PLoS ONE: Den HDAC-hæmmer LBH589 inducerer ERK-Dependent prometafasen Anholdelse i prostatakræft via HDAC6 Inaktivering og Down-Regulation

Abstrakt

histondeacetylaseinhibitorer (HDACi) har potent anti-cancer aktivitet i en række af kræft modeller. Forståelse af de molekylære mekanismer, der er involveret i den terapeutiske respons hos HDACi er nødvendig, før den kliniske anvendelse. Denne undersøgelse havde til formål at afgøre, om en potent HDACi, LBH589 (Panobinostat), havde forskellen terapeutisk lydhørhed over for LNCaP og PC-3 prostatakræft (PCA) celler. Den tidligere viste prometafasen anholdelse med efterfølgende apoptose på LBH589 behandling, mens sidstnævnte var mindre følsom og havde sent G2 anholdelse. Den LBH589 behandling nedreguleret HDAC6 og vedvarende ERK aktivering, og bidrog til prometafasen anholdelse. Mekanistisk, LBH589 hæmmede HDAC6 aktivitet, forårsaget sin afstandtagen fra protein fosfatase PP1a, og øget 14-3-3ζ acetylering. Acetyleret 14-3-3ζ udgivet sin maske effekt på serin 259 af c-Raf og serin 216 af Cdc25C efterfølgende at de-fosforylering af PP1a, som bidrog til ERK aktivering. Forbedret ERK aktivitet ved LBH589 længere nedreguleret HDAC6 protein niveauer og vedvarende ERK-aktivering ved fri-forward regulering. Den vedvarende Cdc25C og ERK-aktivering resulterede i begyndelsen M-fase (prometafasen) anholdelse og efterfølgende apoptose i de mest følsomme LNCaP-celler, men ikke i PC-3-celler. Denne undersøgelse giver præklinisk bevis for, at HDAC6 kan tjene som en følsom terapeutisk mål i behandlingen af ​​prostatacancer med HDACi LBH589 til klinisk oversættelse. Denne undersøgelse postulerer også en ny mekanisme for HDAC6 deltagelse i regulering af c-Raf-PP1-ERK signalvejen og bidrage til M fase celle-cyklus overgang

Henvisning:. Chuang MJ, Wu ST, Tang SH, Lai XM, Lai HC, Hsu KH, et al. (2013) Den HDAC-hæmmer LBH589 inducerer ERK-Dependent prometafasen Arrest i prostatakræft via HDAC6 Inaktivering og nedregulering. PLoS ONE 8 (9): e73401. doi: 10,1371 /journal.pone.0073401

Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Østrig

Modtaget: Februar 20, 2013; Accepteret: 19 Jul 2013; Udgivet: 4. september, 2013 |

Copyright: © 2013 Chuang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Science Council (97-2314-B-016-023-MY3 og 99-2628-B-016-012-MY3) og fra Tri-service General Hospital Research Foundation (TSGH-C101-009 -S02, TSGH-C100-128 og TSGH-C99-012-13-S03), Taiwan, ROC. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Den hurtige udvikling af HDAC-hæmmere (HDACi) som kræftmedicin er inderligt anvendt i mere end 80 kliniske forsøg [1]. Forståelse af de detaljerede molekylære mekanismer i hvordan HDACi medierer anti-cancer aktivitet er nødvendig for at kunne lette dets kliniske oversættelse. Den undertrykker cancer celleoverlevelse gennem forskellige mekanismer, herunder blokering af angiogenese, inhibering intracellulære stress response pathways, øge dannelsen af ​​reaktive oxygenarter, og påvirke endoplasmatisk reticulum stress respons på grund af forringet håndtering af mis-foldede proteiner [2-4]. Blandt disse anti-cancer aktiviteterne, HDACi-medieret G1 cellecyklusstandsnings forårsager en stigning i ekspression af tumorsuppressorgen p21 i en transkription-afhængig måde [5]. Det er også blevet vist, at HDACi inducerer G2 /M-celle-cellecyklusstandsnings gennem en transskription-uafhængig vej via nedregulering af Aurora A og B kinaser [6-8]. Desuden HDACi udløser en G2 fase checkpoint respons i normale humane celler, og at dette kontrolpunkt reaktion er defekt i en række tumorceller [9]. Derfor målretning inhibering af G2 /M cellecyklusprogression er en mere fordelagtig strategi til specifikt undertrykke væksten af ​​cancerceller uden at inhibere normale celler.

Induktion af mitose af cellecyklussen reguleres stramt ved koordineret aktivering og inaktivering af flere proteinkinaser og phosphataser. Ved begyndelsen af ​​mitose, Cdc25C (en dual phosphatase) aktivering er et kritisk trin til aktivering af Cdc2 /cyclin B-kompleks. Den inhiberende rest af Ser216 på Cdc25C skal dephosphoryleret med PP1 for at aktivere Cdc25C [10,11]. Den fulde virkning af Cdc25C er reguleret af ERK på mitogen stimulering under G2 /M overgang i pattedyrceller [12]. ERK tilhører MAPK kaskade og dets aktivitet er styret af opstrøms Raf /MEK signalering. I hvilende celler, 14-3-3 bindes til c-Raf via S259 og S621 phosphorylering og vedligeholder c-Raf inaktivering [13,14]. Når celler ind i mitosen, PP1 eller PP2A medieret dephosphorylering af S259 er en forudsætning for phosphoryleringen af ​​S 338 om c-Raf og yderligere udløser c-Raf og ERK aktivering [15,16].

Især PP1 og ERK aktiviteter er afgørende for Cdc25C aktivering ved begyndelsen af ​​mitose, efterfulgt af faldende ERK aktivitet under M faseovergang [12,17]. PP1 kan direkte binde til den katalytiske underenhed af den C-terminale ende af HDAC6. Interaktionen af ​​HDAC6 og PP1 kan afbrydes ved inhibering af aktiviteten af ​​enten HDAC6 eller PP1 [18]. HDAC6 er den største deacetylase der er ansvarlig for deacetylering af α-tubulin og varmechokprotein 90 (Hsp90) [19]. Men om HDAC6 bidrager til reguleringen af ​​G2 /M cellecyklus overgang forbliver uklart.

LBH589 (Panobinostat), en HDACi, udviser mindst ti gange mere potent hæmmende aktivitet mod alle klasse I, II, og IV HDAC’er sammenlignet med SAHA (vorinostat) [20]. LBH589 besidder potente vækst hæmning virkninger på forskellige typer af kræftceller, men med varierende terapeutisk virkning, som kan repræsentere potentielle modstand af visse typer kræft og hindre den kliniske oversættelse af LBH589. Selvom LBH589 inducerer G2 /M cellecyklusstop gennem nedbrydningen af ​​både Aurora A og B-kinaser [6,7], de detaljerede molekylære mekanismer involveret samt de potentielle HDAC’er er omfattet af LBH589 forbliver ubestemt.

Den nuværende undersøgelse karakteriseret to forskellige typer af G2 /M cellecyklusstop medieret af LBH589 i prostata kræftceller. LBH589 ikke kun hæmmede HDAC6 og forbedret 14-3-3ζ acetylering, men også forarmet HDAC6 at udløse dissociation af PP1a fra HDAC6. LBH589 efterfølgende blandede sig i reguleringen af ​​c-Raf-ERK signalvej, der bidrager til M fase cellecyklus overgang. Afslutningsvis denne undersøgelse tyder på, at HDAC6 kan være en følsom terapeutisk mål i behandlingen af ​​prostatacancer under anvendelse LBH589 til klinisk oversættelse i fremtiden.

Resultater Salg

LBH589 inducerede G2 /M cell cycle arrest og vækstinhibering i prostatacancerceller gennem distinkte mekanismer

Som et første forsøg på at undersøge den cytotoksiske virkning af LBH589, fire prostata cancercellelinjer, LNCaP, PC-3, DU-145 og 22Rv1, blev behandlet med forskellige koncentrationer af LBH589 og cellelevedygtigheden blev målt ved MTT-assayet. Generelt viste LBH589 potent vækstinhibering på hvert cancercellelinie på en dosis- og tidsafhængig måde. Blandt cellelinjerne, LNCaP og PC-3 var de mest følsomme og resistente over for LBH589 behandling henholdsvis (figur 1A). Undersøge cellecyklussen profiler efterfølgende til LBH589 eksponering, havde LBH589 behandling ikke forårsage G2-M, men ikke G1, vækststandsning i de fire prostata cancer cellelinier for 24 timer (figur 1b). LBH589-induceret G2-M vækststandsning var mest fremtrædende i PC-3 og LNCaP. Selvom LBH589 inducerede en sammenlignelig grad af G2-M anholdelse i LNCaP og PC-3 celler, den betydelige forskel på apoptose mellem disse to cellelinjer under langvarig LBH589 eksponering (figur 1C) foreslog, at de underliggende mekanismer involverede kan være anderledes.

(a) LBH589 havde en dosisafhængig virkning på vækstinhibering i prostata cancercellelinier. De cellelinjer blev behandlet med 50, 75, 100, og 150 nM LBH589. Celleoverlevelse blev målt ved anvendelse MTT assay som beskrevet i afsnittet Materialer og fremgangsmåder. Grafer sammenlignet procentdelen af ​​vækstinhibering til vehikelkontrol ved 24 (øvre) og 48 (lavere) timer. (B) LBH589 inducerede G2 /M cellecyklus anholdelse. Alle cellelinjer blev behandlet med LBH589 eller vehikelkontrol i 24 timer. De cellecyklus blev analyseret ved PI-farvning og flowcytometri ifølge DNA-indhold. De forøgede procentdele af G2 /M-celler blev sammenlignet med den for vehikelkontrollen. (C) LBH589 induceret apoptose i PC-3 og LNCaP-celler. Begge cellelinier blev behandlet med 75nM LBH589 eller kontrol køretøj til 24 (øvre) og 48 (lavere) h. Procentdelene af apoptotiske celler blev analyseret ved at tælle populationen af ​​DNA-fragmentering ved flowcytometri. (D-E) HDACi induceret Aurora kinase nedbrydning findes i PC-3, men ikke i LNCaP. PC-3 og LNCaP-celler blev behandlet med forskellige HDACi ved angivne koncentrationer af LBH589, SAHA og SBHA i 24 timer og cellelysater blev analyseret ved Western blotting ved anvendelse af de angivne antistoffer. (F) Profil af proteiner vedrørende progression af G2 /M cellecyklus. Cellerne blev behandlet med forskellige doseringer af LBH589 i 24 timer. Lysatet blev analyseret ved western blotting.

En tidligere undersøgelse har vist LBH589-medieret G2 /M-celle-cellecyklusstandsnings via nedregulering af Aurora A og B kinase i renalcellecarcinom [6]. LBH589 behandling øget de samme niveauer af histon H3 acetylering i både LNCaP og PC-3 celler, hvilket indikerer, at LBH589 var funktionelle i begge prostata cancer cellelinjer. Imidlertid blev nedregulering af Aurora A og B kinaser efter LBH589 kun observeret i PC-3-celler, men ikke i LNCaP-celler (figur 1D). For at undersøge, om andre hydroxamsyrederivater havde lignende effekter på LNCaP og PC-3 celler, to andre HDACi, SAHA og SBHA, blev testet og viste, at nedregulering af Aurora A og B-kinaser kun forekom i PC-3 celler men ikke i LNCaP (figur 1E). For yderligere at løse uoverensstemmelsen mellem LNCaP og PC-3 celler under LBH589 behandling blev to G2-M overgang molekyler Cdc2 og Cdc25C sammenlignes. LBH589 faldt Cdc25C og phosphorylerede Cdc2 niveauer i PC-3-celler, men ikke i LNCaP-celler. LBH589 også inducerede et band skift mønster af Cdc25C i LNCaP celler på en dosis- og tidsafhængig måde (figur 1F).

LBH589 induceret ERK aktiverings- og Cdc25C hyper-phosphorylering

De molekylære mekanismer involveret i de forskellige LBH589-medierede virkninger mellem de to PCA-celler blev undersøgt. Signalvejene involveret i celleproliferation og overlevelse, herunder Akt og p38, viste ingen signifikant forskel mellem LNCaP og PC-3 PCa celler (figur 2A). Interessant LBH589 behandling resulterede i øget ERK phosphorylering kun i LNCaP-celler, ikke i PC-3-celler. Nedregulering af histon H3 serin 10 phosphorylering (som en M-fase-markør) forekom hos PC-3-celler, men ikke i LNCaP-celler (figur 2A).

(A) LBH589 induceret ERK aktivitet er selektivt aktiveret i LNCaP-celle. PC-3 og LNCaP-celler blev behandlet med 75nM LBH589 eller kontrol i 24 timer køretøj. Niveauerne af angivne proteiner blev immuno-blottes mod individuelle antistoffer. GAPDH var en intern loading kontrol. (B) dosis- og tidsafhængige korrelationer af LBH589-medieret ERK-aktivering og Cdc25C hyper-phosphorylering. LNCaP blev udsat for forskellige koncentrationer af LBH589 i 24 timer (venstre) eller 25 nM LBH589 på forskellige tidspunkter (højre). (C) Dosisafhængig korrelation af LBH589-induceret G2 /M anholdelse. LNCaP blev behandlet med forskellige koncentrationer af LBH589 i 24 timer. Cellecyklus blev analyseret ved flowcytometri. (D) Cdc25C hyper-phosphorylering blev bekræftet ved dephosphorylering assay. LNCaP blev behandlet med 50 nM LBH589 i 24 timer. Lysaterne blev inkuberet med phosphatase (CIP) eller kombineret med phosphatase inhibitor. Hyper-phosphorylerede og dephosphorylerede Cdc25C blev analyseret ved immuno-blotting med Cdc25C-antistof. (E) Cdc25C hyper-phosphorylering blev undertrykt af MEK-inhibitorer. LNCaP blev behandlet med MEK-inhibitorer, PD (100 uM PD98059) eller UO (20 uM UO126) i 30 minutter. LBH589 blev derefter tilsat til kulturen efter 24 timer. ERK aktivitet og Cdc25C hyper-phosphorylering blev analyseret ved Pi-ERK og Cdc25C antistoffer i western blotting.

Desuden LBH589 behandling resulterede i øget ERK phosphorylering og band skift af Cdc25C i en dosis- og tids- afhængig måde i LNCaP-celler (fig. 2B), hvilket korrelerede med den stigende population af G2 /M cell fase (fig. 2C). For at undersøge om den båndforskydning af Cdc25C repræsenteret hyper-phosphorylering under LBH589 behandling blev LBH589 behandlet LNCaP-lysat behandlet med CIP (phosphatase) alene, eller kombineret behandling med en phosphataseinhibitor. Bandet skift af Cdc25C fremkaldt af LBH589 blev fjernet ved CIP, men blev restaureret af phosphataseinhibitoren (figur 2D), hvilket indikerer Cdc25C hyper-phosphorylering.

Yderligere undersøger sammenhængen mellem ERK aktivering og Cdc25C hyper-phosphorylering af celler under LBH589 behandling blev Cdc25C-hyperphosphorylering induceret af LBH589 blokeret af MEK-inhibitorer U0126 og PD98059 i LNCaP-celler. Dette indikerede, at Cdc25C hyper-phosphorylering var en nedstrøms tilfælde af LBH589-induceret ERK aktivering (Figur 2E).

LBH589 induceret G2 eller M fase anholdelse og ERK-aktivering og bidrog til prometafasen celle-cyklus anholdelse

Ved immuno-fluorescens, distributions- mønstre af Cdc2 og Cdc25C mellem LNCaP og PC-3 celler blev yderligere undersøgt. LBH589 behandling resulterede i et tab af immuno-fluorescens intensitet Cdc25C i PC-3-celler, men ikke i LNCaP-celler. Cell morfologi og DAPI nukleare farvning repræsenterer LBH589-behandlet PC-3 og LNCaP celler blev anholdt i slutningen af ​​G2 og tidlig M fase (figur 3A, grøn, pile). For at bestemme om LBH589 induceret celle standset i G2 eller M fase, virkningen af ​​LBH589 på centrosom separation, de morfologiske kendetegn for tidlig mitose, blev undersøgt ved immunfarvning med y-tubulin antistoffer. Adskillelsen af ​​to centrosomer blev kun observeret i LBH589-behandlede LNCaP-celler (figur 3B), hvilket antyder, at ved LBH589 behandling blev PC-3-celler standset i den sene G2 fase og LNCaP-celler blev standset i den tidlige M fase (mest sandsynligt prometafasen ).

(A-B) Immuno-farvning af LNCaP og PC-3. Begge celler blev behandlet 75 nM LBH589 i 24 timer. Immunofarvning (A) med Cdc2 og Cdc25C antistoffer og (B) af γ-tubulin (grøn) og DAPI (blå) i vehikelkontrol (venstre) og LBH589 behandling (til højre) i LNCaP. (C-D) MEK inhibitor svækket LBH589-induceret prometafasen anholdelse i LNCaP. Cellerne blev forbehandlet 30 med UO126 i 30 minutter og successivt behandlet med LBH589 i 24 timer. (C) De cellecyklus blev analyseret ved PI-farvning og flowcytometri. (D) celler i metafase blev talt ved DAPI-farvning præsenteret som kondensat kromatin.

For at undersøge inddragelsen af ​​ERK-aktivering, blev LNCaP-celler behandlet med MEK-inhibitor, U0126, at inhibere ERK aktivitet i tilstedeværelse af LBH589. Den LBH589-medierede G2 /M anholdelse blev svækket af ERK hæmning i celler behandlet med UO126 (figur 3C). Desuden ERK hæmning reduceret LBH589-medieret prometafasen celler fra 24% til 13% (figur 3D), tyder på, at ERK aktivering spillet en vigtig rolle i LBH589-medieret prometafasen anholdelse i LNCaP celler.

LBH589 nedreguleret HDAC6 og vedvarende ERK aktivering

virkningerne af LBH589 på HDAC1, HDAC3 og HDAC6 blev kontrolleret. LBH589 nedreguleret HDAC6 i LNCaP men ikke i PC-3-celler (figur 4A). Derudover LBH589-medieret nedregulering af HDAC6 korreleret med ERK-aktivering i dosisafhængig måde, men kun fundet i LNCaP-celler (figur 4B). For at identificere hvilke HDAC var ansvarlig for ERK aktivering blev de tre proteiner slået ned med siRNA at undersøge ERK fosforylering status i 293T-celler, da 293T-celler havde høj transfektion effektivitet og LBH589 behandling også resulteret i prometafasen anholdelse og ERK aktivering af 293T celler (figur S1, S2, S3). Knock-down af HDAC6, men ikke HDAC1 eller HDAC3 ved siRNA signifikant induceret ERK fosforylering i 293T-celler (figur 4C).

(A) Screening af HDAC’er involveret i ERK aktivering. Immunoaktiviteten blottings af LBH589 behandlet cellelysater blev udført med viste antistoffer. (B) LBH589 inducerede nedregulering af HDAC6, som korrelerede med ERK-aktivering i LNCaP men ikke i PC-3. (C) Knockdown af HDAC6 steg i ERK aktivitet. 293T blev transficeret med siRNA af HDAC1, 3, 6, eller ikke-målretning i 72 timer. Lysaterne blev analyseret ved immunblotting. (D) ERK aktivitet var involveret i LBH589-medieret HDAC6 nedregulering. Cellelysater fra celler behandlet med LBH589 eller kombineret med UO126 forbehandling blev immuno-slettet.

De LNCaP celler blev derefter behandlet med LBH589 og MEK-inhibitor, U0126. Inhibering af LBH589-induceret ERK-aktivering restaureret HDAC6 proteinniveauer (figur 4D). Desuden ERK var, over-udtrykt i 293T-celler, hvilket resulterede i nedregulering af HDAC6 protein niveauer i forhold til EGFP-vektor alene (data ikke vist). Disse viste, at hæmning af HDAC6 aktivitet ved LBH589 induceret ERK-aktivering, som efterfølgende førte til nedregulering af HDAC6 proteinniveauer. En gensidig regulering kan derfor eksistere mellem HDAC6 og ERK signalvejen.

LBH589 induceret ERK aktivering gennem PP1 /c-Raf vej

En tidligere undersøgelse viste, at HDACi kan øge intracellulære ROS niveauer, og aktivere Ras-Raf signalvej [21]. De ROS niveauer af LNCaP- og PC-3 celler under LBH589 behandling blev derefter undersøgt. LBH589 behandling induceret prometafasen anholdelse, men ikke øge intracellulære ROS-niveauer i LNCaP, men inducerede et vist niveau i PC-3-celler (figur 5A). LBH589 behandling sænkede også serin 259-phosphorylering (inhiberende signal) og øget serin 338-phosphorylering (aktivering signal) af c-Raf, som korrelerede med ERK-aktivering i LNCaP men ikke i PC-3-celler (figur 5B). Disse foreslog, at LBH589-induceret ERK-aktivering kan være formidlet via c-Raf-aktivering.

(A) Analyse af ROS-produktion. De angivne celler blev behandlet med 75 nM LBH589 i 24 timer. ROS blev målt som beskrevet i afsnittet Materialer og fremgangsmåder. (B) Mønsteret af c-Raf-signalvejen på LBH589 behandling. Cellerne blev behandlet med LBH589 i 24 timer og lysaterne blev immuno-blottet med de angivne antistoffer. α-catenin var en belastning kontrol.

LBH589 skiftede PP1 interaktion med 14-3-3ζ og HDAC6

Over-ekspressionen af ​​PP1a, men ikke PP2A, forbedret dephosphorylering af c -Raf Ser259 og phosphorylering af Ser338, og derefter aktiveres yderligere nedstrøms ERK phosphorylering under LBH589 behandling i 293T-celler (data ikke vist). Disse resultater antydede, at LBH589 kan udløse PP1a at aktivere c-Raf ved dephosphorylere Ser259 og efterfølgende aktivering af ERK. Fordi begge phosphater af Cdc25C-Ser216 og c-Raf-Ser259 var substrater for PP1, blev virkningen af ​​LBH589 på Ser216 fosforylering af Cdc25C undersøges nærmere. LBH589 behandling reducerede Ser216 phosphorylering af Cdc25C på en dosis- og tidsafhængig måde i LNCaP-celler (figur 6A).

(A) LBH589 induceret Cdc25C-S216 dephosphorylering på en dosis- og tidsafhængig måde. LNCaP blev udsat for 75 nM LBH589 til forskellige tidspunkter eller på angivne LBH589 koncentrationer i 24 timer. Phosphorylering af Cdc25C-S216 blev udført ved immuno-blotting med Pi-Cdc25C-S216 antistof. (B-C) LBH589 behandling skiftede PP1a interagerende partner. Immunoaktiviteten udfældninger blev udført med anti-HDAC6 eller anti-14-3-3ζ. De udfældede prøver blev analyseret ved immuno-blotting under anvendelse af antistof mod PP1a, 14-3-3ζ, Lys-Ac (Pan-acetyleret lysin). IgG var en uspecifik pull-down styring.

14-3-3 var en chaperon protein for at bevare phosphorylering status S216 af Cdc25C og S259 af c-Raf ved at beskytte dem mod defosforylering af PP1 [ ,,,0],10,22]. Samspillet mellem 14-3-3 blev PP1a, og HDAC6 kontrolleres ved hjælp 14-3-3ζ, PP1a og HDAC6 antistoffer i co-immunopræcipitation analyse. LBH589 behandling øget 14-3-3ζ acetylering og dets samspil med PP1a (figur 6B). I modsætning hertil HDAC6 faldt dens interaktion med PP1a efter LBH589 behandling (figur 6C). Disse viste, at HDAC6 kunne være ansvarlig for 14-3-3ζ deacetylering at beskytte sine klient proteiner c-Raf og Cdc25C fra defosforylering af PP1a.

Diskussion

En tidligere undersøgelse viser, at LBH589 behandling årsager G2 /M-celle-cyklus anholdelse via nedbrydning af Aurora-kinaser i renalcellecarcinom (RCC) [6]. Tilsvarende nærværende undersøgelse tydeliggør endvidere, at LBH589 inducerer en sen G2 fasen gennem nedregulering af Aurora-kinaser i PC-3 prostatacancerceller med relativ resistens mod LBH589 behandling. HDACi udløse en G2 checkpoint i normale celler, der normalt er defekt i kræftceller, hvilket giver en forklaring på, hvorfor normale celler er som regel mere modstandsdygtige over for HDACi behandling [9]. De underliggende mekanismer involveret i LBH589 medieret G2 fasen mellem normale celler og prostatacancerceller kan være forskellige. Men resultater her indebærer, at LBH589-inducerede G2 anholdelse kan være en fænotype af cancerceller, der er mere tolerante over for LBH589 behandling.

I modsætning til LBH589-medieret G2 fasen anholdelse af PC-3 celler, LBH589 inducerer prometafasen standsning efter dyb apoptose af LNCaP-celler. Selvom de genetiske baggrunde for prostatakræft-cellelinier er forskellige, LBH589 behandling inducerer ERK aktivering og HDAC6 nedregulering i 22Rv1 og DU 145 andre end LNCaP celler (Figur S4) PCa cellelinjer. Men den fremtrædende prometafasen anholdelse kun forekommer i PCA celler med lav baseline niveauer af ERK fosforylering, som kan bæredygtigt fremkaldt af LBH589. LBH589 transient inducerer ERK-aktivering efter en times behandling, som hurtigt elimineres inden for 6 timer efter LBH589 behandling i PC-3 (data ikke vist).

Inhibering af HDAC6 aktivitet ved LBH589 kun inducerer forbigående ERK-aktivering og ingen HDAC6 proteinniveau ændring bemærkes i PC-3-celler. Dette fænomen svarer til forbigående ERK-aktivering induceret af mitogener, såsom EGF i PC-3-celler. Denne undersøgelse viser, at inhiberingen af ​​HDAC6 af LBH589 direkte opregulerer ERK-aktivering gennem c-Raf /PP1-vejen, som ligner mitogen stimulation, men med en helt modsat biologisk resultat af celle-cellecyklusstandsnings stedet for celleproliferation.

ERK aktivering, som reagerer på en række ekstracellulære stimuli såsom mitogener eller spændinger, resulterer i dramatisk forskellige biologiske konsekvenser, herunder proliferation, differentiering og celledød [23-25]. Konstant ERK-aktivering kan inducere celledød, når cellerne var under stress [26]. LBH589 inducerer vedvarende ERK aktivering via en gratis fremad regulering mellem HDAC6 og ERK i kræftceller, som ikke kun inducerer prometafasen anholdelse, men også udløser apoptose. Der er ingen detekterbar ekspression ændring af HDAC6 mRNA i LNCaP-celler efter LBH589 behandling (data ikke vist). Den proteasominhibitor genskaber HDAC6 proteinniveauer efter LBH589 behandling, hvilket antyder, at udtømningen af ​​HDAC6 proteiner kan afhænge af en proteasom-medieret nedbrydningsvej (data ikke vist). Men hvorfor LBH589 selektivt nedregulere HDAC6 proteiner og Aurora-kinaser A og B i visse specifikke kræftceller fortsat uklart.

HDAC6 tilhører klasse IIa undertype af HDAC familier. Det pendulfart mellem kernen og cytoplasmaet at nå sine biologiske funktioner. HDAC6 er den største deacetylase der er ansvarlig for deacetylering af α-tubulin og HSP90 at modulere microtubulin-afhængig transport, rekruttere mis-foldede proteiner, og transport til aggresomes for nedbrydning [27-29]. Bortset fra at deltage i mange normale cellulære funktioner, kan HDAC6 være påkrævet for effektiv oncogen transformation og kan være involveret i den kaskade af den transformerende vækstfaktor β1 (TGF-β1) -induceret epitel-mesenkymale overgang [30,31]. Disse angiver de vigtige roller HDAC6 i onkogene processer.

Det er blevet rapporteret, at akut myeloid leukæmi celler, der mangler i HDAC6 er meget resistente over hydroxamat gruppe HDACi [32]. Således kan HDAC6 tjene som en afgørende terapeutisk mål for HDACi i kræftbehandling. Da LBH589 er en potent hydroxamat gruppe HDACi med kraftig inhiberende virkning på HDAC6, LBH589 har den fordel klinisk anvendelse i behandlingen af ​​cancere med HDAC6 ekspression. Selv enzymaktiviteten af ​​HDAC6 kan hæmmes af LBH589 i både LNCaP og PC-3-PCA-celler, LBH589 selektivt udtømmer enten HDAC6 eller Aurora-kinaser i LNCaP og PC-3-PCA-celler med distinkte biologiske resultater, hhv. Denne undersøgelse rejser vigtige spørgsmål om, hvorfor LBH589 selektivt udtømmer enten HDAC6 eller Aurora-kinaser gennem en proteasom nedbrydningsvej i forskellige PCA celler. Forståelse af de molekylære mekanismer bag denne forskel i det terapeutiske respons af LBH589 på forskellige PCA celler kan give mere indsigt til den kliniske anvendelse af LBH589.

Resultaterne her bevise, at LBH589 inducerer ERK-aktivering ved at hæmme HDAC6 aktivitet i visse celler . ERK-aktivering styres af opstrøms Ras /Raf /MEK pathway [33]. Dephosphorylering af S259 af c-Raf ved to phosphataser, PP1 eller PP2A, resulterer i c-Raf-frigivelse fra 14-3-3 og giver mulighed for reaktivering af c-Raf, som igen udløser ERK aktivitet [34]. HDAC1, 6 og 10 er blevet rapporteret at danne et kompleks med PP1, hhv. HDACi selektivt forstyrre HDAC-PP1 kompleks og øge sammenslutning af PP1 og Akt, som bidrager til de antineoplastiske aktiviteter HDACi [35]. Nærværende undersøgelse viser, at LBH589 forstyrrer HDAC6 /PP1a kompleks og fremmer samspillet mellem PP1a og acetyleret 14-3-3ζ. Når PP1a er forbundet med 14-3-3ζ, PP1a stadig bevarer sin fosfataseaktivitet [36]. Med LBH589 skifte sin interagerende partner, kan PP1a ændre dets affinitet eller specificitet til substrater. Igen er et vigtigt spørgsmål rejst om, hvorvidt HDAC’er er involveret i cellecyklus regulering ved at ændre substrater ‘affinitet eller specificitet PP1a.

Udover ERK aktivering, hæmning af HDAC6 af LBH589 inducerer også Cdc25C hyper- phosphorylering af fjernelse af inhibitorisk phosphorylering af serin 216 i Cdc25C. LBH589-induceret dephosphorylering af S216 af Cdc25C er også reguleret af PP1a og 14-3-3ζ med de samme mekanismer, der er ansvarlige for S259 dephosphoryleringen af ​​c-Raf. Således HDAC6 ikke kun deltager i reguleringen af ​​c-Raf /PP1 /ERK signalvej, men også koordinerer ERK signalering kaskade til M fase cellecyklus overgang.

Denne undersøgelse foreslår en model til at forklare, hvordan LBH589 inducerer prometafasen arrestere. Når HDAC6 binder med en HDACi, som LBH589 i denne undersøgelse, kan det forårsage en konformationel ændring i HDAC6, der fører til dissociation af PP1a og styrkelsen af ​​14-3-3ζ acetylering. Acetyleret 14-3-3ζ har høj affinitet for binding med PP1a og modulere affiniteten af ​​PP1a binding til dets substrater. Endvidere er phosphater af c-Raf-Ser259 og Cdc25C-Ser216 dephosphoryleret med PP1a og disse inducerer konstant ERK-aktivering. Opretholde ERK-aktivering kan destabilisere HDAC6 proteiner og hyper-phosphorylere Cdc25C, der fører til prometafasen cellecyklusstandsningen af ​​LNCaP-celler (figur 7).

LBH589 binding til HDAC6 kan forårsage konformationel ændring på HDAC6, der fører til dissociation af PP1a og forbedring af 14-3-3ζ acetylering. Acetyleret 14-3-3ζ øget sin interagerende affinitet med PP1a og blandede sig i affinitet PP1a binding med underlaget. PP1a derefter dephosphoryleret S259 af c-Raf og S216 af Cdc25C, udløser ERK-aktivering. Konstant ERK-aktivering på grund af aktivering af c-Raf kunne destabilisere HDAC6 proteiner og hyper-phosphorylere Cdc25C, der fører til prometafasen cellecyklusstandsningen af ​​LNCaP-celler.

Afslutningsvis LBH589 inducerer vedvarende ERK-aktivering gennem fri fremad regulering, der inhiberer HDAC6 enzymaktivitet, efterfulgt af nedregulering af HDAC6 proteinekspression. Disse resultater besvare spørgsmålet om, hvordan ERK aktivering kan være ansvarlig for både celle spredning og vækst hæmning fænotyper. HDAC6 er en afgørende faktor afgørende for samspillet mellem Raf /ERK signalvejen og biologisk M fase celle-cyklus overgang, hvilket gør det til et perfekt mål for HDACi LBH589. Denne undersøgelse belyser yderligere LBH589-medieret sen G2 og tidlig M fase celle-cyklus anholdelse gennem distinkte molekylære mekanismer i PC-3 og LNCaP PCA celler med forskellige terapeutiske resultater. Derfor er de detaljerede mekanismer der er ansvarlige for LBH589-medierede væksthæmning af prostatacancerceller bragt i orden at give ny indsigt, som kan vejlede udformningen af ​​mere effektive strategier, der vil optimere HDACi anti-cancer terapi for klinisk oversættelse.

Materialer og metoder

Reagenser

LBH589 blev leveret af Novartis Pharmaceuticals (East Hanover, NJ) opløst i dimethylsulfoxid (DMSO). Suberoyl Bishydroxamic Acid (SBHA) og suberoylanilid hydroxamsyre (SAHA) var fra ATON Pharma (Tarrytown, NY). Propidiumiodid (PI), 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) blev RNase A og en proteaseinhibitorcocktail indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) . UO126 og PD98059 blev indkøbt fra Calbiochem.

Cell kultur

LNCaP, PC-3, og 22Rv1 blev venligst stillet til rådighed af Dr. Pei-Wen Hsiao (Agricultural Biotechnology Research Center, Academia Sinica, Taiwan ) [37]. DU 145 og 293T blev købt fra Bioresource Indsamling og Research Center (BCRC, Taiwan). PC-3 og 293T cellelinjer blev opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium, mens LNCaP og 22Rv1 blev dyrket i RPMI-1640. Den DU 145 blev opretholdt i modificerede Eagles medium. Alle medier blev suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum, 2 mM glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 50 U /ml penicillin og 50 mg /ml streptomycin. Cellerne blev dyrket ved 37 ° C i en 5% befugtet CO

2 /luftatmosfære.

MTT-assays

Cellerne blev udpladet i plader med 96 brønde ved en densitet på 3000 -5000 celler per brønd, afhængig af cellelinien, behandlet med vehikel (DMSO) eller forskellige doser af LBH589, SAHA, og SBHA anvender mindst fem brønde pr behandling. Ved 24, 48 og 72 timer af behandlingen blev mediet flyttet og 100 pi 1 mg /ml MTT blev tilsat før inkubation ved 37 ° C.