PLoS ONE: Kirurgisk Stress ophæver Forudgående Protective T-cellemedieret antitumorimmunitet Førende til Postoperativ Cancer Gentagelse

Abstrakt

Anti-tumor CD8

+ T-celler er en afgørende faktor for den samlede overlevelse hos patienter efter kirurgisk resektion til faste maligniteter. Under anvendelse af en musemodel for cancer vaccination (adenovirus, der udtrykker melanom tumor-associeret antigen (TAA) -dopachrome tautomerase (AdDCT) og resektion resulterer i større kirurgiske stress (abdominal nefrektomi), viser vi, at kirurgisk stress resulterer i en reduktion i antallet af CD8

+ T-celle, som producerer cytokiner (IFNy, TNFa, Granzyme B) som reaktion på TAA. Denne effekt er sekundær til både reduceret proliferation og forringet T-cellefunktion efter antigenbinding. i en profylaktisk model, kirurgisk stress fuldstændigt ophæver tumor beskyttelse tillagt ved vaccination i den umiddelbare postoperative periode. i en klinisk relevant kirurgisk resektion model, havde vaccinerede mus gennemgår en positiv margin resektion med kirurgisk stress nedsat overlevelse sammenlignet med mus med positiv margin resektion alene. Præoperativ immunterapi med IFNa signifikant forlænger overlevelsen i kirurgisk stressede mus . Vigtigere, blev myeloid afledt suppressor celle (MDSC) befolkningstal og funktionsnedsættelse af TAA-specifikke CD8

+ T-celle ændres i kirurgisk stressede mus. Vore iagttagelser antyder, at cancer progression kan skyldes kirurgi-induceret suppression af tumor-specifikke CD8

+ T-celler. Præoperative immunterapier sigte på den prometastatic virkninger af cancer kirurgi vil reducere tilbagefald og forbedre overlevelsen i kræft kirurgi patienter

Henvisning:. Ananth AA, Tai LH, Lansdell C, Alkayyal AA, Baxter KE, Angka L, et al . (2016) Kirurgisk Stress ophæver Pre-eksisterende beskyttende T-cellemedieret antitumorimmunitet Førende til Postoperativ Cancer Gentagelse. PLoS ONE 11 (5): e0155947. doi: 10,1371 /journal.pone.0155947

Redaktør: Hiroyoshi Nishikawa, sonderende Oncology Research Clinical Trial Center, National Cancer Center, JAPAN

Modtaget: 9 oktober, 2015; Accepteret: 6 maj 2016; Udgivet: May 19, 2016

Copyright: © 2016 Ananth et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Terry Fox Research Institute, New Investigator Award (RCA); Canadiske Institutes of Health Research Fellowship (LHT); Canadiske Cancer Society Research Institute, Innovation og Innovation til Impact Grant (RCA)

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Betydningen af immun-overvågning ved styring udvækst af maligne celler har været kendt i årtier. Princippet om, at naturligt forekommende T-celler med antitumor potentiale findes i human cancer har ført til nye inden for cancer immunterapi. Tumorer selv, er imidlertid i stand til at kapre immunsystemet til at undertrykke immunforsvaret kontrol, at skabe et gunstigt miljø, ikke kun for den primære, men også for metastatisk udvækst. Sidstnævnte proces er blevet kaldt “systemisk anstiftelse” [1]. Forståelse denne immunosuppressiv tumor miljø og vende det med målrettede midler viser sig at være en meget vellykket behandling strategien [2].

Kirurgisk resektion er grundlaget for behandling for helbredende hensigt i solide maligniteter. Selv med komplet resektion, mange patienter udvikler lokalt recidiv eller metastaser og i sidste ende dø af deres sygdom [3-6]. akkumulerende beviser en sammenhæng mellem forekomsten af ​​CD8

+ effektor T-celler og forbedret prognose og overlevelse i et antal faste maligniteter, herunder bryst-, ovarie-, tyktarms-, nyrecellecarcinom, og malignt melanom [7-9].

Denne forening antyder, at tilstedeværelsen af ​​en robust anti-tumor immune respons, især anti-tumor CD8

+ effektor T-celler, kan forebygge eller fjerne minimal residual sygdom eller mikrometastaser efter komplet kirurgisk resektion af den primære tumor.

Vores gruppe og andre har vist, at den umiddelbare postoperative periode er en enestående modtagelig tid til udvikling af cancer tilbagefald metastaser [3, 4, 10]. Der er en række mekanismer foreslået at forklare denne effekt herunder udbredelse af tumorceller i kredsløbet [11], lokal og systemisk frigivelse af pro-angiogeniske og mitogene mediatorer (epidermal vækstfaktor og vaskulær endothelial vækstfaktor) [3, 10, 12 ] og dyb inhibering af cellemedieret immunitet [3, 10]. Vi har tidligere impliceret kirurgi-induceret suppression af naturlige dræberceller (NK) celler i udviklingen af ​​postoperative metastaser [3, 4] i valideret dyremodel af kirurgisk stress og metastaser [13].

Mens tidligere undersøgelser har rapporterede en reduktion i CD8

+ T-celler og nedsat cytokinsekretion som reaktion på ikke-specifik stimulering [14-17], har ingen udforsket arten af ​​virkningerne af kirurgisk stress på antigenspecifikke CD8

+ T-cellereaktioner de har heller ikke vist, ophævelsen af ​​en allerede eksisterende beskyttende anti-tumor CD8

+ T-celle respons. I dette manuskript, vi udforske virkningerne af kirurgisk stress på en beskyttende CD8

+ effektor T-celler medieret anti-tumor immunitet. For at opnå dette anvender vi en viral-vektor baseret tumor vaccine kaldet AdDCT. Dette er en replikationsinkompetent E1 /E3-deleteret human type 5 adenovirus (Ad), der udtrykker den humane Dopachrome Tautomerase (HDCT) genet i fuld længde [18] som et tumor-associeret antigen (TAA). Det er tidligere blevet vist, at profylaktisk vaccination AdDCT kan bibringe beskyttelse mod subkutant (sc) implanteret melanom i en CD8

+ T-celle-afhængig måde [18-21]. Vi leverer præklinisk

in vivo

resultater, der klart viser, at en større operation væsentligt kan dæmpe en allerede eksisterende immunrespons beskyttende T-celle efter kræft vaccination og give den hidtil ukendte anvendelse af præoperativ immunterapi at vende denne effekt.

Materialer og metoder

mus

C57BL /6, BALB /c, og CD1-nøgne mus blev købt fra The Jackson Laboratory (Bar Harbor). Dyrene blev opstaldet i patogenfrie forhold og alle undersøgelser var i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer på Animal Care Veterinary service facilitet i University of Ottawa (Ontario). Den canadiske Rådet om Animal Care og Animal Care udvalg fra University of Ottawa godkendt denne undersøgelse.

Generering af kirurgisk stress

Rutinemæssig perioperative pleje (herunder anæstesi og smertebehandling) og kirurgisk stress var udført som tidligere beskrevet [3, 13]. Kort beskrevet blev mus udsat for 2,5% isofluoran (Baxter Corp.) til induktion og vedligeholdelse af anæstesi. Kirurgisk stress blev induceret i mus ved en abdominal laparotomi (3-cm midtlinieincision) og venstre nefrektomi (Nx). Alle dyr, der gennemgår kirurgiske indgreb vil modtage pre og post-operative buprenorphin injektioner (0,05 mg /kg) administreret SC. Præoperativt, er mus injiceret SC 1 time før kirurgi. Postoperativt, er mus injiceret SC hver 8. time i 2 dage. Kropsvægt og andre aspekter af dyrs wellness registreres dagligt efter kirurgi (S1 tabel). Blod data indsamles ikke. Mus blev aflivet ved intraperitoneal (ip) injektion af natriumpentobarbital (65 mg /kg).

Cellelinjer

B16F10LacZ melanoma cellelinien blev opnået fra Dr. K. Graham (London Health Sciences, Ontario , oprindeligt fra American Type Culture Collection) og holdes fuldstændig DMEM. Cellerne blev resuspenderet i DMEM uden serum til intravenøs (iv) injektion gennem den laterale halevene. Tumorceller på 95% levedygtighed blev injiceret i en 0,1 ml volumen /mus

Vaccination af mus

Bedøvede mus blev vaccineret med 1×10

6 plaquedannende enheder (PFU) af. AdDCT (rekonstitueret i 100 pi PBS) eller PBS alene ved intramuskulær (IM) indsprøjtning i hvert lår (50 pi per låret).

profylaktisk vaccination tumormodeller

Mus blev vaccineret med AdDCT eller PBS på dag 0. På dag 7 blev mus injiceret med tumorceller enten sc eller iv foregående operation. Sc melanomtumorer blev etableret ved injektion af 3×10

5 B16F10lacZ celler i serumfrie medier på højre bagben slag; tumorstørrelse blev målt to gange om ugen og tumorvolumener blev beregnet ved hjælp af formlen 1/2 (L × B

2). Mus blev bestemt til at have nået endpoint når tumorvolumener nåede 1600mm

3. Systemisk formidling modeller blev podet ved 1×10

6 B16F10lacZ celler gennem halevenen iv administration. Tumorbærende lunger blev farvet med X-gal at visualisere tumor mikrometastaser som beskrevet tidligere [3].

Terapeutisk vaccination tumormodel

Mus blev injiceret sc med 1×10

5 B16F10lacZ celler i serumfrie medier på det højre bagben flanke på dag 0. på dag 7 blev mus behandlet med AdDCT eller PBS ved den angivne dosis (pfu). På dag 14 blev sc tumorer resekteret med en 2×2 mm positiv margen med halvdelen modtog yderligere kirurgisk stress i form af abdominal laparotomi og venstre nefrektomi. Tumor størrelse blev målt to gange om ugen og tumorvolumener blev beregnet ved hjælp af formlen 1/2 (L × B

2). Mus blev bestemt til at have nået endpoint når tumorvolumener nåede 1600mm

3. Til præoperativ IFNa behandling (R BD Pharmingen, 1 pg /ml tilsat efter 1,5 timers inkubation). Efter 6 timers inkubation blev celler behandlet med anti-CD16 /CD32 og celleoverfladeantigener blev mærket med fluorochrom-konjugerede antistoffer. Celler blev derefter permeabiliseret og fikseret med Cytofix /Cytoperm (BD Pharmingen) og farvet for intracellulære cytokiner: IFNy-PE (BD Biosciences), TNFa-PeCy7 (Biolegend) og Granzyme B-APC (eBioscience). Dataene blev erhvervet ved hjælp af en cyan-ADP 9 flowcytometer med Summit 4.3 software (Beckman Coulter) og analyseret med Kaluza 1.2 software (Beckman Coulter).

DCT-specifikke MHCI tetramer analyse og ELISpot

splenocytter blev behandlet med anti-CD16 /CD32 og mærket med PE-konjugeret DCT

180-188 peptid-MHC-i tetramer (Baylor College), PerCP-CD3, og FITC-CD8a (eBioscience) i 30 minutter i FACS puffer (1% PBS, 5% føtalt kalveserum, 2,5% Naz). For ELISpot analyser, det nøjagtige antal DCT-MHC-I tetramer

+ /CD8

+ T-celler blev beregnet ud fra flowcytometri andel resultater og tilsat til en IFNy ELISpot efter producentens instruktioner (Mabtech).

T-celle apoptose assay

Splenocytter blev behandlet med anti-CD16 /CD32 og celleoverfladeantigener blev mærket med PE-CD3 og FITC-CD8a (eBioscience). Cellerne blev derefter mærket med APC-AnnexinV og 7-AAD (BD Pharmingen) i 15 minutter og data blev erhvervet på Cyan-ADP (Beckman Coulter) inden for en time.

BrdU T-celle proliferation assay

Splenocytter blev restimuleret in vitro med peptider (2 pg /ml) ved 37 ° C i nærvær af brefeldin A (GolgiPlug; BD Pharmingen, 1 pg /ml tilsat efter 1,5 timers inkubation). Efter 3,5 timers inkubation blev cellerne mærket med BrdU (BD Pharmingen) og inkuberet i yderligere en time. Efter 6 timers inkubation blev celler behandlet med anti-CD16 /CD32 og celleoverfladeantigener blev mærket med PerCP-CD3 og PE-CD8a. Efter producentens anvisninger blev celler behandlet gennem en række permeabilizations og fikseringer og farvet for intracellulært FITC-BrdU.

MDSC-T-celle-suppression assay

T-celler blev isoleret fra miltene fra mus, der modtaget AdDCT vaccination 7 dage før høst. MDSCs blev isoleret fra miltene fra kontrol og kirurgisk stressede mus (18 timer efter kirurgi). T-celler blev positivt selekterede for brug CD90.2 mikroperler (Miltenyi Biotec) og MDSC var positivt udvalgt til anvendelse af myeloid-afledte Suppressor Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec), både efter producentens protokoller. Celler blev resuspenderet ved 1 x 10

6 celler /50 pi cRPMI og samdyrket ved forskellige MDSC: T-forhold (0,25: 1, 0,5: 1, 1: 1). CD3 /CD28 Dynabeads (Life Technologies) blev sat til kulturen i et 1: 1 bead- til-celle-forhold i tillæg til 30 U /ml rekombinant muse-interleukin-2 som pr fabrikantens anbefalinger. Celler blev derefter dyrket i 4 dage i en CO

2 inkubator ved 37 ° C. Efter 4 dage blev cellerne overført til en V bundplade med 96 brønde for re- stimulation med DCT-peptid under anvendelse af protokollen anført ovenfor for intracellulær farvning.

Statistisk analyse

Envejsanalyse variansanalyse (ANOVA) og Bonferonni post hoc test blev udført for alle oplysninger. En P-værdi 0,05 blev betragtet som signifikant. Statistisk signifikans af Kaplan-Meier-overlevelseskurver blev bestemt ved hjælp af log-rank test.

Resultater

Kirurgisk stress svækker antitumor immunitet resulterer i lunge metastase og subkutane tumor udvækst

For at bestemme virkningerne af kirurgisk stress på TAA-specifikke T-celler, udviklede vi et AdDCT vaccination kirurgi model. Ved hjælp af vores etablerede B16F10lacZ melanom lunge metastase kirurgi model [3, 13], vi administrerede neoadjuverende AdDCT fulgte 7 dage senere med tumor podning ved iv injektion og større operation med en laparotomi og nephrectomistatus (figur 1a). Vaccination med 1×10

6 pfu AdDCT tillægges en 3 gange formindskelse i metastaser i sammenligning med PBS-behandlede kontrolmus. Men vaccinerede mus udsat for større kirurgiske indgreb udviste en 5 gange stigning i metastaser i sammenligning med vaccination alene (figur 1b). Dette antyder, at operation dæmper antitumor immunitet af AdDCT vaccination.

(a) B6-mus blev administreret med neoadjuverende AdDCT på 1 × 10

7 pfu. På dag 7 blev mus udfordret iv med 3×10

5 i B16F10lacZ celler for at etablere syngene lunge melanom metastaser, og derefter gennemgik abdominal laparatomi og nefrektomi (Nx) eller ingen kirurgi. (B) Lunger ekstraheret på dag 10 (3 dage efter tumorcelleinokulering) fra PBS, Nx, AdDCT, AdDCT + Nx og kvantificeres ved X-Gal-farvning. N = 5 /gruppe. (C) B6-mus blev vaccineret med AdDCT, så udfordret på dag 7 med fm 1×10

6 B16F10lacZ celler, derefter blev opereret eller ingen kirurgi. (D) Tumorvolumen af ​​behandlet B16F10lacZ sc tumorbærende mus blev overvåget dagligt. (E) Overlevelse af behandlet B16F10lacZ sc tumorbærende mus er vist i Kaplan-Meier-kurver. Procentdel af levende mus er angivet. N = 7-8 /gruppe, (* P 0,05, *** P 0,001).

Det har tidligere vist, at iv injicerede melanomceller er mere modtagelige for NK cellemedieret lysis i sammenligning med SC melanom, i vid udstrækning skyldes forskelle i tumormikromiljøet og immuncellepopulationer proportioner [22, 23]. For at udelukke en medierende rolle for NK-celler, vi udførte tumor udfordring ved hjælp af en sc injektion af B16F10lacZ tumorceller i hind flanke (Fig 1c). I AdDCT-vaccinerede mus, der ikke blev udsat for kirurgisk stress, 100% afviste en efterfølgende tumor udfordring mens alle de mus, der undergik en større operation på tidspunktet for tumor udfordring udviklet flanke tumorer med en hastighed svarende til kontrol un-vaccinerede mus (fig 1d og 1e). Desuden observerede vi dæmpningen af ​​allerede eksisterende anti-tumor-immunitet ved kirurgisk stress i en CT26 kolorektal cancer model (S1 Fig), tyder på, at kirurgi-induceret dysfunktion af tumor-specifik immunitet er ikke eksklusivt til vores melanom model. Tilsammen disse resultater tyder på, at kirurgisk stress i AdDCT-vaccinerede mus ophæver en beskyttende anti-tumor immunrespons.

Kirurgi induceret ophævelse af beskyttelse, som AdDCT vaccination er afhængig af CD3

+ T-celle

for at demonstrere en medierende rolle for det adaptive immunsystem i kirurgi-induceret forringelse af beskyttende AdDCT vaccination, vi gentog sc tumor udfordring model i CD-1 nøgne mus, der er mangelfuld i T og B-celler, men bevarer NK-celle funktion [24] (figur 2a). I nøgne mus, har AdDCT vaccination ikke beskytte mus danner en tumor udfordring og kirurgisk stress resulterede ikke i en betydelige forskelle i overlevelse i AdDCT-vaccinerede mus (figur 2b). Dette antyder, at det adaptive immunsystem er afgørende for de beskyttende virkninger af AdDCT vaccination og de negative virkninger af kirurgisk stress på tumor udvækst i vores model. At etablere T-celler som mægler for både tumor beskyttelse efter AdDCT-vaccination og for modtagelighed for tumorvækst efter større operation, vi adoptivt overført 1,0×10

7 renset milt CD3

+ T-celler fra AdDCT-vaccinerede mus og fra kirurgisk understregede AdDCT-vaccinerede mus i naive recipientmus. En dag efter T-celle overdragelse, blev recipientmus udfordret med sc B16F10lacZ tumorer (figur 2c). Overlevelse blev overvåget over tid. De mus, der modtog T-celler fra vaccinerede donorer var 90% beskyttet mod B16 tumorbelastning, mens dem, der modtog det samme antal T-celler fra kirurgisk stressede vaccinerede donorer alle udviklede progressive flank tumorer (figur 2d). Ved at overføre kirurgisk understregede T-celler og genskabe effekten af ​​kirurgi på beskyttende vaccination, vi konstateret, at den skadelige virkning af kirurgi på AdDCT vaccination er T-celle medieret.

(a) CD-1 nøgne mus blev vaccineret med en × 10

7 pfu AdDCT. På dag 7 blev mus udfordret med sc B16F10lacZ tumorer og derefter undergik kirurgi eller ingen kirurgi. (B) Overlevelse af behandlet B16F10lacZ tumorbærende CD-1 nøgne mus er vist i Kaplan-Meier-kurver. Procentdel af levende mus er angivet. N = 7-8 /gruppe. (C) B6-mus blev vaccineret med 1×10

7 pfu AdDCT og på dag 7, mus undergik kirurgi eller ingen kirurgi. På dag 8 blev milt CD3

+ T-celler isoleret og overført til naive recipient B6 mus. På dag 9 blev recipientmus udfordret med SC B16F10lacZ tumorer. (D) Overlevelse af behandlede B16F10lacZ tumorbærende mus er vist i Kaplan-Meier kure. Procentdel af levende mus er angivet. N = 7-8 /gruppe.

Kirurgisk stress resulterer i et fald i CD8

+ T-celle cytokinproduktion som reaktion på TAA

Da kirurgisk stress resulterede i dæmpning af T-celle medieret clearance af tumorceller

in vivo

, vi spørgsmålstegn ved, om AdDCT induceret T-celle cytokinproduktion som respons på TAA (DCT) er påvirket af kirurgi. Under anvendelse af samme model af neoadjuverende AdDCT vaccination efterfulgt af inokulation af tumor og større kirurgisk stress 7 dage senere, vi evaluerede cytokinsekretion i DCT-specifikke CD8

+ T-celler isoleret fra milten ved 18 timer efter kirurgi. Vi observerede et signifikant fald i andelene af CD8

+ T-celler secernerer IFNy (fig 3a og 3b), TNFa (figur 3c) og Granzyme B (figur 3d) som svar på DCT peptidstimulering og en reduktion i antallet af CD8

+ T-celler secernerer IFNy som respons på ikke-specifik stimulering med PMA og ionomycin (S2 fig). Endvidere udførte vi en IFNy ELISpot-assay for at underbygge vores flowcytometri resultater og fandt en lignende dæmpning i antallet af DCT-specifikke CD8

+ T-celler producerer IFNy følgende større kirurgi (Fig 3e og 3f). Disse data antyder, at kirurgisk stress resulterer i et fald i antallet af TAA-specifikke CD8

+ T-celle-secernerende cytokiner upon DCT peptidstimulering.

B6 mus modtog neoadjuverende vaccination med 1 × 10

7 pfu AdDCT. På dag 7 blev mus udfordret iv med 3×10

5 i B16F10lacZ celler for at etablere syngene lunge melanom metastaser, og derefter blev opereret eller ingen kirurgi. På dag 8 blev musene aflivet, og gennemgik milt immuncelle vurdering. Procentdel af DCT-specifik (a) IFNy

+, (c) TNF

+, (d) Granzyme B

+ CD8

+ T-celler reagerer på DCT

180-188 peptid eksponering . (B) repræsentant flowcytometri dot plots af DCT-specifikke IFNy

+ /CD8

+ T-celler reagerer på DCT-peptid eksponering

180-188. (E) Kvantificering af SFU i IFNy ELISpot-assay. (F) Tilsvarende repræsentative billeder af IFNy ELISpot assay af CD8

+ T-reagere på DCT

180-188 peptid eksponering. (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001)

Kirurgisk understregede T-celler viser reduceret cytokinsekretion, spredning og tumor infiltration som reaktion på TAA

Tidligere rapporter har påvist en samlet reduktion i CD8

+ T-celler efter kirurgi [10, 14]. Ved hjælp af vores model af AdDCT vaccination efterfulgt af en større operation 7 dage senere, vi viste også en reduktion i de globale antal CD8

+ T celler isoleret fra milten 18 timer efter operation (figur 4a). Denne reduktion var ikke sekundær til øget celledød som målt ved AnnexinV og 7AAD-farvning (fig 4b), men var associeret med en reduktion i T-celleproliferation som målt ved BrdU-inkorporering efter DCT-peptidstimulering (figur 4c). Dernæst har forsøgt at bestemme, om den nedsatte antal CD8

+ T-celler udskillende cytokin som respons på DCT var sekundær til et fald i andelen af ​​DCT-specifikke CD8

+ T-celler (dvs. T-celler kan binde DCT ) eller en funktionsnedsættelse af cytokinsekretion efter DCT-stimulering. Brug af et MHC klasse I DCT-specifik tetramer, demonstrerede vi ingen reduktion i andelen af ​​DCT-specifikke CD8

+ T-celler efter kirurgisk stress i vaccinerede mus (figur 4d og 4e). For at bekræfte, at DCT-specifikke CD8

+ T-celler blev funktionelt forringet efter kirurgi, vi belagte lige mange DCT tetramer-bindende CD8

+ T-celler i en ELISPOT følgende DCT peptidstimulering og observeret en signifikant reduktion i IFNy sekretion (figur 4f). Derudover vurderede vi kinetikken af ​​IFNy-ekspression i DCT-specifikke CD8

+ T-celler på forskellige tidspunkter efter vaccination og kirurgi og observerede en restitutionsperiode på T-celle-funktionalitet mellem postoperativ dag (POD) 7 og POD 28 ( S3a og S3b fig). Den observerede inddrivelse af T-celle funktion på POD 28 korrelerer også med et immunrespons antitumor som kirurgi-genvundet mus var i stand til at afvise en B16lacZ sc tumor udfordring lige så hensigtsmæssigt som ingen kirurgi kontroller (S3C Fig). Endelig vurderes vi, om CD8

+ T-celle migration ind i tumoren var påvirket af kirurgisk stress. For at løse dette, vi vaccineret mus med AdDCT fulgte 7 dage senere ved sc injektion af tumorceller blandet med en matrigel stik og større operationer. Matrigel plugs blev bedømt for lymfocytter 3 dage efter implantering. Vores data viser, at CD8

+ T-celler blev reduceret med halvdelen i tumorer i kirurgisk stressede mus, hvilket indikerer, at kirurgi påvirker tumor immun infiltration (figur 4g). Taget sammen antyder disse resultater, at en større operation resulterer i en samlet reduktion i CD8

+ T-celler, som ikke er sekundær til øget celledød, men er associeret med inhibering af proliferation. Andelen af ​​DCT-specifikke T-celler ikke reduceres i forhold til den globale nummer, men de resterende DCT-specifikke T-celler er dysfunktionel i deres evne til at secernere IFNy som respons på tumorantigen. Endelig er CD8

+ T-celle infiltration af tumorer også forringet efter kirurgisk stress.

B6 mus modtog neoadjuverende vaccination med 1 × 10

7 pfu AdDCT. På dag 7 blev mus udfordret iv med 3×10

5 i B16F10lacZ celler for at etablere syngene lunge melanom metastaser, og derefter blev opereret eller ingen kirurgi. På dag 8 blev musene aflivet, og gennemgik milt immuncelle vurdering. (A) Samlet antal CD8

+ T-celler, (b) samlet antal Annexin V

– /7-AAD

– /CD8

+ T (live), Annexin V

+ /7-AAD

– /CD8

+ T (tidlig apoptose), Annexin V

+ /7-AAD

+ /CD8

+ T (sent apoptose) celler, (c ) procentdel af BrdU

+ /CD8

+ T celler, (d) procentdel og (e) repræsentative dot plot af DCT-tetramer

+ /CD8

+ T-celler reagerer på DCT

180-188 peptid eksponering, (f) kvantificering af SFU fra DCT-tetramer

+ /CD8

+ T-celler reagerer på DCT

180-188 peptid eksponering i IFNy ELISpot assay. (G) Samlet antal CD8

+ /CD3

+ T celler pr mg tumor fra B6-mus udfordret med sc B16F10lacZ tumorer blandet med matrigel på dag 7. På dag 10, Matrigel propper blev fjernet og vurderet for immun celleinfiltration ved flowcytometri. N = 4-6 /gruppe. (* P 0,05, *** P 0,001).

Kirurgi forringer vaccine funktion i en terapeutisk B16 model af minimal residual sygdom (MRD) og kan delvis reddet med perioperativ IFNa

i betragtning af de begrænsninger af et profylaktisk model for kræft vaccination, vi udviklet en klinisk relevant terapeutisk B16 melanom model af minimal residual sygdom (MRD) (fig 5a). I denne model alle mus havde flank tumorer implanteret på dag 0 efterfulgt af AdDCT vaccination på dag 7, resektion af deres primære tumor med en 2 mm positiv margen på dag 14 for at simulere MRD i humane cancer kirurgi patienter, efterfulgt af yderligere kirurgisk stress. Svarende til den profylaktiske model, observerede vi, at AdDCT-vaccinerede mus, som fik resektion alene overlevede betydeligt længere end AdDCT-vaccinerede mus med yderligere kirurgisk stress (figur 5b). I betragtning af de undertrykkende virkninger af kirurgi på allerede eksisterende DCT-specifikke CD8

+ T-celle-immunitet, vi administreret præoperativ cytokin immunterapi i form af IFNa behandling for at redde T-cellefunktion og forbedre overlevelse (Fig 5c). Vi observerede, at den mediane overlevelse AdDCT vaccinerede mus, der undergik resektion og nefrektomi var 17 dage, mens median overlevelse blev forlænget til 27 dage i perioperative IFNa behandlede mus (figur 5d). Dernæst vi direkte undersøgt, om IFNa behandling i forbindelse med funktionerne AdDCT vaccination at forbedre DCT-specifikke T-celle responser. Interessant havde præoperativ IFNa terapi nogen væsentlige virkninger cytokinsekretion (IFNy og TNFa) fra DCT-specifikke CD8

+ T-celler (S4 Fig). Taget sammen viser disse resultater, at vi kan kombinere immunterapi med større kirurgi at forlænge overlevelsen i den postoperative periode. andre effektorceller (såsom NK-celler), kan imidlertid spille en rolle i tillæg til DCT-specifikke CD8

+ T-celler i at mediere de gavnlige virkninger af IFNa.

(a) B6-mus blev injiceret sc med 1×10

6 B16F10lacZ celler. På dag 7 blev mus vaccineret med AdDCT. På dag 14 blev tumorer resektion (Res) med en 2 mm margin +/- kirurgisk stress (Res + Nx). (B) Overlevelse af behandlede B16F10lacZ tumorbærende mus er vist i Kaplan-Meier-kurver. N = 7-8 /gruppe. c) Præoperativ behandling på dag 10 med 1 høj dosis (10.000 IE /mus) og på dag 11 til 13 med 3 lave doser (1000 IE /mus) af rekombinant mIFNα i MRD vaccination model. Overlevelse af behandlede B16F10lacZ tumorbærende mus er vist i Kaplan-Meier-kurver. N = 5-6 /gruppe.

Kirurgi-induceret udvidelse af granulocytisk MDSC svækker T-celle cytokin sekretion

Endelig undersøgte vi mekanismerne i T-celle undertrykkelse i tumor-bærende mus modtage vaccination og gennemgår kirurgisk stress. Myeloide Afledte suppressorceller (MDSC) repræsenterer en population af umodne myeloide celler, der udvider sig dramatisk i løbet af tumor progression og forringe adaptiv immunitet [25]. Hos mus er der to populationer af MDSC defineret ved deres relative ekspression af Gr1 og funktionelle status [26, 27]. Specifikt observerede vi en signifikant stigning i andelen af ​​milten granulocytisk MDSC (gMDSC) i kirurgisk stressede og vaccinerede mus (figur 6a), men ikke monocytisk MDSC (mMDSC) (fig 6b) sammenlignet med vaccinerede kontroller uden kirurgi. I modsætning hertil har vi ikke observere eventuelle forskelle i milt T regulatoriske (Treg) populationer efter vaccine og kirurgi (figur 6c). For at analysere muligheden for kirurgi-afledt gMDSC at undertrykke vaccine-aktiverede T-celle funktion, blev milt gMDSC isoleret fra kontrol og kirurgisk stressede mus og dyrket sammen med T-celler fra Ad-DCT-vaccinerede mus. I nærvær af kirurgi-afledte gMDSC, produktion af IFNy (Fig 6d) og TNFa (Fig 6e) af CD8

+ DCT-specifikke T-celler blev inhiberet signifikant som reaktion på DCT-peptid. Desuden har vi vurderet, om præoperativ IFNa behandling kan vende ophobning af gMDSCs i milten af ​​mus efter vaccination og kirurgi (S5 Fig). Ved nærmere undersøgelse, fandt vi, at præoperativ IFNa behandling ikke formindske udvidelsen af ​​gMDSC i mus sammenlignet med vaccinerede mus undergår kirurgi. Vi viser endvidere, at gMDSC celleoverfladen udtryk for aktivering /modning markører CD80 /CD86 ikke er ændret efter præoperativ IFNa tyder på, at IFNa behandling ikke direkte indflydelse gMDSC sammensætning og funktion i milten.

B6 mus blev udfordret med B16F10lacZ tumorer, modtaget AdDCT vaccination (dag 7) og derefter blev opereret som beskrevet ovenfor. På dag 8 blev musene aflivet og undergik milt MDSC blev isoleret til tælling og funktionelle analyser. Procentdel af (a) granulocytisk MDSC, (b) monocytisk MDSC og (C) T regulatoriske celler. Procentdel af DCT-specifik (d) IFNy

+ og (e) TNFa

+ CD8

+ T-celler fra kontrol- eller vaccinerede mus reagerer på DCT-peptid eksponering

180-188 følgende 4 dage i kultur med kontrol eller kirurgisk stresset MDSC. N = 4-6 /gruppe. (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001).

Diskussion

Kirurgisk resektion er grundpillen i terapi for mest solide maligniteter, men trods komplet resektion, mange patienter havnen MRD og i sidste ende dø af en gentagelse [28]. Kræft-vacciner er bedst egnet til at udrydde MRD [22, 23, 29], hvilket giver en stærk rationale for at kombinere kirurgi og immunterapi i kræft kliniske forsøg. en logisk designet klinisk forsøg med kræft vaccination skal dog tage hensyn til effekten af ​​kirurgisk stress på TAA-specifikke T-celle responser og de mekanismer, der er ansvarlige det.

I den foreliggende undersøgelse, vi viste, at forbigående, men