PLoS ONE: afvigende ekspression af proteiner involveret i signaltransduktion og DNA Reparation Veje i lungekræft og deres tilknytning til Klinisk Parameters

Abstrakt

Baggrund

Fordi cellesignalering og celle metaboliske veje udføres gennem proteiner, protein signaturer i primære tumorer er nyttige til at identificere de vigtigste knudepunkter i signalering netværk, hvis ændring er forbundet med malignitet og /eller kliniske resultater. Denne undersøgelse havde til formål at bestemme protein signaturer i primær lungekræft væv.

Metodologi /vigtigste resultater

Vi analyserede 126 proteiner og /eller protein phosphoryleringssteder i case-matchede normale og tumor prøver fra 101 lunge cancerpatienter med omvendt fase-protein array (RPPA) assay. Resultaterne viste, at 18 molekyler var signifikant forskellige (

s Restaurant 0,05) med mindst 30% mellem normale og tumorvæv. De fleste af disse molekyler spiller roller i celleproliferation, DNA-reparation, signaltransduktion og lipidmetabolisme, eller funktion som celleoverfladen /matrixproteiner. Vi har også validerede RPPA resultater ved Western blot og /eller immunhistokemisk analyse for nogle af disse molekyler. Statistiske analyser viste, at Ku80 niveauer signifikant højere i tumorer af ikke-rygere end hos dem af rygere. Cyclin B1 niveauer blev signifikant overudtrykt i dårligt differentierede tumorer mens COX2 niveauer blev signifikant overudtrykt i neuroendocrinal tumorer. Et højt niveau af Stat5 er forbundet med gunstige overlevelse resultat for patienter behandlet med kirurgi.

Konklusioner /Betydning

Vores resultater viste, at nogle molekyler involveret i DNA-skader /reparation, signal transduktioner, lipidmetabolisme og celledeling var drastisk afvigende i lungekræft væv, og Stat5 kan tjene en molekylær markør for prognose af lungekræft

Henvisning:. Han Y, Zhou Z, Hofstetter WL, Zhou Y, Hu W, Guo C et al. (2012) afvigende ekspression af proteiner involveret i signaltransduktion og DNA Reparation Veje i lungekræft og deres tilknytning til kliniske parametre. PLoS ONE 7 (2): e31087. doi: 10,1371 /journal.pone.0031087

Redaktør: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, USA

Modtaget: Juli 21, 2011; Accepteret: 2 januar 2012; Publiceret: 10. februar, 2012 |

Copyright: © 2012 Han et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er støttet af National Cancer Institute tilskud: R01CA-092.487 (tildelt BF), RO1CA-124.951 (tildelt BF), National Institutes of Health Core Grant 3P30CA-016672-32S3, The University of Texas MD Anderson Cancer center Support Grant CA- 016.672 – Lung Program og Funktionelle Proteomics Reverse-Phase Protein Array Core facilitet, Homer Flower Gene Therapy Research Fund, Charles Rogers Gene Therapy Fund, Flora og Stuart Mason Lung Cancer Research Fund, Charles B. Swank Memorial Fund for esophageal kræft Forskning, George O. Sweeney fond for esophageal Cancer Research, den Phalan Thoracic Gene Therapy Fund, og MW Elkins Begavet fond for Thoracic Kirurgisk Oncology, Chapman Foundation, National Natural Science Foundation of China (81172113, 81071912) og “1510-projektet “af Third Military Medical University of China (tildelt YH). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Molekylær profilering af lungekræft gennem gen array-assays for mRNA og microRNA har ført til identifikation af molekylære signaturer, der er potentielt nyttig til at forudsige patientens overlevelse og sygdom tilbagefald og /eller svar på individuelle kemoterapeutiske lægemidler baseret på hierarkisk og probabilistisk gruppering af mRNA [1] og microRNA niveauer [2]. Desuden har studier af enkelt-nukleotid-polymorfier af genomisk DNA førte til identifikation af potentielle gen loci i kromosomet 15q25 region [3], der koder for nicotinacetylcholinreceptor subunit gener, der er stærkt forbundet med lungecancer modtagelighed. Men for de fleste gener, er der ingen signifikant korrelation mellem mRNA og protein niveauer [4]. Således er de vigtigste signalveje, der afspejler de sygdomsfremkaldende omdanne processer mangler at blive identificeret. Fordi de fleste signaltransduktion og pathway regulering gennemføres af proteiner gennemgår posttranskriptionel modifikation, såsom phosphorylering, som ikke kan påvises ved DNA, mRNA eller miRNA analyser, er karakterisering af proteinniveauer og proteinphosphorylering status nødvendig for at opnå protein-signaturer, der afspejler funktionelle og /eller metaboliske ændringer i lungekræft og /eller reaktion på terapeutiske midler såsom kinase hæmmere.

Indsatsen er blevet gjort for at bestemme protein signaturer i lungekræft ved at bruge todimensional gelelektroforese og efterfølgende proteinidentifikation i masse spektrometri assay eller ved hjælp af direkte massespektrometri analyser [5]. Mens denne teknologi er nyttig til identifikation af proteiner udtrykkes differentielt i tumorvæv, er det sandsynligt ikke tilpasses til den hurtige gennemløb analyser er nødvendige for klinisk anvendelse på grund af de tidskrævende processer involveret, muligheden for signal forureninger på grund af tusindvis af datapunkter involveret i analysen, og den mulige korruption af datasæt skyldes eksperimentelle design spørgsmål [6].

den seneste fremkomsten af ​​protein microarray teknologi kan tillade os at identificere kritiske noder eller interaktioner inden for netværket af cellulære signalveje . Fordelen ved RPPA fremgangsmåde er, at en enkelt test probe (antistof) anvendes til hver opstilling, så test betingelse er konsistent for hvert antistof, hvorved der tilvejebringes bedre reproducerbarhed og følsomhed end andre proteinarray teknikker. Med grundigt vurderes og valideres antistoffer, kan en RPPA anvendes til at påvise signal forskelle i et par tusinde molekyler i at teste prøver [7]. Derfor er denne teknologi er nyttig til at overvåge ændringer i proteinniveauer og proteinphosphorylering over tid, før og efter behandling, mellem tumor og normalt væv, og mellem respondere og non-respondere. Når differentielle mål er identificeret, er det muligt at anvende konventionelle metoder til at teste en lille delmængde af molekylære biomarkører for prognosticering eller forudsigelse af behandlingsrespons. Til dette formål har vi samlet case-matchede normale og maligne lungevæv prøver af 101 patienter og bestemmes deres proteinniveauer og proteinphosphoryleringsbegivenheder status ved hjælp RPPA fremgangsmåde og 126-antistoffer. Her rapporterer vi, at flere molekylære knuder, der er kritiske i cellevedhæftning, DNA-reparation, celleproliferation, og signaltransduktion blev differentielt udtrykt mellem normale og cancerøse væv, nogle af disse var forbundet med kliniske parametre, herunder overlevelse resultater.

Resultater

Patient og Tumor Kendetegn

Vi indsamlede case-matchede normale og maligne lunge vævsprøver fra 101 patienter. Karakteristik af de patienter, og tumorerne er opsummeret i tabel 1. Patienterne var aldre 42-86 y, med en gennemsnitsalder på 65 år, og 55% var kvinder. De fleste af patienterne (93%) var kaukasere. Adenocarcinom og pladecellecarcinom udgjorde 56% og 31% af histologiske typer hhv. Størstedelen af ​​patienterne (66%) havde stadie I-sygdom. Omkring 50% af tumorer blev dårligt differentieret, og 40% var moderat differentieret. Halvfems patienter (89%) havde en historie af rygning /rygning. Fireogtyve patienter havde neoadjuverende kemoterapi, og én havde neoadjuverende strålebehandling.

Differential Expression mellem tumor og normalt væv afsløret af RPPA

For hver prøve og hvert antistof, signalet i RPPA analyser blev sammenlignet mellem normale og tumorvæv. Signalet forskel mellem normale og tumorvæv blev beregnet som følger: [(gennemsnit af tumorvæv-gennemsnit af normale væv) /(gennemsnit af normale væv × 100%)]. Af 126 proteiner eller phosphoryleringssites analyseret, 18 havde signal forskelle, der var større end 30%, og var statistisk signifikant (

s

0,05) i alle de normale og tumor prøver analyseret (tabel 2). Disse 18 molekyler kan kategoriseres som molekyler, der er forbundet med celleproliferation (cyklin B1), adapter molekyler i signaltransduktion (14-3-3zeta, IRS1-pS307, og IGFBP2), molekyler i lipidmetabolismen (COX2 og ACC-pS79), molekyler involveret i DNA skader svar (Ku80, Chk2, og ATM), celleoverfladen eller matrix molekyler (caveolin 1, CD31, og kollagen type VI), og molekyler i signalveje (PI3K /AKT-vejen: PI3K-p85, mTOR, og S6K Src /Stat pathway: Stat5 og Src, og MAP kinase pathway: p38-pT180). Signalintensiteter for cyclin B1, IGFBP2, og caveolin 1 i vævsprøver fra hvert tilfælde er vist som eksempler i fig. 1. De fleste af disse molekyler er blevet rapporteret at spille kritiske roller i forskellige cancerformer eller at have ændret ekspression i forskellige cancerformer. For eksempel tab af caveolin 1-ekspression [8], [9] og overekspression af cyclin B1 [10], [11] i lungekræft væv tidligere er blevet rapporteret i undersøgelser med cDNA arrays og immunhistokemisk analyse.

A) Signal intensitet (Y-aksen) for hver enkelt sag (X-aksen) for molekyler af cyklin B1, IGFBP2, og caveolin 1. B) satte distribution af signaler i normale og tumorvæv.

Fordi 88 af de 101 tilfælde i denne undersøgelse var enten adenocarcinom eller pladecellekarcinom, vi undersøgte, om disse 18 molekyler var signifikant forskellige mellem normale og tumorceller vævsprøver til de to store undertyper af ikke-småcellet lungekræft. Resultaterne viste, at 13 af de 18-molekylerne var signifikant forskellige mellem normalt og tumorvæv for både adenokarcinom og pladecellecarcinom (p ≤ 0,05, tabel S2), en konstatering af samme størrelsesorden som når alle prøver blev analyseret sammen. To molekyler (COX2 og S6) var ikke signifikant forskellige, når adenocarcinom og pladecellecarcinom blev analyseret separat, mens PI3K-p85, Src, og mTOR forblev signifikant forskellig mellem normale og tumorvæv i adenokarcinom, men ikke i pladecellecarcinom. Hvorvidt PI3K /mTOR /S6 og Src veje er mere kritiske i adenocarcinom end i planocellulært karcinom, eller om dette fund skyldes mindre antal pladecellekræft prøver i undersøgelsen er ikke klart.

Validering af RPPA data

Vi udførte Western blotting-analyse på molekyler, hvis udtryk blev ændret i relativt mange tumorvæv, herunder cyclin B1, caveolin 1, collagen VI, ACC1 /pS79, CHK2, og IGFBP2. Resultaterne viste, at de opnåede fra Western blot-analyse af data matches dem af RPPA assay (fig. 2, fig. S1), hvilket viser, at de opnåede fra RPPA assay data var pålidelige og kan valideres ved Western blot analyse.

cyclin B1, caveolin 1, collagen type VI, blev ACC-pS79, CHK2, og IGFBP2 i normale og primære lunge tumorvæv analyseret ved Western-blot i mindst fire tilfælde, hvor RPPA viste signal forskel i normale væv og tumorvæv. De Western blot resultaterne var i overensstemmelse med dem fremkommer ved RPPA.

Hverken RPPA assay eller Western blot-analyse gav oplysninger om, hvad typer af celler, tumor eller stromale, bidrog til de observerede forskelle. For at bestemme de celletyper, hvor proteinerne blev differentielt udtrykte, udførte vi immunhistokemisk analyser for fem molekyler (ACC-pS79, Chk2, IGFBP2, cyclin B1, og caveolin 1) på prøver, der viste forskel mellem normale og tumorvæv. Resultaterne viste, at forskelle i ekspressionen af ​​alle fem molekyler blev afledt fra ændret ekspression i cancerceller, men ikke i stromale celler (Fig. 3). Slående heterogenitet i proteinekspression i tumorceller blev observeret for cyclin B1. Kun en del af tumorceller blev farvet kraftigt med cyclin B1 antistof henviser andre tumorceller i samme tumor udviste meget lav eller negativ farvning for cyclin B1, muligvis på grund af forskellig status cellecykler. Cyclin B1 ekspression vides at være cellecyklusafhængig og toppede ved G2 /M [12]. Overekspressionen eller tab af ekspression af andre molekyler var langt mindre heterogen.

Forøget ekspression af ACC-pS79, CHK2, IGFBP2, cyclin B1, STAT5, ATM, og Ku80 og nedsat ekspression af caveolin 1 i tumorvæv blev sammenlignet med normale væv fra de samme tilfælde viste withconsistent med fund fremkommet ved RPPA og Western blot-analyser. 40 × forstørrelse.

Nanjundan

et al.

Nylig rapporteret en RPPA profilering analyse på 46 lungekræft tilfælde med 63 proteiner eller protein phosphoryleringssteder og identificeret flere proteiner blev udtrykkes forskelligt i den primære lungekræft væv [13]. Vi sammenlignede derfor resultaterne af igangværende studie med den, Nanjundan undersøgelse. De to undersøgelser anvendt helt separate prøvesæt. Alle prøver anvendt i Nanjundan undersøgelse blev indsamlet før 2000, mens prøver, der anvendes i denne undersøgelse blev indsamlet efter 2006. Otteogfyrre proteiner /protein phosphoryaltaion steder blev testet i de begge undersøgelser. Otte af elleve (72,7%) markører, der var signifikant forskellige mellem normale og cancer væv i Nanjundan undersøgelse har lignende signifikante forskelle i de igangværende undersøgelser. Tre molekyler (27,3%) (FAK, β-catenin og AKT), der var signifikant forskellige (p = 0,002-0,003) i Nanjundan undersøgelse var ikke signifikant i denne undersøgelse. Dette resultat indikerer, at validering af RPPA resultater fra separate undersøgelser vil være vigtigt, selv om hovedparten af ​​de forskelligt udtrykte molekyler er konsistente i de to undersøgelser.

Tre (caveolin-1, cyclin B1 og Src-pY527) af fire markør signatur, der adskiller NSCLC fra normal lunge i Nanjundan undersøgelse var også signifikant forskellige mellem normale og tumorvæv af de igangværende undersøgelser. Vi anvendte derfor Nanjundan træning sæt (25 tilfælde) for at teste, om disse tre markør signatur kan anvendes til at differentiere hele datasættet (101 tilfælde) af den aktuelle undersøgelse. Resultatet viste, at disse tre markører, enten alene eller i kombination, kunne skelne tumor fra den normale for den aktuelle undersøgelse med forskellige nøjagtigheder, følsomheder og særlige (tabel 3). Generelt en kombination af to eller tre markører forbedret enten nøjagtighed, sensitivitet eller specificitet.

Association med Clinical Data

Vi analyserede, om ekspressionen af ​​de 18 molekyler anført i tabel 2 i tumorvæv blev forbundet med kliniske parametre. Statistik analyse viste, at niveauer af disse molekyler i tumorvæv ikke var signifikant associeret med klinisk udvikling eller køn. , Udtryk for Ku80 var imidlertid betydeligt højere i prøverne af patienter uden at ryge historie end dem med rygning historie (

s

= 0,004). Angivelse af cyclin B1 var signifikant højere i dårligt differentierede tumorvæv end i moderat eller godt differentierede tumorvæv (

s

0,025). På den anden side, ekspression af ATM, Ku80, og S6 var signifikant højere i veldifferentieret tumorvæv end i dårligt eller moderat differentierede tumorvæv (fig. 4). Når ekspression i forskellige histologiske typer blev sammenlignet, udtrykkene for ATM, Ku80, IGFBP2, IRS1-pS307, og S6 var signifikant højere i neuroendocrinal carcinom end i adenocarcinom eller pladecellecarcinom (

s Restaurant 0,05). Dette resultat antyder, at ekspression af visse molekyler var dramatisk anderledes i neuroendocrinal tumorer sammenlignet med dem i adenocarcinom eller pladecellecancer, hvorimod niveauet for differentielt udtrykte proteiner anført i tabel 1 var mere eller mindre ens mellem adenocarcinom og pladecellekræft. Alligevel grund af relativt lave antal neuroendocrinal tumorer anvendt i denne undersøgelse, er det ikke klart, om der eksisterer en specifik molekylær signatur for denne type kræft.

Protein niveauer i tumorvæv detekteres i RPPA assay blev analyseret for foreninger med kliniske parametre af patienterne. Molekylet, der var signifikant forskellig i tumorer baseret på kliniske parametre analyseret vises på toppen af ​​hver graf. De kliniske parametre vises i bunden af ​​hver graf. De histologi og differentiering diagnoser var baseret på patologiske rapporter i klinisk database. * Angiver, at forskellen var signifikant sammenlignet med andre grupper i den samme graf (

s

0,05).

Association med Survival Outcomes

For at bestemme hvorvidt niveauer af disse proteiner er forbundet med de kliniske resultater, udførte vi overlevelse analyse af de differentielt udtrykte protein markører er vist i tabel 1 under anvendelse Kaplan-Meier-metoden. Kort fortalt adskiller vi patienter i to grupper baseret på medianen ekspression værdien af ​​hver enkelt markering, der er udpeget som høje og lave udtryksgrupper, og derefter bruge Kaplan-Meier algoritme til at beregne overlevelseskurver for de to definerede grupper af hver markør. Resultatet viste, at niveauerne af Stat5 var signifikant associeret med overlevelse resultater ved analyse med både trin I-III-patienter (p = 0,032) og med stadium I-patienter kun (p = 0,014) (fig. 5). Patienter med et højt niveau af Stat5 i deres tumorvæv havde gunstig overlevelse resultater sammenlignet med dem med et lavere niveau af Stat5, tyder på, at Stat5 kunne være en nyttig markør for prognose af lungekræft.

Kaplan-Meier analyse om sammenslutning af Stat5 niveauer og overlevelse resultater for fase i-III (A) (n = 50 for hver gruppe), og fase i kun (B) patienter (n = 33 for STAT5 høj gruppe, 34 for STAT5 lav gruppe).

diskussion

Vi analyserede molekylære forskelle i protein eller protein phosphorylering niveauer mellem normale og lungekræft væv i 101 prøver ved RPPA assay. Af 126 molekyler analyseret, vi identificeret 18 molekyler, der var dramatisk ( 30%) og statistisk signifikant (

s

0,05) forskellig mellem normale og tumor prøver. Western blot-analyse og /eller Immunohistopatologisk assays af flere molekyler valideret de opnåede resultater fra RPPA arrays, hvilket viser, at resultaterne fra RPPA analyse er pålidelige. Desuden er en sammenligning med en RPPA undersøgelse foretaget på en anden af ​​patientprøver viste, at resultaterne af RPPA profilering var yderst reproducerbar og konsistent i separate undersøgelser med separat sæt patientprøver. Vores resultater viser også, at ekspressionen af ​​adskillige molekyler i tumorvæv var forbundet med rygning historie, differentiering og histopatologiske typer lungekræft.

En række biomarkører identificeret her er i overensstemmelse med dem, der rapporteres i litteraturen med hensyn af deres ændrede gen udtryk i tumorvæv, herunder caveolin 1 [8], [9], cyklin B1 [10], [11], 14-3-3zeta [14], Stat5 [15], aktiveret p38 [16], og IGFBP2 [17]. Men for nogle molekyler, nogle modstridende resultater blev rapporteret af andre tidligere. For eksempel blev CHK2 ekspression eller dets aktivering fundet at være formindsket i ikke-småcellet lungecancer-tumorvæv af et kommercielt tilgængeligt vævsarray [18], eller forhøjet i 50% af kirurgisk resektion lunge og bryst tumorprøver fra ubehandlede patienter [ ,,,0],19]. Vi fandt, at CHK2 ekspression blev forøget i både adenocarcima og pladecellecarcinom lungevæv, der består med det rapporteret af DiTullio et al [19]. Forøget COX2-ekspression blev fundet i vores undersøgelse, men det var mindre hyppige end rapporteret af Hida et. al i japanske patienter, hvor en betydelig stigning i COX2 ekspression blev observeret i 70% af invasive adenocarcinom sager [20]. Vores resultat var i overensstemmelse med det rapporteret af Khuri et al, der bemærkede, at kun nogle få tilfælde havde stærk COX2 udtryk i tumorvæv [21].

Interessant, viste vores resultater, at flere molekyler involveret i DNA-skader /reparation (ATM, CHK2 og Ku80) blev forhøjet i tumorvæv. Øget mRNA-niveauer af ATM og DNA-PKcs, men ikke af Ku80, blev påvist i tumorvæv sammenlignet med tilstødende normale væv [22]. Men lidt om ATM proteinekspression i primær lungekræft væv. ATM, CHK2, og /eller Ku80 betragtes som tumorsuppressorgener der er involveret i DNA-skade responset [23], [24]. Interessant nok blev konstitutiv aktivering af ATM /CHK2 pathway fundet i p53 mutant cancerceller [19]. Stigningen af ​​disse DNA-skade responset /reparation molekyler i tumorvæv kan afspejle tilstedeværelsen af ​​genomet ustabilitet i kræftceller, et fælles træk, at skelne kræft fra normale væv [25]. Det er bemærkelsesværdigt, at overekspression af Ku80 blev fundet i hoved- og halscancer og hudkræft [26], [27], og kan være forårsaget af aktivering af NFKB og COX2 [28]. Alternativt forøget ekspression af Ku80 i ikke-ryger patienter eller neuroendokrine tumorer kan afspejle en stor efterspørgsel efter reparation af dobbelt strengbrud ved ikke-homolog endesammenbinding i disse cancervæv fordi Ku80 er kritisk i denne DNA-reparationsvej. De molekyler kan tjene som en markør for cancerterapi målrette DNA-reparationsvej [29]. Fordi fem og tyve patienter inkluderet i dette studie havde forskellige neoadjuverende kemoterapi eller strålebehandling, vi undersøgt, om øget ekspression af disse molekyler var forbundet med kemo- og strålebehandling. Statistisk analyse viste, at forøget ekspression af ATM, CHK2, og Ku80 ikke var forbundet med neoadjuvent kemoterapi eller strålebehandling. Således blev forøget ekspression af disse DNA-skader /reparation molekyler usandsynligt induceret af behandling, men snarere en iboende egenskab af primære tumorer.

Adskillige deregulerede proteiner identificeret her er blevet undersøgt som terapeutiske mål for cancerterapi. Små molekyler eller kinase inhibitorer rettet mod vækstfaktorreceptorer og PI3K /AKT /mTOR, Src /Stat, p38 og pengeautomat /Chk2 veje blev grundigt undersøgt til behandling af cancer, både præklinisk og klinisk, herunder behandling for lungekræft [29] – [ ,,,0],31]. En nylig undersøgelse viste, at inhibering af ATM eller CHK2 er tilstrækkelig til at sensibilisere p53-deficiente tumorceller, men ikke p53 vildtypeceller, at genotoksisk kemoterapeutisk middel cisplatin eller doxorubicin [32], hvilket antyder, at kombinationen af ​​cisplatin eller doxorubin med ATM eller CHK2 hæmmere kunne gavne patienterne bærer p53 mutant tumorer. Vores resultater viste også, at øget ekspression af STAT5 kan tjene som gunstig prognostisk biomarkør for patienter med lungecancer behandlet med kirurgi. Selvom de underliggende mekanismer mangler at blive undersøgt nærmere, STAT5 som en tumor markør for gunstig prognose er blevet rapporteret for brystkræft [33] – [35] og nasopharyngeal kræft [36]. Beviser viste, at STAT5 fremmer homotypisk adhæsion og inhiberer invasive egenskaber af humane brystkræftceller [34]. Om det samme sker for lungekræft celler mangler at blive undersøgt yderligere. Men den betydelige sammenslutning af STAT5 med kliniske resultater, navnlig i fase I lungekræft, foreslog, at STAT5 kunne være en nyttig prognostisk biomarkør for lungekræft.

Materialer og metoder

Menneskelig Lung Tissue prøver

Normalt og maligne lunge vævsprøver blev indsamlet mellem 2006 og 2009 fra kirurgisk fjernede prøver under en forsøgsprotokol Lab-90-020 med informeret samtykke fra patienterne. Undersøgelsen blev godkendt af de lokale etiske komité (Institutional Review Board på The University of Texas MD Anderson Cancer Center). De normale væv var mindst 5 cm fra kanten af ​​tilsvarende tumorer i de samme prøver. Både normale og tumorvæv blev indsamlet fra operationsstuen umiddelbart efter prøverne blev fjernet fra patienter. I alle tilfælde blev histologi kvalitetskontrol udføres af en thorax patolog på vævssnit. Tumorprøver blev inkluderet i analysen hvis procentdelen af ​​maligne celler til stede i prøven var ≥70%. Normale lung prøver fra de samme patienter blev gennemgået for at bekræfte, at de ikke indeholdt maligne celler. Alle prøver blev delt i to portioner: én portion var øjeblikkeligt frosset og opbevaret i flydende nitrogen for protein ekstraktion; den anden del blev fikseret i formalin og indstøbt i paraffin til rutinemæssige histologiske eller immunhistokemiske undersøgelser. Parrene af matchede prøver blev høstet, forarbejdet, og analyseret på samme tid, under de samme protokoller.

RPPA Assay

RPPA assay blev udført på Functional Proteomics Reverse Phase Protein Array Core facilitet på vores institution, som vi tidligere beskrevet [37]. Kort fortalt blev Vævsprøverne vasket to gange i iskold PBS og derefter homogeniseret i RPPA lysepuffer [1% Triton X-100, 50 mmol /l HEPES (pH 7,4), 150 mmol /l NaCl, 1,5 mmol /l MgCl

2, 1 mmol /L EGTA, 100 mmol /l NaF, 10 mmol /L Nappi, 10% glycerol, 1 mmol /l Na

3VO

4, 1 mmol /l phenylmethylsulfonylfluorid og 10 ug /ml aprotinin]. Efter centrifugering blev supernatanten opsamlet, og proteinkoncentrationen blev bestemt ved rutine (

f.eks. Salg, Bradford) assays og derefter indstillet til 1-1,5 mg /ml ved tilsætning lysepuffer. De væv lysater blev blandet med 1/4 volumen 4 × SDS-prøvebuffer indeholdende 40% glycerol, 8% SDS, 0,25 M Tris-HCl (pH 6,8) og 10% (vol /vol) 2-mercaptoethanol (tilsat frisk) . To-fold serielt fortyndede væv lysater (fra ufortyndet til 1:16 fortynding) blev trykt på nitrocellulose-coatede objektglas (Whatman, Inc.) ved anvendelse af en GeneTAC G3 arrayer (Genomic Solutions), sammen med tilsvarende positive og negative kontroller fremstillet ud fra fortyndingspuffer. I alt 126 validerede antistoffer specifikke for proteiner eller deres phosphorylerede sites, der er involveret i forskellige signalveje var tilgængelige og anvendes i RPPA (se tabel S1 for antistoffer anvendt i denne undersøgelse). Hvert objektglas blev probet med en valideret primært antistof plus et biotin-konjugeret sekundært antistof. Signalet blev amplificeret ved anvendelse af et DakoCytomation katalyseret systemet (Dako) og visualiseret ved 3,3′-diaminobenzidintetrahydrochlorid kolorimetrisk reaktion. Objektglassene blev scannet, analyseres og kvantificeres ved hjælp af personligt software, Microvigene (VigeneTech, Inc.), for at generere spot intensitet. Signaler fra hver fortynding blev udstyret med den ikke-parametrisk model udviklet af Institut for Bioinformatik og Computational Biologi på MD Anderson [38]. Protein- koncentrationer af hvert sæt objektglas blev derefter normaliseret og korrigeret tværs prøver ved de lineære udtryk værdier, ved hjælp af medianen ekspressionsniveauer af alle antistof-eksperimenter for at beregne en loading korrektionsfaktor for hver prøve, som tidligere beskrevet [13], [37] .

Western blot analyse

for at validere resultaterne fra RPPA analyser, vi udførte Western blot-analyse for en delmængde af molekyler, der viste signifikant forskel mellem normale og cancer væv. Ca. 40 mg af hver frossen vævsprøve blev vasket to gange i kold PBS og homogeniseret i 0,5 ml iskold lysepuffer. Ekstrakter svarende til 50-60 ug af det totale protein blev separeret ved 10% SDS-polyacrylamidgelelektroforese, derefter overført til nitrocellulosemembraner. Western blot-analyse blev udført som tidligere beskrevet [37]. Antistoffer til IGFBP2, caveolin-1, CHK2 (1C12), og phospho-acetyl-CoA-carboxylase (ACC-pS79) blev indkøbt fra Cell Signaling, antistof til cyclin B1 var fra Epitomics, og collagen type VI fra Santa Cruz Biotechnology.

immunhistokemisk farvning og evaluering

De samme antistoffer anvendt til Western blot-analyse blev anvendt til immunhistokemisk farvning. Formalinfikserede og paraffin vævssnit (5 um tykke) blev deparaffineret, hydreret, og opvarmes i en damper for antigen hentning. Objektglassene blev derefter farvet med forskellige antistoffer som beskrevet ovenfor. Væv der ikke er inkuberet med en kontrol-antistof til mus IgG i stedet for et primært antistof blev anvendt som en negativ kontrol.

Statistical Analysis

Analyse af varians blev udført ved anvendelse af Statistica software (StatSoft, Inc. ) til sammenligninger mellem grupper. Studerendes

t

test blev anvendt til sammenligning mellem to grupper. Diagonalen lineær diskriminant analyse (DLDA) blev anvendt til klassificering og forudsigelse af normale og tumorvæv. Overlevelsesdata vil blive analyseret ved anvendelse af Kaplan-Meier-metoden og Cox ‘proportional model. En

s

-værdi af 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Støtte oplysninger

figur S1.. Salg Protein niveauer detekteret ved Western blot-analyse i 6 yderligere tilfælde for IGFBP2 og CHK2. IGFBP2 og CHK2 i normal (N) og primær lungetumor (T) væv blev analyseret ved Western-blot i yderligere 6 tilfælde, hvor RPPA viste signal forskel i normale væv og tumorvæv. β-actin blev anvendt som lastning kontrol

doi:. 10,1371 /journal.pone.0031087.s001

(TIF)

tabel S1.

Expression forskel i adenokarcinom og skællede kræft *

doi:. 10,1371 /journal.pone.0031087.s002

(DOC)

tabel S2. Salg Proteiner og phosphoryleringssteder anvendes i RPPA undersøgelser.

doi:. 10,1371 /journal.pone.0031087.s003

(DOC)

Tak

Vi takker Markeda Wade for redaktionel gennemgang