PLoS ONE: Claudin-7 Er Ofte overudtrykt i Kræft i æggestokkene og Fremmer Invasion

Abstrakt

Baggrund

Claudins er tight junction proteiner, der er involveret i tight junction dannelse og funktion. Tidligere undersøgelser har vist, at claudin-7 ofte opreguleres i epitelial ovariecancer (EOC) sammen med claudin-3 og claudin-4. Her undersøger vi i detaljer udtrykket mønstre af claudin-7, samt dens mulige funktioner i EOC.

Metode /vigtigste resultater

I alt 95 æggestokkene vævsprøver (7 normal ovarie væv, 65 serøse carcinomer, 11 klare cellecarcinomer, 8 endometrioide carcinomer og 4 mucinous carcinomer) blev undersøgt for claudin-7-ekspression. I real-time RT-PCR-analyse, genet for claudin-7,

CLDN7

, blev fundet at være opreguleret i alle tumor vævsprøver de undersøgt. Tilsvarende immunhistokemisk analyse og western blotting viste, at claudin-7-protein blev signifikant overudtrykt i langt de fleste EOCs. Små interfererende RNA-medieret knockdown af claudin-7 i æggestokkene cancerceller medført betydelige ændringer i genekspression målt ved mikroarrays og valideret af RT-PCR og immunoblotting. Analyser af generne udtrykkes differentielt afslørede, at generne ændres som reaktion på claudin-7 knockdown var forbundet med veje impliceret i forskellige molekylære og cellulære funktioner, såsom cellecyklus, cellevækst og proliferation, celledød, udvikling og cellebevægelse. Gennem funktionelle eksperimenter in vitro, fandt vi, at både migration og invasion blev ændret i celler, hvor

CLDN7

var blevet slået ned eller overudtrykt. Interessant nok blev claudin-7-ekspression er forbundet med en nettostigning i invasionen, men også med et fald i migration.

Konklusion /Betydning

Vores arbejde viser, at claudin-7 er betydeligt opreguleret i EOC og at det kan være funktionelt involveret i ovariecarcinom invasion.

CLDN7

kan derfor repræsentere potentiel markør for ovariecancer påvisning kræft og et mål for terapi

Henvisning:. Dahiya N, Becker KG, Træ, WH III, Zhang Y, Morin PJ (2011) Claudin -7 ofte overudtrykt i Kræft i æggestokkene og Fremmer invasion. PLoS ONE 6 (7): e22119. doi: 10,1371 /journal.pone.0022119

Redaktør: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: 15. december, 2010; Accepteret: 16 Juni 2011; Udgivet: 15 juli, 2011

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Finansiering:. Denne forskning blev helt støttet af Intramural Research Program for National Institutes of Health, National Institute on Aging. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er den sjette hyppigste årsag til kræftdødsfald hos kvinder på verdensplan [1]. Kræft i æggestokkene er typisk diagnosticeret som fremskreden sygdom når behandlingsmuligheder er begrænsede, og prognosen meget dårlig. De sidste mange år har været vidne til en række fremskridt i vores forståelse af de molekylære mekanismer involveret i ovariecancer progression [2], [3], selv om meget af detaljerne forbliver ukendt. Blandt de gener, hvis ekspression er hyppigt ændringer i ovariecancer er sådanne kodende for claudin familien af ​​tight junctions proteiner [4] – [7]. Claudins rygraden i TJs og er derfor afgørende i epitelial opdeling og kontrollere opløst stof overførsel tværs cellemonolag [8] – [10]

I kræft, normal TJ funktion og struktur er typisk ændret, og TJs selv. ofte demonteres [11], [12]. Nylige genekspression profilering undersøgelser har rapporteret ændret ekspression af et antal TJ proteiner i forskellige cancertyper, herunder flere claudin proteiner [4], [6]. For eksempel er claudin-3 og claudin-4 forhøjet i æggestokkene, prostata, uterus og brystcancer, mens claudin-1 reduceres i brystkræft og prostatakræft.

Claudin-7 har vist sig nedreguleret i flere kræftformer herunder esophageal [13], [14], hoved og hals [15] og prostatakræft [16]. Tab af claudin-7 blev korreleret med dedifferentiering i flere forskellige kræftformer [16] – [19]. I brystkræft, blev også fundet claudin-7 udtryk, der skal reduceres, og omvendt korreleret med tumor kvalitet og metastatisk sygdom [17], [18], selv om der er tegn på, at claudin-7 kan blive re-udtrykt i metastaser [20], [21]. Det er derfor blevet foreslået, at tabet af claudin-7 er forbundet med et tab af celleadhæsion og forøget metastase [14], [17]. Men claudin-7 er også blevet vist, at være forhøjet i flere kræftformer. For eksempel er claudin-7 vides at være forhøjet i ovariecancer [22] – [27] samt andre maligniteter [28], [29]. Årsagen til de forskellige mønstre af ændringer observeret i forskellige kræftformer er i øjeblikket ukendt, men kan være relateret til de nøjagtige roller claudin-7 i forskellige maligniteter, hvilket gør belysning af disse roller et vigtigt mål.

I denne rapport , vi først evaluere claudin-7 ekspressionsniveauer i æggestokkene vævsprøver og cellelinjer under anvendelse af western blotting, RT-PCR, og immunohistokemi og finde, at claudin-7 udtrykkes bredt i ovarietumorer. Brug af mikroarrays, finder vi, at mange gener forskelligt udtrykkes efter

CLDN7

knockdown og analyse af disse gener tyder flere veje gennem hvilken

CLDN7

kan fungere i kræft i æggestokkene. Vi viser, at

CLDN7

Knockdown fører til et fald i phospho-Erk og en stigning i Raf-1-niveauer, hvilket tyder på en mulig vej for claudin-7-signalering i kræft i æggestokkene. Desuden finder vi, at

CLDN7

udtryk er forbundet med øget invasion, men faldt migration i flere cellelinjer giver en funktionel link til

CLDN7

til udtryk i ovariecancer.

Resultater

CLDN7

udskrift og protein niveauer er forhøjede i kræft i æggestokkene væv

Nyt arbejde viser, at der ud over den

CLDN3

og

CLDN4

gener,

CLDN7

ofte forhøjet i ovariecancer [22] – [26], [30]. For klart at definere

CLDN7

ekspressionsmønstre i kræft i æggestokkene, mikrodissekeres ovarietumorer af forskellige undertyper, samt cellelinier blev analyseret med real-time RT-PCR.

CLDN7

mRNA viste sig at være stærkt opreguleret i alle fire store ovariecancer undertyper (dvs. serøs, mucinous, klar celle, og endometrioide) sammenlignet med normale ovariale væv (figur 1A). Niveauet af overekspression varierede voldsomt, og viste sig at være alt fra 2-fold til 50.000 gange. Faktisk var 2-fold forøgelse i forhold slangelignende B observeret i 2 af de normalt ovarie kontrollerne under 50.000-fold overekspression blev set i 3 serøse ovariecancer væv.

CLDN7

er vidt udbredt i normale humane væv og dets transkript blev fundet i relativt høje niveauer i nyre, colon, lunge, tyndtarm, testis, placenta, spytkirtel, skjoldbruskkirtel, binyre, bugspytkirtel, prostata, lever , mave, ovarie og hud (figur 1B). På den anden side, muskler, hjerne, hjerte, milt, livmoder, blodleukocytter, knoglemarv, føtal hjerne, og føtal lever udtrykte lavere niveauer af

CLDN7

mRNA.

A. De angivne ovariecarcinom undertyper blev testet for

CLDN7

ekspression med RT-PCR, og værdierne er vist i forhold til slangelignende B-celler (en æggestokkene overflade epitelcellelinie immortaliseret med E6 og E7 [52]). B.

CLDN7

udtryk i normale væv. Følgende væv blev analyseret: 1, Muscle; 2, Brain; 3, Hjerte; 4, Nyre; 5, milt; 6, Lever; 7, Colon; 8, Lung; 9, tyndtarm; 10, mave; 11, testikel; 12, placenta; 13, spyt; 14, Thyroid; 15, binyre; 16, pankreas; 17, Uterus; 18, Ovary; 19, prostata; 20, Skin; 21, Plasma Blood Leukocytter; 22, knoglemarv; 23, Føtal Brain; 24, Fetal Lever. Niveauerne er vist i forhold til muskler og væv med højere niveauer end 4 gange, er angivet på grafen. C. Immunblotanalyse af claudin-7-ekspression i 2 normale ovariale væv (N1 og N2), 7 serøs (S1, S2, S3, S4, S5, S6, og S7), ét klart celle (C1) og en endometrioide (E1 ) ovariecarcinomer. I alt 29 prøver blev testet ved immunblotting og repræsentative eksempler er vist. D. Immunhistokemi af serøse ovariecarcinomer. Udvalgte ovariecarcinomer (S3, S4, S5, S6) og en normal ovarie prøve (N) er vist. Kræft i æggestokkene prøver farvet med claudin-7-antistof (CI-7) udviser stærk farvning i forhold til negative kontroller farvning mangler primært antistof (-).

For at undersøge claudin-7 protein niveauer i kræft i æggestokkene et panel af 29 primære kræft i æggestokkene prøver samt 4 normale ovariale væv blev undersøgt ved immunoblotting (figur 1C, tabel S1). Claudin-7 var til stede i alle normale ovariale væv, men blev fundet ved høje /moderate niveauer i 66% (19/29) af kræft prøver. Claudin-7 blev fundet udtrykt på et lavt niveau i 24% (7/29) af tilfældene, og var ikke påviselig i 10% (3/29).

Immunhistokemi (IHC) eksperimenter bekræftede, at claudin-7 blev udtrykt ved høje niveauer i ovariecancer (figur 1 D). Den IHC Undersøgelsen viste, at claudin-7 overekspression var begrænset til kræftcellerne og ikke indebar stroma. Derudover mens visse tumorer udviste signifikant membranfarvning (S3 og S4) viste andre reduceret farvning ved membranen og høje niveauer af cytoplasmatisk farvning.

CLDN7

er forhøjet i æggestokkene cancercellelinier og kan placeres på membranen eller i cytoplasmaet

for at evaluere

CLDN7

ekspression i cellelinjer, blev 7 cellelinier evalueret med RT-PCR og immunoblotting (figur 2A, B) .

CLDN7

afskrift blev ikke påvist i den ikke-maligne overflade epitel line HOSE-B, men blev fundet i alle de æggestokkene kræftceller, undtagen UCI101 og OVCA432 (figur 2A). Tilsvarende blev claudin-7-proteinet ikke påvist i slangelignende B, men var til stede i de fleste ovarian cancer cellelinjer (men ikke i HEY og UCI101) (figur 2B). Interessant, viste HEY celler af høj

CLDN7

mRNA niveauer, men lavt protein niveauer, mens OVCA432 udstillet meget lav

CLDN7

transkriptniveauer, men høj claudin-7 proteinekspression. Disse data viser, at mens claudin-7 transkription fastholdes i cellelinjer, kan claudin-7 proteinniveauer reguleres gennem post-transkriptionelle mekanismer.

A. Claudin-7 immunblotting afslører høje niveauer af udtryk i de angivne æggestokkene kræftceller. B. RT-PCR-analyse af

CLDN7

mRNA i cellelinjer. C. Immunofluorescens af udvalgte cancercellelinier viser stærk claudin-7-ekspression i cellen krydset i BG-1, OVCA433, OVCA420 og OVCA432 samt punktformig cytoplasmatisk farvning i BG-1 og OVCA420. Claudin-7 blev påvist med et anti-claudin-7-antistof og visualiseret med sekundært antistof konjugeret til Alexa Fluor. Kerner af celler blev modfarvet med DAPI. Billeder blev fusioneret til at bestemme korrekt lokalisering.

Brug immunfluorescens blev claudin-7 farvning fundet lokaliseret overvejende på cellemembranen, med punktformet farvning i cytoplasmaet i æggestokkene kræftcellelinjer BG-1, OVCA420 og OVCA433 (figur 2C). I OVCA432, vi også observeret membran farvning, men lidt udtryk i cytoplasmaet.

Genekspression ændrer følgende

CLDN7

knockdown i æggestokkene cancerceller

For at undersøge de mulige roller

CLDN7

i kræft i æggestokkene, undersøgte vi genekspression ændringer efter

CLDN7

knockdown. Disse Knockdown eksperimenter blev udført i cellelinier OVCAR-2 og OVCA420, som begge udviser moderate endogene niveauer af claudin-7-ekspression (figur 3A).

CLDN7

siRNA behandling ført til en betydelig reduktion i claudin-7 protein 72 timer efter transfektion (figur 3A) og dette tidspunkt blev valgt til microarray analyse. I OVCAR-2-celler, som danner TJs i kultur,

CLDN7

knockdown fører til et fald i transepitel resistens (TER, et mål for TJ tæthed) og en ledsagende stigning i permeabilitet over monolaget (figur 3B). Dette viser, at

CLDN7

knockdown har en funktionel effekt på TJ i disse celler. I OVCA420 celler, der ikke udgør TJ i kultur, TER var ekstremt lav og forblev upåvirket af

CLDN7

knockdown (figur 3B). I overensstemmelse med dette fund, permeabilitet var også upåvirket af

CLDN7

knockdown.

A. Immunoblotanalyse af OVCAR-2 og OVCA420 celler efter

CLDN7

knockdown i 72 timer. B. Virkninger af

CLDN7

knockdown på TJ og permeabilitet. Transepithelial modstand (TER) blev målt på flere tidspunkter efter

CLDN7

knockdown. Permeabilitet blev målt ved at vurdere evnen af ​​fluorescein-isothiocyanat-dextran (40 kDa) til at krydse monolaget. Fluorescensmålinger afspejler monolag permeabilitet og resultaterne spejle TER målinger. Eksperimenter blev udført tredobbelt, og resultaterne er vist som gennemsnit +/- S.E.M. En stjerne (*) angiver en p-værdi 0,05, og en dobbelt stjerne (**), en p-værdi 0,01. C. Hierarkisk klyngedannelse analyse af genekspression efter

CLDN7

knockdown i begge cellelinier. Den grønne farve repræsenterer nedregulering, mens rød repræsenterer opregulering. I alt 20 klynger af gener udviser distinkte mønstre blev identificeret.

Microarray analyse blev anvendt til at undersøge virkningerne af

CLDN7

knockdown på genekspression i både OVCAR-2 og OVCA420 celle linjer. Clustering analyse viste flere mønstre af ændringer efter

CLDN7

knockdown og disse mønstre var repræsenteret med 20 forskellige klynger af gener som identificeret ved ukontrollerede mønster klyngedannelse ved hjælp af JMP software (figur 3C).

CLDN7

var den eneste gen i klynge 3 og som forventet var stærkt nedreguleret i begge cellelinier. Af de 1327 gener udtrykkes forskelligt i de to linjer (tabel S2), 297 (200 opreguleres og 97 nedreguleret) blev delt af OVCAR-2 og OVCA420 (figur 4). Dette repræsenterer en 23% overlapning af alle de differentielt udtrykte gener, et tal meget højere end forventet tilfældigt alene (p 0,001). I OVCAR-2, blev i alt 553 gener opreguleres og 415 blev nedreguleret og OVCA420 blev 404 gener opreguleres og 252 blev nedreguleret. De 20 bedste gener opreguleres og nedreguleret i hver cellelinje (samt i begge samtidig) er anført i figur 4.

I Venn-diagram, numre i rød repræsenterer gener opreguleres og numre i grøn repræsenterer gener nedreguleret. De 20 bedste gener i hver kategori er angivet i tabellen nedenfor Venn-diagram.

For at validere og udvide microarray data, 15 gener, der er blevet omformet betydeligt ved

CLDN7

knockdown i en eller begge cellelinier, blev valgt til validering af RT-PCR-analyse (figur 5). Mens klappen ekspression syntes at være undervurderet af microarray analyse, real-time PCR bekræftede tendenserne for alle de testede gener (figur 5A, B). Desuden protein niveauer for flere af disse gener (

CA12

,

RRAS2

,

PRSS8

,

ApoE

,

AGT

,

SPRR3

, og

CLDN7

) blev testet på forskellige tidspunkter efter

CLDN7

knockdown (figur 5C). Resultaterne af disse forsøg var i overensstemmelse med de observerede ved RT-PCR ændringer. Samlet vores data viser en fremragende korrelation mellem de opdaget af mikroarrays og de tilsvarende protein ekspressionsniveauerne ændringer.

A. Fold ændringer i forskellige angivne gener i OVCA420 og OVCAR-2-celler efter

CLDN7

knockdown. B. RT-PCR validering af generne, der er vist i (A). C. Immunoblotting analyse af udvalgte kandidater på forskellige tidspunkter efter

CLDN7

knockdown. GAPDH kontrol blev inkluderet for at bekræfte ens belastning på alle baner.

Pathway analyse

Brug Ingenuity Pathway Analysis (IPA), vi analyserede veje og mulige funktioner i forbindelse med genekspression ændringer efter

CLDN7

knockdown. Mange af de øverste netværk identificerede involveret kræft, cellulær vækst og spredning, men de var ikke klart bevaret mellem cellelinier (Tabel S3). Interessant, “integrin signalering” blev fundet i begge cellelinier blandt de væsentligste kanoniske veje identificeret (tabel S3). De øverste biologiske funktioner inkluderet en række forskellige funktioner, såsom cellulær vækst og celledød, og interessant nok cellulær bevægelse. De fysiologiske systemer konstateret, var hæmatologiske og immunreaktion, samt bindevæv udvikling (Tabel S3). Gene ontologi analyse af ændrede gener identificerede væsentlige kategorier såsom “strukturel molekyle aktivitet”, “signal transducer aktivitet”, “transskription regulator aktivitet”, “oversættelse regulator aktivitet” og “transporter aktivitet” (tabel S4).

de mulige funktionelle relationer mellem de forskellige differentielt udtrykte gener blev derefter bestemt ved anvendelse af en række fremgangsmåder. De 5 mest betydelige fælles Kegg veje (som bestemt ved Webgestalt) var “regulering af aktincytoskelettet”, “kontaktpunkt vedhæftning”, “MAPK signalvejen” og “insulin signalvejen”. Tabel S5 liste alle veje identificeret. De øverste gener af de 5 mest betydningsfulde veje anført ovenfor blev anvendt til at søge i Pathway Studio database for kendte protein-protein interaktioner (figur 6A). Tabel S6 angiver de protein-protein-interaktion detaljer og deres tilsvarende referencer. Interessant en af ​​de mest fremtrædende veje identificeret gennem denne fremgangsmåde var den RAS-RAF-MAPK-vejen (figur 6A). Vi studerede derefter denne vej i OVCA420 celler ved at undersøge Erk og Raf-1-ekspression og phosphorylering i disse celler (figur 6B). Claudin-7 knockdown ført til en stigning i phosphoryleret Raf-1 (Ser-338), som blev afspejlet af en stigning i den samlede Raf-1 ved hvert tidspunkt, hvilket tyder på, at ja denne vej kunne blive påvirket af claudin-7. ERK1 /2-niveauer blev ikke påvirket af claudin-7 knockdown, men phosphoryleret Erk udstillede et lille fald, især på senere tidspunkter.

A. Pathway Studio analyse. Direkte interaktioner af 33 signifikant opreguleret (rød opadgående pil) eller nedreguleret (grønne nedadgående pile) gener er vist. Legenden om de forskellige typer af interaktioner vises under kortet. B. Immunblotanalyse af Erk1 /2, phospho-Erk1 /2 (p-Erk) og Raf-1 og phospho-Raf (Ser-338) i OVCA420 på angivne tidspunkter efter

CLDN7

knockdown.

Claudin-7 protein-ekspression er associeret med celle invasion, men omvendt korreleret med migration

Fordi vores gen ovenstående analyse afslører celle bevægelse som en funktion muligvis påvirket af

CLDN7

, besluttede vi at teste de mulige roller

CLDN7

i ovariecancer celle migration og invasion. Vi udførte først forbigående siRNA-medieret knockdown af

CLDN7

udtryk i to æggestokkene kræft cellelinier (OVCAR-2 og OVCA420) og testet migration ved hjælp af Oris cellemigrationsassay.

CLDN7

knockdown ført til en reproducerbar forøgelse af cellemigrering i begge cellelinier ved hver gang testet punkt (figur 7A). Celleinvasion blev derefter evalueret under anvendelse af en Boyden kammer assay og som vist i figur 7B, inhibering af claudin-7-ekspression i OVCAR-2 og OVCA420 celler reducerede signifikant invasive potentiale af disse celler. For yderligere at bekræfte rolle claudin-7 i invasionen, blev claudin-7 overudtrykt i OV-90-celler (som mangler endogene claudin-7 udtryk) og fandt, at en stabil overekspression af dette protein ført til en øget invasion i forhold til mocktransfekterede celler eller forældrenes OV-90-celler (Figur 7C).

A. Migration analyser i OVCAR-2 og OVCA420 celler. Migrationen af ​​celler med

CLDN7

slået ned (mørke søjler) eller kontrol celler (hvide søjler) blev målt på forskellige tidspunkter point efter begyndelsen af ​​analysen. B. Boyden kammer invasion assay af OVCAR-2 og OVCA420 celler med og uden

CLDN7

knockdown. Antallet af indtrængende celler blev målt hver time i 6 timer. C. Invasion analyser i en model af

CLDN7

overekspression. To stabile linjer, OV90-CLDN7 og OV90-CiNeo samt utransficerede parentale OV90 celler blev brugt til at teste ændringer i invasion følgende

CLDN7

overekspression. For alle resultaterne vist i denne figur, blev udført forsøgene i tre eksemplarer og resultaterne er vist som middelværdi +/- S.E.M. En stjerne (*) angivet en p-værdi 0,05, og en dobbelt stjerne (**), en p-værdi. 0,01

Diskussion

Vores data viser, at

CLDN7

er forhøjet ved både mRNA og protein niveauer i de fleste kræft i æggestokkene væv og cellelinier. Ved western analyse, primære ovariale tumorvæv udviste variabel ekspression af claudin-7 spænder fra moderat til høj ekspression i 66%, lav i 24%, og ikke påvises i 10% tumor vævsprøver. Årsagen til denne variation er uklar, da den transkriptionelle regulering af

CLDN7

forbliver stort set ukendt. Interessant nok har hypermethylering være impliceret i nedreguleringen af ​​

CLDN7

ekspression i brystcancer [17] og to transkriptionsfaktorer, TCF-4 og Sox9, har vist sig at samarbejde

CLDN7

undertrykkelse i colonceller [31]. Det vides ikke, om disse mekanismer er involveret i

CLDN7

regulering i kræft i æggestokkene, men disse muligheder er i øjeblikket under efterforskning.

Vi finder, at

CLDN7

er forhøjet i alle større undertyper af kræft i æggestokkene: serøs, endometrioide, klar celle og mucinøs. Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere microarray data [22], [26] og IHC eksperimenter [27], [30] viser, at CLDN7 typisk overudtrykt i epitelial kræft i æggestokkene. Faktisk viste en tidlig undersøgelse, claudin-7 overudtrykkes i alle epitelial ovariecancer undertyper, men er ikke overexpresssed i sex ledning og stromale tumorer [23]. Desuden er en detaljeret analyse af Tassi et al. [24] har vist, at

CLDN7

er universelt opreguleret i epitelial ovariekræft på både mRNA og protein niveauer. Vores undersøgelse viser også overekspression i de mest almindelige epitelial ovariecancer undertyper (serøs, klar celle, endometrioide, og mucinøs) ved både mRNA og protein niveauer ved hjælp QRT-PCR, IHC, og immunblotting. Brugen af ​​immunblotting og QRT-PCR giver os mulighed for at vise, at mRNA-niveauer og protein niveauer ikke altid korreleret, hvilket tyder på post-translationel regulering af claudin-7 i kræft i æggestokkene.

Interessant, mens vi fandt, at de fleste claudin -7 farvning blev lokaliseret til membranen, flere ovariecancer prøver udviste stærk cytoplasmatisk farvning (figur 1D). Den omstændighed, at claudin proteiner kan findes i cytoplasmaet er blevet rapporteret og især er der observeret punktformig cytoplasmatisk farvning af claudin-7 i ovariecancer [24]. De mekanismer og årsager til claudin cytoplasmatisk lokalisering fortsat uklare, men flere linjer af beviser tyder på, at phosphorylering af claudins kan påvirke deres lokalisering. For eksempel har mutation af en PKA phosphoryleringssite i claudin-3 blevet vist at føre til en øget cytoplasmatisk lokalisering i ovariecancer [32]. Tilsvarende blev claudin-4 sig at være phosphoryleret af proteinkinase C, og denne phosphorylering blev fundet at føre til translokationen af ​​claudin-4 fra membranen til cytoplasmaet og et fald i TJ funktion [32]. Claudin proteiner er også kendt at være reguleret af palmitoylering, som claudin-14 palmitoylering har vist sig at være afgørende for dets rette lokalisering [33]. Det er i øjeblikket uklart, om claudin-7 kan ændres, og om ændringer kan påvirke dens lokalisering.

overekspression af claudins i kræft tyder på, at claudins kan have funktionelle roller i tumorigenese. Flere grupper har undersøgt de mulige roller claudin-7 i kræft. Claudin-7 er blevet foreslået at være involveret i reguleringen af ​​prostata specifikt antigen (PSA) [34], eventuelt gennem interaktion med junktionel adhæsionsmolekyle A (JAM-A) [35]. Claudin-7 er også blevet rapporteret at danne et kompleks med EpCAM-tetraspanin som forstyrrer EpCAM-medieret celle adhæsionsegenskaber og øger modstanden mod apoptose [36] – [38]. Ja, i kolorektal cancer, EpCAM og claudin-7 findes i samarbejde med tetraspanins CD9 og /eller CO-029 og fremme metastase dannelse [37]. Derudover EpCAM-

CLDN7

kompleks blev foreslået at have rolle i migration, spredning, apoptose modstand, metastaser, og tumorgenicitet [37], [39].

I forsøget på at samle yderligere spor angående

CLDN7

funktion i kræft i æggestokkene, vi undersøgte genekspression ændringer efter

CLDN7

knockdown. Vi antager, at nedregulering af

CLDN7

kan påvirke downstream veje berørt af dette protein og i sidste ende føre til udtryk ændringer i generne reguleret af disse veje. Mellem de to æggestokkene kræft cellelinjer studerede, vi identificerede i alt 1296 gener, der er blevet omformet betydeligt efter

CLDN7

knockdown. Blandt disse gener, 297 blev samtidigt fundet udtrykkes forskelligt i begge linjer. Analyse af disse gener ved hjælp Ingenuity Pathway Analysis, førte til identifikationen af ​​flere gen-netværk, der indeholder gener relateret til de funktionelle kategorier “kræft”, “celledød”, “cellecyklus”, “RNA handel”, “cellulær udvikling”, “celle signalering “,” cellulær vækst og proliferation “, og” cellulær bevægelse “. Fra Kyoto Encyclopedia of Gener og genomer (Kegg) pathway analyse, valgte vi de øverste 5 veje, der blev ændret i både OVCAR-2 og OVCA420 cellelinjer og genererede et protein-protein interaktion netværk kort for disse veje. Brug vej Studio, fandt vi direkte interaktioner mellem 33 markant opreguleres eller nedreguleres gener (Tabel S6). Interaktionen netværk viste en række gener, der har onkogene eller tumor- suppressor roller. F.eks RRAS2, som koder for et Ras-relateret GTPase med transformerende potentiale ligner H-, K- og N-Ras, er en velkendt onkogen og er blevet impliceret i patogenesen af ​​human cancer. De veje, der medierer RRAS2 tumordannelse er ikke veletableret, men phosphoinositid 3-kinase, p38 MAPK, og mTOR pathways har været impliceret [40]. Af særlig interesse, har RRAS2 og RRAS vist sig at fremme invasion via integrin signalering i bryst epitelceller [41].

Vi har tidligere vist, at ovarieepitelceller der udtrykker claudin-3 og -4 show øget invasionsevne

in vitro

[42], som blev medieret gennem MMP-2 overekspression. Tilsvarende i hepatocellulære carcinomceller, claudin-10 ekspression fremmet celleoverlevelse, motilitet, og invasivitet, medens matrixmetalloproteinase 2 (MMP2) blev opreguleret [43]. Imidlertid claudins har også vist sig at reducere invasion som claudin-4-ekspression blev associeret med en reduktion i invasivitet i bugspytkirtelkræftceller [44]. Reduceret ekspression af claudin-7 er blevet korreleret med tumorinvasion og metastase i pladecellecarcinom i spiserøret og i colorektal cancer [13], [45]. I denne undersøgelse fandt vi, at

CLDN7

knockdown ført til ændringer i ekspressionen af ​​gener associeret med forskellige funktioner, herunder migration /invasion. Især følge op på vej analyseresultater, viste vi, at Raf-1, der tidligere et gen involveret i celle migration [46], [47], blev opreguleret efter

CLDN7

knockdown (figur 6) . Erk-1 blev ikke fundet signifikant forhøjet i disse forhold, hvilket tyder på, at Raf-1 kan signalere gennem andre downstream veje som reaktion på

CLDN7

knockdown.

Baseret på vores udtryk data, vi så undersøgt de mulige roller

CLDN7

og fundet effekter på invasion og migration

in vitro

. Faktisk blev invasion kapacitet væsentligt reduceret efter

CLDN7

knockdown og omvendt, blev det konstateret forøget efter overekspression af

CLDN7

. Interessant, migration viste sig at være øget efter

CLDN7

knockdown (muligvis fordi en stigning i Raf-1), og disse tilsyneladende modstridende resultater (invasion vs migration) kan forklare tidligere observationer i marken. Faktisk har de præcise roller claudin om invasion forblev kontroversiel, da nogle forskere observere positive virkninger af claudins på invasionen og andre har fundet det modsatte. Siden claudin proteiner er kendt for at aktivere MMP’er [42], [48], men også have roller i celle-celle adhæsion [9] og i migration (som vist her), er nettoeffekten observeret kan repræsentere resultatet af disse modsatrettede effekter på invasion. Vores data tyder på, at mens

CLDN7

overekspression kan mindske migration, stigningen i invasionen på grund af andre faktorer (såsom øget MMP aktivering) er dominerende og fører til en netto positiv effekt på celle invasion i vores system. De nøjagtige mekanismer i

CLDN7

roller i celle migration og invasion er under efterforskning, men vores data kan forklare nogle af de uoverensstemmelser i litteraturen.

Sammenfattende finder vi, at

CLDN7

er forhøjet i langt størstedelen af ​​ovariecancere. Vi udførte microarray analyse for at identificere ændringer i genekspression forbundet med

CLDN7

knockdown i kræft i æggestokkene. Interessant, fandt vi at mange gener og pathways påvirket af

CLDN7

ekspression er involveret i cancer celle overlevelse, vækst og invasion. Invasion og migration analyser viste tydelige effekter af claudin-7 på den invasive opførsel af æggestokkene cancerceller. Vores microarray analyse giver flere mulige mekanismer, hvorved claudin-7 kan påvirke celle migration og invasion, og disse forskellige mekanismer er i øjeblikket ved at blive undersøgt. Ud over deres tight junction-funktion, kan claudin-7 spiller vigtige roller i en række signalveje, der er involveret i cancer, cellulær vækst, proliferation og cellecyklus. I betragtning af dets vigtige rolle i æggestokkene carcinogenese,

CLDN7

kan have et betydeligt potentiale i diagnostiske og terapeutiske anvendelser.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle menneske væv blev indsamlet gennem en IRB godkendt protokol (MedStar Research Institute IRB # 2003-103). Vævene blev indsamlet anonymt og denne protokol blev undtaget fra kravet om samtykke.

cellelinier og vævsprøver

Ovariecancerpatienter linjer anvendt i denne undersøgelse, BG-1, UCI-101, HEY, OV90, OVCA420, OVCA432, OVCA433, OVCAR-2, OVCAR-3, og OVCAR-5 er offentliggjort [49] – [51]. Alle assays blev udført tre gange.