PLoS ONE: multiresistens-Associeret Protein 2 Expression opreguleres af Adenosin 5′-trifosfat i Colorectal Cancer Cells og forbedrer deres overlevelse til kemoterapeutiske medikamenter

Abstrakt

Ekstracellulær adenosin 5′-trifosfat (ATP) er en signalering molekyle, der inducerer et væld af effekter lige fra reguleringen af ​​celledeling til modulering af kræft celle adfærd. I colorektal cancer, blev ATP rapporteret at stimulere epitelcelleproliferation og muligvis fremme resistens mod anti-cancer behandlinger. Men den nøjagtige rolle af denne fare-signalmolekyle på kræft intestinale epitelceller (IECS) som reaktion på kemoterapeutiske midler er fortsat ukendt. For at løse hvordan ATP kan påvirke respons af cancerøse IECS til kemoterapeutiske midler anvendte vi Caco-2-celler, som udviser enterocytterne-lignende funktioner, for at bestemme virkningen af ​​ATP på ekspressionen af ​​multilægemiddelresistens-associeret protein 2 (MRP2). Gen og protein-ekspression blev bestemt ved kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR) og Western blotting. Resistens mod etoposid, cisplatin og doxorubicin blev bestemt ved MTT-assays som svar på ATP stimulering af Caco-2-celler og i celler, for hvilke MRP2 ekspression blev nedreguleret ved shRNA. ATP øgede ekspression af MRP2 på både mRNA og protein niveauer. MRP2 ekspression involverede en ATP-afhængig stimulering af MEK /ERK signalvej, der var forbundet med en stigning i relativ modstand på Caco-2-celler til etoposid. Afskaffelse af MRP2 ekspression under anvendelse shRNA reducerede signifikant beskyttende virkning af MRP2 mod etoposid samt til cisplatin og doxorubicin. Denne undersøgelse beskriver den mekanisme, hvormed ATP kan bidrage til kemoresistens af cancerøse IECS i colorektal cancer. I betragtning af den heterogenitet kolorektale adenocarcinom reaktioner på anti-cancer medicin, disse resultater kræver yderligere undersøgelse for at forstå betydningen af ​​P2-receptorer i cancer medicinsk behandling og til at udvikle nye behandlingsformer til formål at regulere P2-receptor-aktivitet

Henvisning.: Vinette V, placet M, Arguin G, Gendron FP (2015) multiresistens-associeret Protein 2 Expression opreguleres af adenosin 5′-trifosfat i Colorectal Cancer Cells og forbedrer deres overlevelse til kemoterapeutiske lægemidler. PLoS ONE 10 (8): e0136080. doi: 10,1371 /journal.pone.0136080

Redaktør: Hendrik W. van Veen, University of Cambridge, England

Modtaget: Marts 25, 2015; Accepteret: 29 Juli 2015; Udgivet: 21 August, 2015

Copyright: © 2015 Vinette et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af en canadisk Institutes of Health Research driftstilskud (MOP-286.567) til FPG F.P.G. er medlem af FRQS-finansierede “Centre de Recherche du Centre hospitalier Universitaire de Sherbrooke”

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kolorektal cancer (CRC) involverer unormal proliferation af intestinale epitelceller (IECS) som følge af spontane genetiske ændringer eller som følge af kontinuerlige fornærmelser som observeret hos patienter med langvarig kronisk inflammatorisk tarmsygdom [1,2]. Progression fra en simpel neoplastisk læsion til adenocarcinom indebærer ikke kun iboende faktorer, såsom ekspression af onkogener som

c-myc

eller undertrykkelse /mutation af suppressor gener såsom

TP53

,

men også

deltagelse af en række af opløselige regulatoriske faktorer, herunder cytokiner, hvoraf TGF-β er en veldokumenteret pro-tumorigen faktor [1,3]. For nylig er ekstracellulær adenosin-5′-triphosphat (ATP) blevet identificeret som en fare-signalmolekyle secerneres under inflammation og i tumormikromiljøet at tiltrække immunceller og koordinere cancerceller adfærd [4,5]. I tumoren nærhed, blev det rapporteret, at ATP-koncentrationen kunne nå 100 mM, hvilket er langt ud over den koncentration, der kræves for at aktivere nukleotidreceptorer [6,7].

Ekstracellulær ATP er den endogene agonist af P2X receptor familie af ligand-gatede ionkanaler og et begrænset antal P2Y underfamilien af ​​G-proteinkoblede receptorer, nemlig den humane P2Y

2 og P2Y

11 receptorer [8]. I solide tumorer, såsom CRC blev ATP vist sig at reducere væksten af ​​high-grade blære cancerceller både

in vitro

in vivo

[9]. I kliniske omgivelser, blev ATP infusioner til patienter med fremskreden ikke-småcellet lungekræft fundet i væsentlig grad at forbedre livskvaliteten og overlevelsen i dem, der modtager infusioner

vs

. placebokohorten [10-12]. Imidlertid er virkningen af ​​ATP på intestinale epitelceller cancerceller ikke så klart defineret.

In vitro

, ATP blev rapporteret at øge Caco-2-celleproliferation ved aktivering af MAPK signaleringskaskade [13], hvilket fører forfatterne til at foreslå, at ATP kan fungere som et mitogen på kræft IECS og potentielt være involveret i resistens. En anden undersøgelse rapporterede, at høje ATP-koncentrationer ( 1 mM) undertrykte Caco-2-celleproliferation [14]. Det blev endda foreslået, at anti-tumor-immunitet som følge af kemoterapi kan medieres af ATP-frigivelse fra tumorceller og aktiveringen af ​​NOD-lignende receptor familie, pyrin domæne indeholdende 3 (NLRP3) inflammasome [15], hvilket antyder deltagelse den purinergisk receptor P2X7 [16,17]. Imidlertid P2X7 sammen med P2Y-receptorer er også blevet forbundet med tumorpromotion [18,19]. Der er således et klart behov for at afklare virkningen af ​​ATP i CRC.

I over 40 år, mainstream behandling for avanceret CRC som været kombinationen af ​​DNA-ødelæggende stoffer såsom etoposid eller 5-fluorouracil (5 -FU) i kombination med alkyleringsmidler cisplatin eller oxaliplatin samt doxorubicin og dets derivater [20-24]. Selv om de fleste tilfælde af CRC er etoposid resistente, er der undersøgelser, der foreslår at bruge denne topoisomerase II-hæmmer i kombination med resveratrol eller FTY720 (fingolimod) for at undgå resistens [24,25]. Ikke desto mindre er en særlig klasse af proteiner tilhørende ATP-bindende kassette (ABC) superfamilien kan interferere med effektiviteten af ​​sådanne behandlinger på grund af deres evne eksportere kemoterapeutiske midler ud af cellerne [26]. De ABC transportører omfatter syv underfamilier (A-G). Familie C (ABCC) består af 13 medlemmer, hvoraf ni er blevet beskrevet som multiresistens-associerede proteiner (MRPs) som omfatter MRP2 (ABCC2) [26]. I cancer, har den positive ekspression af MRP2 blevet forbundet med galdeblære carcinoma aggressivitet og dårlig prognose [27] samt kemoresistens og dårlig prognose hos patienter med esophageal pladecellecarcinom [28]. Selv om en stigning i MRP2 udskrift udtryk er målt i tyktarmskræft væv, er der ikke sammenhæng blevet gjort til dato mellem MRP2 ekspressionsniveauerne og sygdommens sværhedsgrad eller prognose [26]. Ikke desto mindre ekspressionen af ​​MRP2 er signifikant associeret med forøget resistens over for cisplatin, men ikke til 5-FU, hvilket antyder en rolle i tyktarmskræft resistens over for udvalgte kemoterapeutiske lægemidler [26,29]. I betragtning af ovenstående er formålet med denne undersøgelse var at undersøge, om stimulering af intestinale epiteliale kræftceller ved ATP fører til en modulering af MRP2 ekspression, som postulerer vi ville medføre en forøget modstand af tumorceller til visse kemoterapeutiske lægemidler og dermed være til skade for behandling af colorektal cancer ved at øge overlevelsen af ​​cancerceller.

Materialer og metoder

Reagenser

Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM), penicillin-streptomycin, HEPES og føtal bovint serum (FBS) blev indkøbt fra Wisent (St. Bruno, QC, Canada). GlutaMax var fra Life Technologies (Burlington, ON, Canada). ATP, suramin og pyridoxalphosphate-6-azophenyl-2 ‘, 4’-disulfonsyre (PPADS) var fra Sigma-Aldrich (Oakville, ON, Canada). Den MEK1 /2 (UO126), p38 MAPK (SB203580), PI3K (LY294002) og NF- KB (BAY-11-7082) inhibitorer samt 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5 diphenyl-2H-tetrazoliumbromid (MTT) blev erhvervet fra Calbiochem (Mississauga, ON, Canada). Dimethylsulfoxid (DMSO) var fra Fisher Scientific (Ottawa, ON, Canada). De polyklonale antistoffer mod MRP2 og β-tubulin blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Pickering, ON, Canada). Peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret æsel anti-kanin IgG var fra Santa Cruz (Santa Cruz, CA, USA) og ECL reagens fra Millipore (Toronto, ON, Canada). De cytotoksiske lægemidler etoposid, cisplatin og doxorubicin blev købt fra kemoterapi apotek på Université de Sherbrooke Hospital Center (Sherbrooke, QC, Canada).

Cell Culture

Den menneskelige koloncarcinomcellelinie Caco -2 (ATCC, HTB37) og human embryonisk nyrecellelinie HEK293T (ATCC, CRL-11268) blev dyrket som tidligere beskrevet [30]. Specifikke kinaseinhibitorer blev tilsat til serum-frit medium 30 minutter før nukleotid stimulering som vist i figurerne. For narkotika cytotoksicitetsassays blev Caco-2 celler dyrket i DMEM medium uden phenolrødt.

Generation of MRP2 shRNA cellelinjer

De 21mer shRNA konstruktioner rettet mod humant MRP2 (NM_000392) blev købt fra Sigma-Aldrich MISSION shRNA (St. Louis, MO). Lentivira fremstillet i HEK293T celler og anvendt til Caco-2 celler infektion som tidligere beskrevet [31]. For at validere shRNA effektivitet blev Caco-2 celler høstes, og MRP2 ekspression analyseret ved Western blotting og kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR).

Kvantitativ realtids-PCR

Caco- 2-celler blev stimuleret med 100 pM ATP i 3 og 6 timer. Totalt RNA blev isoleret fra Caco-2 celler med TRlzol-reagens (Life Technologies) ifølge producentens anvisninger. Komplementær DNA (cDNA) blev syntetiseret fra 2 ug oprenset RNA ved revers transkription under anvendelse af SuperScript II-systemet (Invitrogen Life Technologies, Burlington, ON, Canada). Fem procent af det syntetiserede cDNA blev anvendt som en skabelon for QRT-PCR under anvendelse af Brilliant III ultrahurtige SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies, Mississauga, ON, Canada). De sekvensspecifikke primere til

ABCC2

(det gen, der koder human MRP2) var 5’AGAGCTGGC CCTTGTACTCA -3 ‘og 5′-AGGGACAGGAACCAGGAGTT – 3’. Genekspression blev normaliseret til glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (

GAPDH

) genekspression som tidligere rapporteret [32,33]. Salg

Drug cytotoksicitetsassays Salg

Caco-2-celler var podet i plader med 96 brønde ved en densitet på 7.500 celler /brønd. Celler blev dyrket i 24 timer, hvorefter etoposid, cisplatin eller doxorubicin blev tilsat til passende brønde i forskellige koncentrationer (fra 10 til 500 um) og celler inkuberes i 84 timer. For eksperimenter med nucleotid stimulationer blev 100 pM ATP tilsat til de passende brønde 6 timer forud for tilsætningen af ​​det cytotoksiske lægemiddel. Friske nucleotider blev tilføjet hver 24 timer. Resistens over for de forskellige stoffer blev bestemt ved MTT cellelevedygtighed assay som beskrevet af producenten. Kort fortalt, 20 pi 10 mg /ml MTT blev tilsat til hver brønd og inkuberet ved 37 ° C i 4 timer. Medierne blev fjernet, 100 pi DMSO blev sat til hver brønd, og pladerne blev rystet på et rysteapparat i 5 minutter ved 1.500 rpm for at solubilisere formazan. Optiske densiteter blev målt ved anvendelse af en mikropladelæser (Molecular Devices VERSAmax mikropladelæser, Guelph, ON, Canada) ved 560 nm og ved 670 nm for at bestemme baggrundssignal.

Western blotting

Caco-2 celler blev stimuleret med 100 uM ATP til 6 og 18 timer. Celler blev vasket med iskold PBS og lyseret i Triton-buffer (40 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,2 mM natriumorthovanadat, 40 mM glycerophosphat, 0,1 mM phenylmethansulfonylfluorid og proteaseinhibitor-blanding fra Sigma-Aldrich). Proteinkoncentration blev bestemt ved anvendelse af Bio-Rad Protein Assay-reagens. Prøverne blev opvarmet i 5 minutter ved 95 ° C, udsat for 7% SDS-PAGE og overført til polyvinyliden fluorid membraner for protein immunoblotting som beskrevet tidligere [32,33]. Immunoblotting for MRP2 blev udført under anvendelse af en 1 /1.000 fortynding af kanin-polyklonalt anti-MRP2 og den specifikke proteinbånd blev detekteret ved anvendelse af en 1: 10.000 fortynding af HRP-konjugeret æsel-anti-kanin IgG og visualiseret på autoradiografisk film ved anvendelse af Millipore ECL chemiluminescens systemet . Signal blev normaliseret som beskrevet med 1 /5.000 fortynding af kanin anti-β-tubulin antistof [32,33].

Måling af ecto-nukleotidase aktivitet

ATPase aktivitet blev bestemt i vedhængende Caco -2 celler dyrket i 24-brøndsplade ifølge protokollen beskrevet af Wink et al. [34]. Kort fortalt blev adhærente Caco-2-celler inkuberet reaktionsmediet (80 mM Tris-base, 5 mM CaCI2, 150 mM NaCl (pH 7,4)), og enzymatisk den enzymatiske reaktion initieres ved tilsætning af 0,2 mM ATP i 20 minutter ved 37 ° C. Frigivelsen af ​​uorganisk phosphat (P

i) i inkubationsmediet blev målt ved malakitgrønt metode [35], og proteinkoncentrationen af ​​cellehomogenat blev bestemt som beskrevet ovenfor. Den specifikke aktivitet blev udtrykt som nmol P

i frigivet /min /mg protein.

Statistisk analyse

Resultater udtrykkes som middelværdi ± standardafvigelse af middelværdien (SEM). Statistisk signifikans blev bestemt ved hjælp af en uparret

t

test eller variansanalyse (ANOVA) med Dunnetts multiple sammenligning post-test som beskrevet i figur legender. Antallet af gentagelser for hvert forsøg er også præsenteret i figur legender. IC

50 værdier blev ekstrapoleret fra overlevelseskurver ved hjælp af ikke-lineær regressionsanalyse fra gennemsnittet af tre til fire eksperimenter. Den relative resistens faktor (RR) blev bestemt ved at dividere IC

50 af stimulerede eller shMRP2-transficerede celler ved IC

50 i kontrolceller, som tidligere rapporteret [36,37].

resultater og diskussion

opregulering af MRP2 ekspression af ATP medieres ved transskriptions- og proteinniveauet ved P2Y-receptorer

fast tumor mikromiljø er rig på vækstfaktorer, cytokiner og kemokiner. Disse faktorer bidrager til dannelsen af ​​en inflammatorisk mikromiljø, der stimulerer tumorigenese [1,38]. Ekstracellulær ATP er også fundet i overflod i tumoren nærhed [6,7], hvor det kan fremme udbredelsen af ​​lunge-, bryst- og tyktarmskræft celler [13,39,40] samt støtte invasionen af ​​prostata cancer celler og migration af lunge og cancerøse IECS [41-43]. I denne undersøgelse foreslog vi, at tilstedeværelsen af ​​ATP i tumoren nærhed kunne bidrage til medikamentresistens så ofte hos patienter under kemoterapi behandlinger for colorectal cancer [44]. Faktisk analyse af MRP2 mRNA-ekspression i IECS stimuleret med 100 uM ATP til 3 og 6 h under anvendelse QRT-PCR viste, at nucleotid behandlinger førte til en 1,5- til 2-gange stigning i ekspressionen af ​​MRP2 transcript (Fig 1A). Eftersom MRP2 reguleres på det transskriptionelle niveau, blev efterfølgende analyseret MRP2 proteinekspression. Stimulering af Caco-2-celler med 100 pM ATP for 6 eller 18 timer forøget MRP2 protein ekspression som bestemt ved immunoblotting (Fig 1B og 1C). Ekspressionen af ​​MRP2 blev også opreguleret af 1,5- til 2-fold efter nukleotid behandling, som vurderet ved densitometri (figur 1C). At validere, at opregulering af MRP2 ekspression i IECS faktisk er reguleret af P2 nukleotidreceptorer blev Caco-2-celler behandlet med to kendte generelle antagonister for P2-receptorer, nemlig PPADS og suramin. Efter tilsætning af denne til Caco-2 celler før stimulering med 100 pM ATP i 6 timer (figur 2), afslørede Western blot-analyse, at PPADS havde ingen signifikant virkning på MRP2 proteinekspression henviser tilstedeværelsen af ​​suramin førte til en markant reduktion i ATP-afhængig induktion af MRP2 ekspression (figur 2). I betragtning af at ATP er den primære agonist af human P2X og P2Y

2 og 11 receptorer, og at suramin er en mere potent antagonist af P2Y

2 mens PPADS er en mere potent antagonist af P2Y

1, 4, 6 og P2Y

13 samt P2X1, 2, 3 og 5-receptorer [45,46], den nuværende resultat antyder, at P2Y kan være involveret

2 i reguleringen af ​​MRP2 udtryk. Skønt tilsvarende resultater blev opnået med andre kankrøse intestinale epiteliale cellelinjer T84, DLD-1, HT-29 og HCT116 (data ikke vist), vores fokus blev placeret på Caco-2-celler, eftersom disse celler udviser typiske træk ved enterocytter [47]. Sådan forøget ekspression i ATP-sensitive P2-receptorer er tidligere blevet rapporteret i både humane kolorektal carcinom celler og cellelinier [48]. Faktisk ekspressionen af ​​P2Y

2-receptor, samt P2Y

4 blev rapporteret at være opreguleret i humane coloncancer væv [49]. Aktivering af disse receptorer er blevet forbundet med reguleringen af ​​cancercellevækst og resistens over for apoptose [18]. I lighed med P2Y

2 receptor-ekspression, viste ondartede væv isoleret fra CRC patienter forøget ekspression af MRP2 transkriptniveauer sammenlignet med ikke-kræft margener [29]. Selvom ATP synes at være den vigtigste opløselige faktor, der bidrager til opregulering af MRP2 udtryk i Caco-2 celler, kan vi ikke udelukkes, at adenosin-5′-diphosphat (ADP) kunne spille en mindre rolle i denne proces. Fordi ADP kan genereres gennem hydrolyse af ATP ved ecto-nucleosidtriphosphat diphosphohydrolase (E-NTPDase, EF 3.6.1.5) til stede på overfladen af ​​Caco-2 celler [33,50], vi bestemt, at vedhængende Caco-2 celler har en ATPase-aktivitet på 1,32 ± 0,04 nmol /min /mg protein. ATPase-aktivitet er gennemsnittet ± SEM af tre forsøg gennemført in triplo. Vores resultater tyder endvidere, at stimulering af cancerøse IECS med ATP øger ekspressionen af ​​MRP2, et protein kendt for sin rolle i celle resistens overfor en række kemoterapeutiske midler anvendes i behandlingen af ​​colorektal cancer [26].

Humant intestinal adenocarcinoma Caco-2-celler blev stimuleret med 100 pM ATP i 3 eller 6 timer, eller med vehikelkontrol kun (Ctrl). (A) Stimulering med ATP signifikant forøget

ABCC2

genekspression (koder for MRP2) med 1,5 til 2 gange sammenlignet med ikke-stimulerede Ctrl som bestemt ved QRT-PCR-analyse. Resultater er præsenteret som middelværdi ± SEM for fem individuelle eksperimenter udført in duplo. Statistisk signifikans blev bestemt ved envejs ANOVA med Dunnetts multiple sammenligningstest post-test. * P 0,05, ** p 0,01 sammenlignet med Ctrl. (B) Typisk Western blot-resultat viser forbedret MRP2 ekspression i ATP-stimulerede celler. (C) Densitometrisk analyse afslørede, at 100 pM ATP induceret MRP2 proteinekspression med mere end 1,5 gange efter 6 og 18 timer af stimulering sammenlignet med kontrol (Ctrl). Resultater er præsenteret som middelværdi ± SEM af fem separate forsøg. Statistisk signifikans blev bestemt ved envejs ANOVA med Dunnetts multiple sammenligningstest post-test. * P 0,05 sammenlignet med Ctrl.

Caco-2-celler blev behandlet med 100 pM PPADS eller Suramin 30 min før tilsætning af 100 pM ATP i 6 timer. MRP2 ekspression blev analyseret ved Western blotting. ATP stimulerede ekspressionen af ​​MRP2 sammenlignet med ikke-stimulerede (N-S) celler, hvorimod tilsætning af suramin forud for ATP stimulering kraftigt formindsket MRP2 ekspression sammenlignet med ATP-stimulerede celler i nærværelse af vehikel (DMSO (-)) alene. Den præsenterede blot er typisk af tre separate sæt af eksperimenter.

Modulation af MRP2 udtryk er reguleret af MEK /ERK signaleringskaskade

Det er veldokumenteret, at ekstracellulær ATP, gennem aktivering af P2Y-receptorer, stimulerer mange intracellulære signalveje [13,30,41,51]. Disse veje er overvejende knyttet til ATP-afhængig regulering af proliferation [13,14], cellemotilitet og mikrotubulus reorganisering [41], sekretion af inflammatoriske faktorer, såsom PGE

2 i en NFKB-afhængig måde [30] og modulering af oxalat, elektrolytter og glucosetransport [52-55]. For at bestemme de signalleringskaskader involveret i reguleringen af ​​MRP2 udtryk Caco-2 celler blev forbehandlet med forskellige inhibitorer, især BAY11-7082 (NFKB), U0126 (MEK 1/2), LY294002 (PI3K) og SB203580 (p38) til 30 minutter og derefter stimuleret med 100 pM ATP i 6 timer. Celler behandlet med MEK /ERK signaleringskaskade inhibitor U0126 udviste et signifikant fald i MRP2 ekspression sammenlignet med ATP-stimulerede celler (Fig 3A). Densitometri analyse bekræftede, at hæmning af MEK-ERK pathway signifikant reduceret MRP2 ekspression ved 2-fold (Fig 3B). Af note, har inhibering af ATP-afhængig aktivering af ERK1 /2-vejen tidligere blevet associeret med en reduktion i colon adenocarcinom celleproliferation [13], og omvendt, at øget levedygtighed af humane endometriske stromale celler [56]. Den ERK vej har også været forbundet med resistens over for kræftbehandling ved at regulere ekspressionen af ​​multilægemiddelresistente proteiner (MDR), herunder MRP2, i bugspytkirtelkræftceller [57] samt i Caco-2 celler [58]. Vores resultater viste, at ERK-signalering er involveret i ATP-induceret MRP2 ekspression i Caco-2 humane adenocarcinom-celler.

Caco-2-celler blev forbehandlet med NFKB (2 uM, Bay, BAY11-7082), MEK1 /2 (10 uM, U0, U0126), PI3K (20 uM, LY, LY294003) og p38 (20 uM, SB, SB203580) inhibitorer i 30 minutter og stimuleret med 100 pM ATP i 6 timer. (A) En typisk Western-blot mod MRP2 vises hvorfra (B) densitometrianalyse viste en signifikant reduktion i MRP2 ekspression i nærvær af U0126, en selektiv MEK 1/2 inhibitor. Celler forbehandlet med U0126 førte til en reduktion i ekspressionen af ​​MRP2 75% i forhold til ATP-stimulerede celler kun (-). Resultater er præsenteret som middelværdi ± SEM af tre separate forsøg udført in duplo. Statistisk signifikans blev bestemt ved en uparret

t

-test, hvor * p 0,05 vs. ikke-stimuleret (NS) eller ATP-stimulerede celler som angivet på figuren.

Den øgede ekspression af MRP2 i kræftceller giver resistens over for det cytotoksiske lægemiddel etoposid

Øget udtryk for MRP2 i tyktarmskræft har været forbundet med resistens over for cisplatin, men ikke til 5-FU [29], selv om

ATP-bindende kassette sub-familie C element 2 Hotel (

ABCC2

) haplotype blev vist som en forudsiger af variabilitet i den farmakokinetiske reaktion på FOLFIRI regime i japanske CRC patienter, som omfatter 5-FU [59]. I betragtning af at MRP2 kan eksportere en række forbindelser, navnlig cytotoksiske lægemidler [60-62], undersøgte vi virkningen af ​​ATP på celleoverlevelse af Caco-2-celler efter behandling med anti-cancer drug etoposid. I et første tilfælde blev modstanden i Caco-2-celler for forskellige koncentrationer af dette stof målt med eller uden ATP-stimulering. Celleoverlevelse blev bestemt ved MTT kolorimetriske test. En øget celleoverlevelse blev observeret i celler stimuleret med ATP sammenlignet med ikke-stimulerede celler (Fig 4A), som oversat til en betydelig stigning i IC

50 værdier (fig 4B). De relative resistens (RR) værdier af de forskellige betingelser blev også beregnet og blev fundet at være højere i celler stimuleret med ATP sammenlignet med ikke-stimulerede celler. RR værdi på 1,84 indikerer, at ATP-stimulerede celler var 1,84 gange mere resistente over for anti-cancer drug etoposid (Fig 4B). Dette fund tyder på, at ATP-afhængig stimulering af MRP2 ekspression førte til en forøget modstand af Caco-2 humane colorektale adenocarcinoma celler til etoposid, og dermed mulig involvering af ekstracellulære ATP og P2Y-receptorer i CRC anticancerlægemiddel terapi modstand. Under hensyntagen til at MRP2 ekspression tidligere er blevet associeret med resistens over for cisplatin, disse resultater er således overensstemmende med den hypotese, at MRP2 eksporterer kemoterapeutiske lægemidler ud af cancerceller [27,28,61], og dermed favoriserer deres overlevelse. Derfor er disse fund er også i overensstemmelse med den foreslåede rolle for P2Y-receptorer i tumorudvikling gennem resistens over for behandling som tidligere beskrevet [13].

Caco-2-celler blev inkuberet med stigende koncentrationer af etoposid for 84 timer i nærvær eller fravær af 100 uM ATP tilføjes hver 24 timer. MTT cellelevedygtighed assay blev anvendt til at bestemme følsomheden over for lægemidlet. (A) En dosisresponskurve blev tilpasset til dataene for at bestemme toksiciteten (IC

50 værdi) af lægemidlet. Resultaterne præsenteres som en ikke-lineær overlevelse kurve af en typisk reaktion. (B) IC

50 og RR værdierne er præsenteret på histogrammet og resultaterne repræsenterer middelværdier ± SEM af tre til fire uafhængige eksperimenter udført i triplikat. Statistisk signifikans blev bestemt ved uparret

t

-test, hvor * p 0,05 sammenlignet med Ctrl.

ugyldiggørelse af MRP2 udtryk fører til en reduceret modstand af celler til kemoterapeutiske lægemidler

Efter den observation, at ATP-stimuleret Caco-2 celler udviser en stigning i MRP2 ekspression og var mere resistente over for etoposid cytotoksicitet, undersøgte vi, om inhiberingen af ​​MRP2 kunne have den modsatte virkning. For at verificere denne hypotese blev MRP2 udtryk ugyldiggjort i Caco-2 celler ved hjælp shRNA. Lentiviral infektion af Caco-2 celler med shRNA rettet mod MRP2 (sh305 og sh307) afskaffede proteinekspression med 90-100% (figur 5A). Som vist i fig 5B, Caco-2-celler valideres på MRP2 var mindre modstandsdygtige over for etoposid behandling, med IC

50 værdier på 328,2 um og 108,5 pM for shNT og shMRP2, henholdsvis for en RR-værdi på 0,33 (tabel 1) . Inhibering af MRP2 ekspression sensibiliserede også Caco-2-celler til den cytotoksiske virkning af cisplatin og doxorubicin (tabel 1). I nærvær af cisplatin eller doxorubicin, Caco-2-celler valideres på MRP2 ekspression var ca. 2,5 gange mindre modstandsdygtige over for behandling som vist af respektive RR værdier på 0,36 og 0,40 for cisplatin og doxorubicin (tabel 1). Disse resultater er således overensstemmende med den hypotese, at MRP2 eksport kemoterapeutiske stoffer ud af kolorektal cancer celler og dermed favoriserer deres overlevelse. En øget ekspression af denne transporter af ekstracellulær ATP øger yderligere denne resistens. På den anden side er nedregulering af MRP2 af shRNA fører til et fald i modstanden af ​​cancerceller til narkotika- og efterfølgende falder deres celleoverlevelse.

(A) Western blot-analyse blev anvendt til at vurdere down- regulering af MRP2 proteinekspression i nærvær af to shRNAs rettet mod proteinet. Nedregulering blev opnået ved lentiviral infektion af Caco-2-celler som tidligere beskrevet [31]. shRNA rettet mod MRP2 (sh305 og sh307) afskaffede proteinekspression med 90-100% sammenlignet med celler, der udtrykker en ikke-targeting shRNA (shNT). (B) Caco-2-celler, der stabilt udtrykker shNT eller shMRP2 (# 305) blev inkuberet med det cytotoksiske lægemiddel etoposid for 84 timer. Følsomhed over for anti-cancer lægemiddel blev bestemt ved MTT cellelevedygtighed assay. En dosisresponskurve blev tilpasset til dataene for at bestemme toksiciteten (IC

50 værdi) af lægemidlerne. De ikke-lineære overlevelseskurver præsenteres som middelværdi ± SEM af fire forsøg udført tredobbelt. Statistisk signifikans blev beregnet ved hjælp af multiple

t

-test sammenligninger, hvor * p 0,05 sammenlignet med shNT. Inhibering af human shMRP2 ekspression reduceres modstanden i Caco-2-celler til etoposid sammenlignet med kontrolceller. IC

50 og RR-værdier er vist i tabel 1.

Konklusioner

I den foreliggende undersøgelse, viser vi en sammenhæng mellem stimulering af den menneskelige kolon adenocarcinom celler med ATP gennem P2Y-receptorer og aktivering af MEK /ERK-vejen samt ekspressionen af ​​MRP2. Især vi vise, at aktiveringen af ​​P2Y receptorer ved ekstracellulær ATP inducerer opregulering af MRP2 udtryk. Denne forøgede ekspression af MRP2 fører til den forøgede resistens og overlevelse af intestinale cancerøse Caco-2-celler til visse kemoterapeutiske lægemidler, der anvendes til behandling af kolorektal cancer. Selv har tidligere været foreslået en rolle for P2Y receptorer i tumor udvikling gennem resistens mod behandlingen [13], denne undersøgelse er den første til at foreslå en mekanisme, hvormed en sådan virkning kunne være medieret. Derfor er disse fund kræver yderligere undersøgelse at afgrænse rolle P2-receptorer i kræft medicinsk behandling og til at udvikle nye behandlingsformer til formål at regulere P2-receptor-aktivitet. I betragtning af den heterogenitet kolorektale adenocarcinom reaktioner på anti-cancer medicin, kunne screening af patienter til P2-receptorer og /eller identifikation af mutant form af P2-receptorer såvel som for MRP2 udtryk være gavnligt i at optimere anti-cancer behandlinger.

tak

forfatterne takker Mr. Pierre Pothier for nærlæsning og revision af dette manuskript. F.P.G. er medlem af FRQS-finansierede “Centre de Recherche du Centre hospitalier Universitaire de Sherbrooke”.