3-azidoWA, men ikke modermolekylet Withaferin A (data ikke vist) inducerede det ekstracellulære Par-4-sekretion i dosisafhængig måde (fig. 3, B midten række), verificeret ved Western blot. Desuden observerede vi 3-azidoWA behandling augmented sekretionen af ​​ekstracellulær Par-4 i de betingede medier, der i det væsentlige efterlignede virkningerne af 300 ng TRAIL (TNF relateret apoptoseinducerende ligand) og 1,0 pM af Tunicamycin behandling (Fig. 3, D og E midterste række). For at vurdere, om denne sekretion af Par-4 skete via den klassiske BFA-følsom vej involverer ER /golgi rute, vi opsagt protein handel fra ER til Golgi med Brefeldin A (BFA) og fundet udskilt Par-4-niveau blev aftog i konditionerede medier efter 3-azidoWA og TRAIL behandling i nærvær af Brefeldin A (fig. 4, A og B øverste række). Her foreslår vi, at 3-azidoWA inducerer ekstracellulær Par-4-sekretion af klassisk BFA følsom vej.

af PC-3 celler. (A) PC-3-celler blev efterladt ubehandlet eller forbehandlet med BFA (1,0 uM) i 120 minutter, derefter behandlet med 3-azidoWA som angivet i 48 timer. Som vist i fig. (B). (B).