PLoS ONE: karakterisere tyrosinphosphoryleringen signalering i lungekræft Brug SH2 Profiling

Abstrakt

Baggrund

Tyrosinkinaser drive spredning og overlevelse af mange menneskelige kræftformer. Således profilering den globale tilstand af tyrosinphosphorylering af en tumor vil sandsynligvis give et væld af oplysninger, der kan bruges til at klassificere tumorer for prognose og forudsigelse. Men den omfattende analyse af tyrosinphosphorylering af et stort antal humane cancer prøver er teknisk udfordrende med de nuværende metoder.

Metode /vigtigste resultater

Vi brugte en phosphoproteomic metode betegnes SH2 profilering at karakterisere den globale tilstand af phosphotyrosin (pTyr) signalering i human lunge cancer cellelinjer. Denne metode kvantificerer phosphorylerede bindingssteder for SH2-domæner, der anvendes af cellerne til at reagere på ændringer i pTyr under signalering. Celler kunne grupperes på grundlag af SH2-bindende mønstre, med nogle klynger korrelerede med EGF-receptor (EGFR) eller K-ras-mutation status. Binding af specifikke SH2 domæner, mest fremtrædende RAS vej aktivatorer Grb2 og ShcA, korreleret med EGFR mutation og følsomhed over for EGFR inhibitor erlotinib. SH2 bindende mønstre afspejles også MET aktivering og kunne identificere celler drevet af flere kinaser. De Ptyr reaktioner af celler behandlet med kinase hæmmere fremlagt dokumentation af distinkte mekanismer hæmning.

Konklusioner /Betydning

Denne undersøgelse illustrerer potentialet af modulære proteindomæner og deres proteom bindende profiler så stærke molekylær diagnostik værktøjer til tumor klassificering og biomarkør identifikation

Henvisning:. Machida K, Eschrich S, Li J, Bai Y, Koomen J, Mayer BJ, et al. (2010) karakteriserer tyrosinphosphoryleringen signalering i lungekræft Brug SH2 profilering. PLoS ONE 5 (10): e13470. doi: 10,1371 /journal.pone.0013470

Redaktør: Eric J. Bernhard, National Cancer Institute, USA

Modtaget: May 3, 2010; Accepteret: September 23, 2010; Udgivet: 19 oktober 2010

Copyright: © 2010 Machida et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev delvist finansieret af tilskud fra National Functional Genomics center (https://nfgc.moffitt.org/nfgc_Site.aspx?spid=E395859332944CBF8AFBDED2CE39B74A) (W81XWH-08-2-0101), National Institutes of Health (http: //grants.nih.gov/grants/oer.htm) (P50-CA119997, R33-CA107785, og RC1-CA146843) og CT Breast Health Initiative, Inc. (https://ctbhi.org/). Dette arbejde er delvist understøttet af en bevilling fra National Institutes of Health (P30CA076292) til molekylærbiologi Core og Bioinformatik Core faciliteter på H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

receptor og ikke-receptor-tyrosinkinaser regulere mange aktiviteter er vigtige for kræft, herunder celleproliferation, overlevelse, invasion /metastase, og angiogenese [1]. Disse signalproteiner udgør derfor en vigtig klasse af lægemiddelkandidater til behandling af cancer, og talrige tyrosinkinaseinhibitorer (TKI’er) er under udvikling eller anvendes nu i klinikken. Lungekræft tegner sig for mere end 160.000 dødsfald om året i USA [2], så der er en stærk rationale at identificere de vigtigste drivkræfter for lungekræft, som kan terapeutisk udnyttes. Aktiviteten af ​​den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR) er ofte forhøjet i lungekræft, og inhibering af EGFR gennem TKI erlotinib kan forlænge overlevelsen hos patienter med fremskreden lungecancer refraktære over for kemoterapi [3]. Foruden EGFR, har en række andre tyrosinkinaser blevet foreslået som terapeutiske mål i lungekræft, herunder MET, insulinlignende vækstfaktorreceptorer (IGFR), SRC-kinaser, fibroblast vækstfaktorreceptorer (FGFR), blodpladeafledt vækstfaktor receptorer (PDGFR), anaplastisk lymfom kinase (ALK), og EPH-receptorer [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12] .

Et centralt spørgsmål i TKI behandling for lungekræft er hvilke patienter vil få gavn af disse stoffer, da omkostningerne er betydelig, og mange får ingen gavn af behandling. Et vigtigt gennembrud var opdagelsen af ​​aktiverende somatiske mutationer i EGFR at forbedre receptor signalering og forudsige følsomhed for TKI’er målretning EGFR, såsom erlotinib og gefitinib [13], [14], [15]. I lungekræftpatienter huser disse mutationer, kan responsrater til EGFR TKI’er være høj og overlevelse er bedre end den, der ses med cytostatika [16]. Ikke desto mindre nogle patienter uden EGFR mutation kan drage fordel af EGFR-inhibitorer og markører, såsom EGFR genamplifikation, autokrine TGFa produktion, eller genekspressionsprofiler er blevet foreslået at identificere disse patienter [17], [18], [19]. Desuden kan resistensmekanismer som MET forstærkning eller sekundære mutationer i EGFR hurtigt føre til resistens [20], [21], [22]. Endelig nogle tumorceller vil sandsynligvis blive drevet af flere tyrosinkinaser, og metoder til at identificere og klassificere disse er nødvendige [23].

proteomiske strategier (der undersøger globale mønstre af protein-ekspression eller phosphorylering) er også at være anvendes til at klassificere tumorer [24]. Massespektrometri (MS) koblet med anti-phosphotyrosin-antistoffer identificerede forskellige mønstre af tyrosinkinase signalering i lungecancerceller og tumorer, og denne fremgangsmåde var i stand til at identificere celler drevet af oncogen EGFR, PDGFR, og ALK [4]. Andre undersøgelser under anvendelse af den samme fremgangsmåde fandt mønstre af tyrosinphosphorylering forbundet med mutant EGFR signalering [25], [26]. Samlet set giver dette arbejde bevis på princippet om, at de globale tyrosinphosphoryleringssteder mønstre kan give nyttige oplysninger om tumor klassificering. De nuværende MS-metoder kræver relativt store mængder af prøve og kvantificering af fosforylerede steder er der er behov for udfordrende, således nye phosphoproteomic strategier.

Vi har udviklet en alternativ phosphoproteomic metode, kaldet SH2 profilering, der supplerer MS-tilgange [27], [28]. SH2 profilering er meget følsom og gennemløb er relativt høj, og dermed er det ideelt til profilering phosphotyrosin (pTyr) signalering i kræftceller. Det begrebsmæssige grundlag for SH2 profilering er at bruge cellens egen pTyr signal responsapparat at afhøre staten pTyr signalering. Ved receptor (RTK) aktivering, den deraf følgende stigning i proteintyrosinphosphorylering genererer bindingssteder for modulære Ptyr-specifikke bindende domæner; det er den relocalization af intracellulære effektorer, der indeholder Ptyr bindende domæner på disse phosphorylerede websteder, der er den afgørende skridt i signal transmission [29]. Langt den mest rigelige pTyr bindende modul i mennesker er Src homologi 2 eller SH2-domænet [30]. Der er 120 SH2-domæner kodes af det humane genom, og hver SH2-domæne binder et unikt spektrum af tyrosinphosphoryleret sites [28], [31]. Fordi SH2 domæner er, hvad cellen bruger til at reagere på eller “læse” ændringer i tyrosinphosphorylering under signalering, kan omfanget af binding af forskellige SH2 domæner giver et væld af oplysninger om de mekanismer og status af pTyr signalering.

for at teste, om denne fremgangsmåde er nyttig i at karakterisere og klassificere komplekse tumor typer såsom lungekræft, hvor flere tyrosinkinaser drive nedstrøms signalering og vedligeholde tumorvækst, vi anvendte SH2 profilering lungekræft-cellelinjer. Vi finder, at Ptyr mønstre kunne relateres til kendte funktioner i celler, herunder EGFR mutation status og følsomhed over for EGFR TKI. Vores resultater tyder på, at SH2 profilering giver nye indsigter i pTyr signalering, der sandsynligvis vil være nyttigt for forudsigelse og prognose af lungekræft.

Resultater

SH2 profilering identificerer delmængder af lungekræft-cellelinjer

Vi valgte en gruppe af 22 ikke-småcellet lungekræft cellelinier med kendte EGFR og K-RAS mutation status og kendt følsomhed over for EGFR TKI erlotinib (Suppl. tabel S1). Den overordnede strategi for vores studier er vist i fig. 1. Cellelysater blev fremstillet ud fra aktivt voksende celler dyrket i serum-suppleret medium. To tilgange til at generere SH2 profiler blev anvendt, omvendt-fase-protein array og langt-vestlige blotting [28]. I den første metode er flere protein prøver (cellelysater) spottet i arrays i register med brøndene af en 96-brønds kammer apparat. Hver brønd fyldes derefter med en opløsning indeholdende et andet GST-SH2-domænet probe, og efter inkubering og vaskning det bundne probe kvantificeret for hver plet. Mængden af ​​binding afhænger af antallet og affiniteten af ​​tyrosinphosphoryleret protein steder i prøven. Med denne fremgangsmåde, som vi kalder en “roset” assay, er det muligt at profilere det samlede niveau af binding til stort set alle SH2-domæner i genomet (94 SH2-domænet sonder og en PTB domæne repræsenterer 90 forskellige proteiner) under anvendelse af minimale mængder af protein prøve.

Humane lungekræft cellelinier (Suppl. tabel S1) blev dyrket i nærvær eller fravær af tyrosinkinaseinhibitorer erlotinib eller dasatinib. Celleproteiner blev ekstraheret og analyseret ved roset og langt-Western blotting under anvendelse af et array af SH2-domænet prober (Suppl. Tabel S3). Bioinformatisk analyse af kvantitative data blev brugt til klassificering og biomarkør screening.

For at undersøge slægtskab for forskellige lungecancer cellelinier blev kvantitative SH2 bindende værdier udsat for ukontrollerede hierarkisk clustering analyse (se metoder). Resultater er vist i varme kort format i fig. 2A og den rå billeddata vises i Suppl. Fig. S1. Data med lavt signal /baggrund blev kasseret; data for de resterende 70 sonder var median-centreret til klyngedannelse; rød indikerer højere end median binding, grøn lavere. De behandlede data kan findes i Suppl. Tabel S2. Data kan også tilgås ved hjælp af en web-baseret viewer (https://proteome.moffitt.org/sh2/). I denne analyse cellelinjer huser mutant EGFR klynge sammen i tre forskellige sub-klynger, mens to store klynger (af fire og otte cellelinjer) består udelukkende af linjer med vildtype (wt) EGFR. Disse resultater antyder, at SH2 profilering kan identificere undergrupper af lungecancerceller, og at sådanne klynger synes relateret til EGFR mutation status.

(A) Roset data grupperet af SH2-domænet og cellelinie. Hver række repræsenterer et enkelt SH2-domænet og hver kolonne repræsenterer en enkelt cellelinie. Biologiske egenskaber (EGFR mutation, K-ras-mutation, erlotinib følsomhed) er vist ovenfor i sort og hvid. For erlotinib følsomhed, positiv /følsom: IC

50 10 nM; mellemliggende /moderat følsomme: 10-1000 nM; negativ /ufølsom: 1000 nM. (B) Far-vestlige data grupperet af SH2 domænespecifikke bin og cellelinje. Hver række repræsenterer en enkelt MW bin (20 skraldespande /bane) til et bestemt SH2 domæne og hver kolonne repræsenterer en enkelt cellelinje.

Den anden SH2 profilering tilgang bruger langt-Western blotting for at få mere detaljeret information om den relative forekomst og tilsyneladende molekylvægt (MW) på phosphoproteiner der binder forskellige SH2-domænet prober. Proteinprøver adskilles på basis af størrelse ved gelelektroforese og overført til membraner, som derefter probet med mærkede SH2-domæner. SH2 bindende proteiner er afsløret som bands, og den tilsyneladende MW disse bands kan give et fingerpeg om deres identitet. Vi udviklede software-værktøjer, der giver SH2 bindende data fra langt-Western blots skal kvantificeres i “siloer” ved tilsyneladende MW, f.eks 20 bins per lane. Dataene fra hver beholder (svarende til phosphoproteiner af en bestemt MW, som binder til SH2 probe) kan derefter anvendes som grundlag for klassificering af prøver. I stedet for en enkelt værdi for hver prøve og SH2 domæne som i rosetten assay, kvantitativ langt Western blotting giver mindst 20 forskellige datapunkter, i høj grad øge den potentielle forskelsbehandling af prøverne.

Far-Western blots lungekræft cellelinier probet med 36 SH2 eller PTB-domæner, såvel som anti-pTyr antistof. Rå billeddata kan findes i Suppl. Movie S1, og kvantitative data i Suppl. Tabel S2. Når kvantitative resultater blev underkastet hierarkisk klyngedannelse, prøverne grupperet i 3 forskellige klasser, plus to outliers (fig. 2B). En af disse (klynge 3) består udelukkende af celler med wt EGFR og er højt beriget med celler med aktivering K-RAS mutationer. I modsætning hertil er klynger 1 og 2 beriget med celler med EGFR-mutationer; inden for hver af disse klynger, celler med wt og mutant EGFR er adskilt. Således kvantitativ langt-Western blotting synes at give yderligere oplysninger om tyrosinkinase signalering tilstand, der kan bruges til funktionelt klassificere celler på basis af RTK aktivering status. Samlet clustering resultater fra rosetten og langt-vestlige analyser ligner hinanden, men ikke er identiske, som beskrevet nedenfor.

Binding af et sæt af SH2 domæner er forbedret i celler indeholdende aktiverende EGFR-mutationer

Vi næste spurgte, om binding af eventuelle individuelle SH2 domæne sonder var stærkt forbundet med aktiverende EGFR-mutationer. Fra roset bindende eksperimenter vi identificeret 7 sonder, hvis binding blev korreleret i en statistisk signifikant måde med EGFR mutation status:. Grb2, ShcA (PTB), Grap2, Brk, TXK, CblB og CblA (. Figur 3A) (se Suppl Table S3 for SH2 domænenavne og tilsvarende proteiner). Vi input disse domæner i PPI Spider, et værktøj til at fortolke proteomics data i forbindelse med kendte protein-protein-interaktion net. Denne analyse viste, at fem af disse proteiner (ShcA, Grb2, CblA, CblB, og Brk) er blevet rapporteret at binde direkte til EGFR, mens Grap2 er potentielt forbundet med EGFR gennem ShcA (fig. 3B). Det faktum, at bindingssteder for Grb2 og ShcA (og den tætte Grb2 slægtning Grap2) er tæt forbundet med EGFR-mutation er særligt spændende, da øget binding af disse SH2 domæner ville være kraftigt forventes at føre til aktivering af RAS signalvejen via rekruttering af RAS-aktivator Sos [32], [33]

(A) SH2 domæner, hvis binding er signifikant korreleret med EGFR-mutation (q 0,1).. Bar plot af SH2 signal for mutant og vildtype EGFR cellelinjer er vist som middelværdi med standardfejllinjer. “SH2-domæne” anvendes i tallene for alle prober, herunder PTB-domæner og anti-pTyr antistof. (B) Protein-protein-interaktion kort for EGFR (grå cirkel) og proteiner med SH2-domæner, hvis binding er signifikant korreleret med EGFR mutation (hvide cirkler). Linjer angiver rapporteret direkte bindende interaktioner. (C) Far-vestlige domænespecifikke bands signifikant korreleret med EGFR mutation. Farvede felter angiver resultaterne af statistisk signifikans i en Mann-Whitney-test for forskelle (q 0,1) blandt de 22 cellelinjer vist i figur 2B. Pilen angiver beholder svarende til EGFR familiemedlemmer. Numrene ved siden af ​​placeringer indikerer tilsyneladende molekylvægt, f.eks “291,0” = MW mellem 256-291 kDa.

En tilsvarende analyse blev udført ved hjælp af data fra langt-Western blotting. Vi fandt, at en række specifikke bånd på langt-Western blots korrelerede signifikant med EGFR mutation (fig. 3C). Her er det interessant at overveje bands hvis binding tendens til at stige i EGFR mutantceller (rød) versus dem hvis binding tendens til at falde i EGFR mutantceller (grøn). Vi bemærker, at for sonder forudsagte (på basis af kendt signaleringsaktivitet) at være forbundet med stimulering af ras-banen (Grb2 og Shc), øget binding i molekylvægtsområde indeholdende phosphorylerede EGFR familiemedlemmer (MW194, pil) ses for EGFR mutant celler. Dette sandsynligvis afspejler øget binding af disse effektorer unormalt aktiverede EGFR sammenlignet med wt-receptoren. Dette gælder også for SH2 domæner af andre kendte positive effektorer af EGFR-signalering, herunder VAV2, PI 3-kinase (PI3K, P85B)., Og PLCγ Plcg1)

I modsætning til EGFR-mutation, fandt vi ingen enkelt SH2-domæner hvis binding korrelerede stærkt med RAS mutation status ved roset eller langt-Western blotting. På trods af dette, har vi bemærket en interessant tilsyneladende sammenhæng mellem clustering baseret på globale SH2 profiler og K-RAS mutation status. Dette er særlig klart i tilfælde af langt-Western blotting (Fig. 2B), hvor to store klynger udelukkende består af celler med wt K-RAS, mens en tredje større klynge (cluster 3) består næsten udelukkende af celler med wt EGFR men mutant K-RAS. Vi blev oprindeligt forundret ved fremkomsten af ​​H1299 i klynge # 3, som K-RAS er vægt i disse celler. yderligere undersøgelse af sekvensdata afslørede imidlertid, at K-RAS relativ N-RAS er muteret i H1299 (https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/CellLines/), men ikke i nogen af ​​de andre celle linjer anvendes i denne undersøgelse. Således en forudsigelse baseret på SH2 profilering, at H1299 celler sandsynligvis havnen aktiverede RAS, blev båret ud, stærkt validere den biologiske relevans af denne tilgang. Denne klynge af RAS mutanter (6 af 6 cellelinjer huser RAS mutation) er højst usandsynligt at have fundet sted ved en tilfældighed (p = 0,001, permutation test, n = 100.000). Disse resultater indikerer, at tyrosinphosphoryleringssteder mønstre kan sub-klassificere celler baseret på RAS mutation status. Den manglende sammenhæng mellem de enkelte SH2 domæne sonder og RAS mutation (i modsætning til korrelation baseret på den globale tyrosinphosphorylering profil) kan afspejle det faktum, at RAS-funktioner nedstrøms for tyrosinkinaser. Vi tester i øjeblikket den model, som konstitutive Ras aktivitet fører til aktivering af feedback-veje, der bredt nedregulerer tyrosinkinase signalering.

Et sæt SH2 sonder er korreleret med følsomhed lungekræft celler til EGFR TKI

Derefter bestemte vi, hvis SH2-domænet binding korrelerede med følsomheden af ​​lunge cancercellelinier for erlotinib, et lille molekyle EGFR-kinaseinhibitor. Sådanne domæner kunne tjene som grundlag for forudsigende biomarkører til at identificere tumorer forventes at reagere på TKI-terapi. SH2 profilering data blev undersøgt for mulig korrelation med IC

50 for erlotinib for hver cellelinje (IC

50 blev analyseret for denne undersøgelse under de samme dyrkningsbetingelser, der anvendes til SH2 profilering). Vi fandt, at bindingen af ​​13 prober svarende til 12 proteiner korrelerede i en statistisk signifikant måde med erlotinib IC

50 (fig. 4A). Disse omfatter Grb2 (vist i fig. 4B), ShcA, ShcA (PTB), p85B, Cis1, Arg, Eat2, Plcg1, Ptk70 /SRM, Fes, LNK, Tem6, og Btk. Netværk analyse bekræfter rapporter om direkte interaktion mellem EGFR og Grb2, ShcA, p85B, Cis1, Arg, Plcg1, Fes, og Btk (fig. 4C). Samlet resultaterne er i overensstemmelse med en model, hvor erlotinib følsomhed er forbundet med særlig stærk signalering fra aktiverede EGFR til kendte centrale nedstrømseffektorer, herunder MAPK (Grb2 og ShcA), PI3K /Akt (p85B), og PLCγ (PLCg1) veje.

SH2 domæne signal i ubehandlede celler blev sammenlignet med ln IC

50 for erlotinib. (A) domæner signifikant korreleret til ln IC

50. Negative korrelationer indikerer højere SH2 bindende i celler mere følsomme (lavere IC

50) til erlotinib. (B) Scatter plot af Grb2 SH2-domænet binding vs. ln (IC

50) til erlotinib. (C) Protein-protein-interaktion kort for EGFR og proteiner med SH2-domæner, hvis binding er signifikant korreleret med erlotinib følsomhed. Linjer angiver rapporteret direkte bindende interaktioner. (D) Heatmap repræsenterer korrelation af hvert domæne-specifikke bin til erlotinib følsomhed. Pearsons korrelation blev beregnet for hvert domæne-specifik bin tværs 22 cellelinier og ln (IC

50) for den tilsvarende cellelinje. Hver Heatmap placering repræsenterer korrelationskoefficient for at bin; grøn indikerer stigende SH2 signal med faldende IC

50 værdier (større følsomhed); rød indikerer stigende SH2 signal med stigende IC

50-værdier (se farve bar). Pilen angiver MW bin indeholdende EGFR familie proteiner. (E) Liste over de 46 domæne-specifikke beholdere med | korrelationskoefficient | . 0,5

Far-Western blotting også identificerede bands, der korrelerede med erlotinib følsomhed (Fig 4D . E). For et stort antal SH2-domæner, højere tilsyneladende binding til EGFR familiemedlemmer (pil på MW194 i fig. 4D) var forbundet med erlotinib følsomhed, mens CSK (som nedregulerer Src-familien af ​​kinaser) var enestående, idet lavere tilsyneladende binding af dens SH2 domæne til EGFR var forbundet med erlotinib følsomhed. Disse resultater var meget lig dem, der ses for EGFR mutation (fig. 3C), hvilket antyder, at forøget binding af RAS aktivatorer og nedsat binding af CSK til EGFR er forbundet både med EGFR mutation og erlotinib følsomhed. Mens der i princippet vores analyse kunne forveksles med den kendte sammenhæng mellem EGFR mutation og erlotinib følsomhed, vi indgår i vores analyse flere linjer, der er resistente over for erlotinib trods aktiverende EGFR mutationer (H1975, H820, H2279, og H1650), samt linjer med vægt EGFR, der er følsomme over for erlotinib (H292, H358, H1648, og H322). Det er især interessant, at CSK er den eneste SH2-domænet hvis binding til regionen af ​​blottet indeholdende EGFR fald i både EGFR mutantceller og i celler er følsomme for erlotinib. CSK regulerer negativt Src-familiekinaser, et centralt klasse af nonreceptor tyrosinkinaser [34]. Selvom CSK SH2 binding er relativt svag og forskelle mellem cellelinierne er beskedne, har vi bekræftet den statistiske signifikans af korrelationen i flere separate eksperimenter (Suppl. Fig. S2).

MET-aktivering er fanget af SH2 profilering

En potentiel styrke i SH2 profilering ville være at identificere tumorer, hvor flere hyperaktiveret tyrosinkinaser handle i fællesskab for at drive nedstrøms signalering, så vi undersøgt, om SH2 profilering kunne identificere cellelinjer, hvor MET og EGFR er co-aktiveret . Den MET kinase forstærkes i H820 og H1648 celler [20], [35], som klynge tæt sammen med både Rosette og langt-vestlige SH2 profilering (fig. 2). I langt Western blots, vi bemærkede også stærk binding af flere SH2 domæner herunder p85a til regionen ~148 kDa i H820 og H1648. Vi observerede en lignende bånd ved ~148 kDa for en række andre cellelinjer, herunder HCC827, H4006, H358, og H441 (fig. 5A). Mistanke dette bånd blev en markør for MET aktivering, vi testet dette ved sondering immunblots med en phosphospecifikt antistof, der specifikt genkender aktiveret MET (Suppl. Fig. S3A). Denne analyse, sammen med immunopræcipitation og inhibitor studier, viste, at phosphorylering af 148 kDa bånd var stærkt afhængig af MET-aktivering (dens tilstedeværelse er korreleret med aktiveret MET og blev inhiberet af MET-specifik TKI), men bandet var ikke MET-receptoren selv (Suppl. fig. S3B, C). Samtidig, vi indirekte undersøgte aktiviteten af ​​EGFR familiemedlemmer ved at kvantificere tyrosinphosphorylering af ~194 kDa regionen i immunblots, hvor EGFR familiemedlemmer fundet (Suppl. Fig. S3A). Immunpræcipitation og inhibitor undersøgelser viste, at de fleste af de SH2 bindende signal i denne region af blottene kunne tilskrives EGFR familiemedlemmer (Suppl. Fig. S3B, C).

(A) Far-Western blot af lunge cancercellelinjer probet med p85A SH2-domæner. Bemærk fremtrædende bånd på ~145 kDa i H820 (pil). (B, C) Hierarkisk klyngedannelse relateret til behandling og EGFR familie aktivering. Hierarkisk clustering baseret på roset data (B) eller langt-vestlige data (C), som det tidligere er vist i fig. 2. Farver indikerer cellelinjer, der co-klynge ved både roset og langt-Western-analyse (klynger 1, 2, 2b og 3). MET aktivering = immunreaktivitet med phosphospecifikt MET antistof. pTyr MW 194 = immunoreaktivitet med anti-pTyr i 194 kDa bin, som er en udlæsning af EGFR familie aktivering (se Suppl. Fig. S3). Cutoffs for markedsøkonomisk behandling aktivering: positiv, 50% højeste værdi i immunblotting med anti-MET pY1334 /1335; mellemprodukt, 25-50%; negativ, 25%. Cutoff for pTyr MW194: positiv, 25% højeste værdi i immunblotting med anti-pTyr; mellemliggende, 10-25%; negativ,. 10%

Vi derefter relateret MET og EGFR aktivering stat med SH2 profilering resultater. Bemærkelsesværdigt, uovervåget gruppering af både roset og langt-vestlige data viste, at de fleste cellelinjer med stærke MET aktivering klynge i en særskilt, stram gruppe (figur 5B . C). Både ved roset og langt-vestlige-baserede profilering, de fleste cellelinjer med stærke MET aktivering udgør en enkelt klynge (cluster 1), som er klart adskilt fra de andre cellelinjer. Alle disse cellelinjer også udviser stærk tyrosinphosphorylering af proteiner co-migrerer med EGFR, hvilket tyder på co-aktivering af MET og EGFR-signalering i denne gruppe. Oplysninger om markedsøkonomisk behandling og EGFR aktivering tilladt os også mere bredt sammenligne klyngedannelse resultater baseret på roset og langt-vestlige data. Denne sammenligning viste, at fire adskilte klynger var fælles for begge metoder (fig. 5B, C), der omfatter 15 ud af de 22 cellelinier (7 linjer klynge forskelligt, når de to metoder sammenlignes). Klynge 1 består af cellelinier med stærk aktivering af både EGFR og MET signalering. Klynge 3 består af cellelinier med mutant ras og lav EGFR og MET-aktivitet, som alle er erlotinib resistente. Cluster 2 kan inddeles i to undergrupper baseret på EGFR mutation status. Fra et klinisk perspektiv disse to undergrupper er det mest interessante: én består af linjer med mutant EGFR, der er erlotinib resistente (klynge 2b), og den anden omfatter flere linjer med vægt EGFR der er erlotinib følsomme

Næste vi. testet, om den binding af eventuelle individuelle SH2 domæne sonder var forbundet med MET aktivering. Ved roset analyse fandt vi, at bindingen af ​​46 SH2-domæner var signifikant associeret med MET phosphorylering (fig. 6A). Tilsvarende viste langt-Western-analyse et stort antal bånd, der er forbundet med MET phosphoryleringsstatus (fig. 6B). Antallet af SH2 domæner og markører, der korrelerer med MET aktivering er større end dem, der er forbundet med EGFR-mutation, hvilket tyder MET aktivitet har en mere dybtgående indvirkning på de samlede Ptyr mønstre end EGFR mutation.

(A) SH2 domæner korreleret med MET fosforylering (p 0,01, q 0,1). Bar plot af SH2 signal for høj og lav MET fosforylering. Middelværdi og standardfejl er vist. Til denne analyse “Low” omfatter både den foreløbige og lave /negative kategorier (fig. 5). (B) Far-vestlige domænespecifikke bands korreleret med MET fosforylering. Farvede felter angiver statistisk signifikans i Mann-Whitney test for forskelle (q 0,1). (C) H1648 celler blev udsat for kontrol (DMSO), 1000 nM erlotinib (E), 1000 nM PHA665752 (P), eller en kombination (E + P) i 3 timer og analyseret ved immunblotting. Lysater fra ubehandlede H820 celler tjente som kontrol for p-MET. Anti-β-actin blev anvendt til at bekræfte lig belastning. (D) Cellelevedygtighed for H1648 celler udsat for 60 nM erlotinib (E), 300 nM PHA665752 (P), eller en kombination (E + P).

At H1648 cellelinien grupperet stramt med H820 cellelinien, som tidligere var blevet fundet at have en aktiverende EGFR mutation sammen med MET amplifikation [20], foreslog, at H1648-celler kan svare til H820 ved, at nedstrøms signalering er drevet af både EGFR og MET. For at teste dette, vi udsættes H1648 celler til hæmmere af EGFR (erlotinib), MET (PHA665752) [36], eller kombinationen og undersøgt nedstrøms Akt og ERK aktivering (fig. 6C). Vi observerede beskedne reduktioner i phosphoryleret Akt og ERK som reaktion på enten inhibitor alene, men stærke hæmning ved dobbelt EGFR og MET inhibering. Virkningerne på cellelevedygtigheden afspejlede signaleringsresponser, som kombinationen af ​​begge midler resulterede i forøget inhibering af cellevækst (fig. 6D). Således globale Ptyr mønstre, analyseres ved SH2 profilering, forudsige MET aktivering og kan forudsige respons på MET TKI i disse cellelinjer.

forstyrrelse af globale Ptyr profiler af TKI’er

Vi næste brugte SH2 domæne profilering at undersøge ændringer i den globale tyrosinphosphorylering i celler udsat for TKI’er. Vores forventning var, at ændringer i SH2-bindende mønstre kunne korreleres med biologiske reaktioner på inhibitorer, og at prober, for hvilke binding faldt kraftigt i TKI-inhiberede celler blev sandsynligvis repræsenterer centrale veje for TKI handling. Fire lunge cancer cellelinjer (H292, H441, H358 og HCC827) blev kortvarigt udsat for erlotinib, en hæmmer af EGFR, eller dasatinib, et SRC familie kinase inhibitor, der hæmmer flere tyrosin og serin /threonin-kinaser [37], [38], [39]. Disse cellelinjer er meget forskellige i deres svar på disse TKI. I HCC827 celler med aktiverende EGFR mutation, begge inhibitorer inducerer apoptose; i H358 og H292 celler med wt EGFR, begge midler inducerer cellecyklus arrest; og H441 celler med wt EGFR er resistente over for begge midler ([9] og data ikke vist). Rosette og langt-vestlige SH2 profilering blev udført for alle fire cellelinjer i både behandlede og ubehandlede grupper.

Rosette bindende data (logge

2 fold ændringer i behandlede versus ubehandlede grupper) blev visualiseret i vandfald plots ranking ændringer i SH2-binding (fig. 7A, suppl. fig. S4A). I HCC827, erlotinib forårsagede fuldstændig kollaps af pTyr signalering, som store fald i SH2 binding observeres for næsten alle sonder. De væsentligste reduktioner i bindende skete for Grb2, Grap2, VAV2, og Vav1 SH2 domæner. Stort set blev observeret lignende ændringer på dasatinib behandling, hvilket tyder på en overlapning af mekanismen, men fold ændringer var mindre for de fleste sonder, i overensstemmelse med dens mindre potente virkninger på EGFR phosphorylering [9]. Svarende til HCC827, binding af næsten alle SH2 domæne sonder blev markant reduceret i TKI-behandlede H358 celler, og der var endnu større lighed mellem svarene på erlotinib og dasatinib. I H441, som er resistent over for TKI, erlotinib og dasatinib fremkalde lignende overordnede mønstre af forandring som H358. Men faldet i SH2 binding blev sløvet i H441 i forhold til H358 og HCC827, og bindingen af ​​et større antal SH2-domæner steg i nærværelse af begge inhibitorer sammenlignet med ubehandlede celler. Endelig viste H292, de mindst dramatiske ændringer i SH2 domæne bindende, og den overordnede mønster af respons på TKI behandling i denne cellelinie var meget forskellig fra de andre tre. Endvidere erlotinib og dasatinib profiler var mere forskellige i forhold til de andre testede cellelinjer. De samme prøver blev også analyseret ved langt-Western blotting under anvendelse af et begrænset sæt SH2 prober (Suppl. Fig. S4b). Fig.