PLoS ONE: Dybt Sekventering af MicroRNA Transkriptomet i kolorektal cancer

Abstrakt

Kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de førende årsager til kræft dødsfald og søgen efter prognostiske biomarkører, der kan forbedre behandling beslutninger er berettiget. MikroRNA’er (miRNA) er korte ikke-kodende RNA-molekyler er involveret i regulering af genekspression og er blevet foreslået som mulige biomarkører i CRC. For at karakterisere miRNA transkriptomet, blev en stor kohorte herunder 88 CRC tumorer med langsigtet opfølgning dyb sekventeret. 523 modne miRNA blev udtrykt i vores kohorte, og de udviste stort set ensartede ekspressionsmønstre tværs tumorprøver. Få associationer blev fundet mellem kliniske parametre og miRNA ekspression, blandt dem, lav ekspression af MIR-592 og høj ekspression af MIR-10b-5p og MIR-615-3p var forbundet med tumorer placeret i højre colon forhold til den venstre tyktarm og endetarm. Høj ekspression af MIR-615-3p var også forbundet med dårligt differentieret tumorer. Ingen prognostiske biomarkør kandidater til overordnede og metastase overlevelse blev identificeret ved at anvende den LASSO metode i en Cox proportionel risiko model eller univariate Cox. Undersøgelse af de fem mest rigeligt udtrykte miRNA i kohorten (miR-10a-5p, miR-21-5p, miR-22-3p, miR-143-3p og miR-192-5p) viste, at deres kollektive udtryk repræsenterede 54% af de fundne miRNA sekvenser. Pathway analyse af målgener, der reguleres af de fem mest højt udtrykte miRNA afdækket et betydeligt antal gener involveret i CRC bane, herunder APC, TGFp og PI3K, hvilket antyder, at disse miRNA er relevante i CRC.

Henvisning : Schee K, Lorenz S, Worren MM, Günther CC, Holden M, Hovig E, et al. (2013) Deep sekventering af MicroRNA Transkriptomet i kolorektal cancer. PLoS ONE 8 (6): e66165. doi: 10,1371 /journal.pone.0066165

Redaktør: Georgina L. Hold, University of Aberdeen, England

Modtaget: Februar 17, 2013; Accepteret: Maj 2, 2013; Udgivet: 18 juni 2013

Copyright: © 2013 Schee et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra det sydøstlige Norge Regional Health Authority og fra det norske Cancer Society. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

MikroRNA’er (miRNA) er evolutionære bevarede små (~20-22 nt lang), ikke-kodende RNA’er, der regulerer genekspression ved binding til 3’UTR af mRNA for derved at inhibere translation [1]. De kan binde med delvis komplementaritet til mRNA til potentielt nedregulere flere mRNA. Dette gør de efterfølgende undersøgelser noget udfordrende med flere potentielle mål for hver miRNA. I dag er der ca. 1500 miRNA kommenteret i miRNA-databasen (miRBase) [2], og det skønnes, at op til 60% af protein kodning gener kan reguleres ved miRNA [3]. MiRNA er afgørende for normal pattedyr udvikling og er involveret i finjustering mange biologiske processer, såsom celledeling, differentiering, apoptose og stofskifte, og deres inddragelse i kræft har udløst øget interesse i miRNA biologi [4] – [6]. De er blevet foreslået som mulige biomarkører på grund af deres regulerende funktioner, kemisk stabilitet og muligheden for at måle miRNA i serum, plasma, afføring og vævsprøver [7] – [10].

Kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de mest almindelige kræftformer i vestlige lande og en førende årsag til kræft dødsfald. Det er en heterogen sygdom karakteriseret ved akkumulering af genetiske og epigenetiske begivenheder og påvirkes af livsstil [11], [12]. behandling beslutninger er stadig i alt væsentligt baseret på den anatomiske omfanget af sygdom på diagnosetidspunktet, og søgen efter bedre biomarkører er berettiget. MiRNA er blevet undersøgt for deres potentielle rolle som diagnostiske, prognostiske og terapeutiske biomarkører i CRC hjælp hybridisering baseret array-teknologi og kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) [13] – [16]. Anvende ekspressionsvektorer microarrays, kan detekteres ekspression af en stor mængde af forudvalgte miRNA, og påvisningen miRNA er baseret på signalintensiteter. Relative ekspression kan beregnes ved hjælp QRT-PCR, men når de udvider til flere parallelle analyser, at antallet af miRNA muligt analysere og RNA mængde kan som begrænsninger. Deep sekventering har vist sig som en attraktiv tilgang til global miRNA-analyse, fordele, herunder sammenlægning af prøver til high-throughput formål, en bred påviselig udtryk rækkevidde, evnen til at analysere ekspressionen af ​​alle kommenterede miRNA og muligheden for at opdage nye miRNA.

i dette arbejde var dyb sekventering anvendes til at bestemme miRNA udtryk i 88 CRC tumorprøver, og sammenhænge mellem ekspressionsniveauerne og klinisk-patologiske og resultatet blev analyseret.

Materialer og metoder

Patient kohorte og Sample Preparation

Mellem årene 1998-2000, blev 316 patienter rekrutteret fra fem sygehuse i Oslo-området [17], og fremad- inkluderet i undersøgelsen på det tidspunkt af primær kirurgi for antaget eller verificeres kolorektal cancer . Undersøgelsen blev godkendt af den regionale etiske komité (Health Region II, Norge) og informeret samtykke blev opnået fra patienterne. Resektion prøver blev behandlet rutinemæssigt til histopatologisk vurdering på tidspunktet for kirurgi og klassificeret i henhold til Tumor Knude Metastase (TNM) iscenesættelse system. Prøvetagning af yderligere tumorvæv blev udført af kirurgen på operationsstuen efter prøven blev fjernet fra patienten, og prøverne blev straks snap-frosset i flydende nitrogen. Prøver blev derefter transporteret til forskningslaboratoriet og holdt i langtidsopbevaring ved -80 ° C. Biopsierne blev snittet under anvendelse af en kryostat mikrotom og hematoxylin-eosin farvede objektglas blev bedømt for tumor indhold af en patolog (median tumor indhold i prøverne var 50%, range 30-80%). Tumorvævet blev derefter skåret i 10 um snit ved anvendelse af en kryostat mikrotom og opbevaret ved -80 ° C indtil RNA-isolering. 120 sager blev ikke medtaget i undersøgelsen af ​​følgende grunde: ikke invasiv cancer (25), bortset adenocarcinom (5), fjernmetastaser histologi på tidspunktet for kirurgi (34), præoperativ strålebehandling (2), utilstrækkelige kirurgiske margener (7 ) og ukendt stadium af sygdommen (1). Desuden frosne vævsprøver var ikke fås i 46 tilfælde. Fra de 196 prøver i TNM stadie I-III, blev udvalgt tilfældigt 90 tumorprøver til dyb sekventering. Efter sekventering blev to prøver fra kohorten anses nedbrudt og blev fjernet fra yderligere undersøgelser, hvilket efterlader en prøve kohorte af 88 patienter (tabel 1). Opfølgende data blev indhentet fra de deltagende hospitaler og fra de praktiserende læger (for patienterne ikke deltage planlagte kontroller). Metastase blev bekræftet ved radiologiske undersøgelse og overlevelsesdata blev opnået fra det nationale register Norge og opdateres senest 1. oktober 2008.

RNA Isolation og Deep sekventering

RNA blev isoleret fra tumorvæv hjælp TriReagent (Ambion Inc., TX) ifølge producentens protokol og det totale RNA-koncentrationen blev målt ved NanoDrop (ND-1000). Kvaliteten blev vurderet af Agilent 2100 Bioanalyzer og prøver med en RIN værdi på 7 og derover blev brugt til yderligere analyse. Små RNA sekventering biblioteker blev oprettet efter Illumina®TruSeq ™ Small RNA Prøvefremstilling protokol. Kort fortalt 3 fastsatte stikprøver og 5 ‘RNA adapter, der specifikt modificeret til at målrette enderne af små RNA-molekyler, blev ligeret til 1 pg høj kvalitet total RNA. Revers transskription blev udført for at fremskaffe cDNA-biblioteker og PCR blev anvendt til at amplificere og tilføje entydige indeks sekvenser til hvert bibliotek.

små RNA-biblioteker blev samlet og 32 baser blev sekventeret for hver cDNA-molekyle ved anvendelse af en Illumina® Genome Analyzer IIx . Indekser blev sekventeret for at identificere kilden til hver læsning. Den første kørsel, som indeholder 48 prøver, blev hæmmet af delvist ikke-funktionelle baner i flowcellen og blev derfor gentaget. Data for kørsel 1 og køre 2 blev kombineret for downstream udtryk analyse, samt analyseret separat for at bestemme den tekniske reproducerbarhed af forsøgene.

Sequencing dataanalyse og Normalisering

Real-time analyse , bund kald og filtrering af lav kvalitet læser blev udført af Illumina software-pakker (SCS2.9 /RTA1.9 og Off-line Basecaller v1.9). Novoalign (V2.08.01 Novocraft 2010 www.novocraft.com) blev anvendt til at skære resterende adapter sekvens og kortlægge læser til referencen humane genom (hg19). Alle læser kortlægning til 10 eller flere genomiske regioner blev udelukket fra yderligere analyse. Den kortlagte aflæsninger blev kommenteret under anvendelse af kendte databaser. Den miRBase database frigivelse 18 (november 2011) blev anvendt til at identificere miRNA, under anvendelse BEDTools Version-2.16.2 [18]. Den NCBI bygge “Homo_sapiens.NCBI.36.58” blev brugt til at identificere andre små RNA-arter og mRNA.

For at beregne læse tæller for miRNA, læser, at kortlagt entydigt inden en moden miRNA sekvens med maksimalt et misforhold blev anset hits. Læser kortlægning til flere modne miRNA sekvens blev tildelt efter frekvensen af ​​entydigt kortlagt læser fundet til disse miRNA. Det betyder, at når to miRNA delte et givet antal multiple kortlagt læser identificerede vi forholdet mellem unikke læser mellem disse to miRNA. Dette forhold blev anvendt til at opdele antallet af multiple kortlagt læser og tildele dem. Hvis der blev fundet flere hits at være perfekt kortlagt til en genomisk region og kortlagt med misforhold til en anden, blev kun de perfekte kampe overvejes.

For normalisering af læste tæller blev fire forskellige tilgange afprøvet. Vi beregnede normaliseringsfaktor for alle prøver ved at dividere det samlede antal læser, antallet af læser tilpasset til genomet, så flere hits eller at kortet entydigt, eller antallet af læser kortlagt til annoteret modne miRNA med 1 million. De normaliserede ekspressionsniveauer værdier for hver miRNA blev dannet ved at dividere læse optælling af miRNA med ifølge normaliseringsfaktor. Efter normalisering, alle miRNA med read tæller mindre end 10 på tværs af alle patientprøver blev sat til 0. Datasættet normaliseret mod kommenterede modne miRNA blev valgt til de resterende analyser. Normaliserede og un-normaliseret læse tæller for alle prøverne er blevet gjort tilgængelige på Array Express hjemmeside, tiltrædelse nummer E-mtab-1649 (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/).

Kvantitativ Real Time-PCR

QRT-PCR er tidligere udført for hele kohorte af 196 prøver, hvorfra frisk frosne væv var til rådighed til at bestemme ekspressionen af ​​seks miRNA: MIR-21, MIR-31, miR-92a , mIR-101, mIR-106a og mIR-145 [19]. Kort fortalt blev cDNA-syntese og QRT-PCR udført under anvendelse af TaqMan miRNA tests (Applied Biosystems, Foster City, CA) ifølge fabrikantens protokol. Alle prøver blev kørt in duplo. Ct-værdier for miRNA blev normaliseret mod RNU44 og den relative ekspression blev beregnet ved anvendelse af 2

-dCt metode [20]. Resultater for disse seks miRNA fra de 88 prøver, der var blevet analyseret med begge metoder blev anvendt til sammenligning af data fra dyb sekventering med QRT-PCR. Foreninger mellem resultaterne fra den dybe sekventering og QRT-PCR blev undersøgt ved lineær regressionsanalyse.

Hierarkisk Clustering og Statistical Analysis

Hierarkisk klyngedannelse blev udført for at visualisere ekspressionsmønstre af alle miRNA. De normaliserede udtryk værdier blev log2 transformeret og ukontrollerede tovejs hierarkisk klyngedannelse blev udført ved hjælp af euklidiske afstand og vægtet gennemsnit kobling (WPGMA) at klynge miRNA og prøver samtidigt.

To klasse uparrede betydning analyse med multiple testing (10000 permutationer ) (SAM) [21] blev anvendt til at identificere miRNA associeret med klinisk-patologiske parametre, ved hjælp af J-Express (2012 udgave) [22]. Indgangen for SAM blev normaliseret og log2 transformerede og klinisk-patologiske parametre blev anvendt som responsvariabler. Ti tusind gentagne permutationer af dataene blev anvendt til at bestemme, om ekspressionen af ​​miRNA var signifikant associeret med en af ​​følgende klinisk-patologiske parametre: TNM, pT, pN, tumorlokalisering, differentiering, perinodal infiltration, vaskulær invasion og neurale infiltration. Den falske opdagelse sats udtrykt som Q-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Samlet og metastase overlevelse blev beregnet fra datoen for operationen indtil dødsdagen eller diagnose af metastaser. At identificere miRNA forbundet med overordnede og metastase overlevelse univariate Cox proportional hazard regression blev anvendt til hver miRNA, teste for foreninger med metastase-fri eller samlet overlevelse. At tage højde for multipel testning, blev justeret p-værdier beregnes ved at styre den falske opdagelse sats (FDR) ved anvendelse af Benjamini-Hochberg procedure [23]. Så for alle de miRNA samtidig, Lasso metode i Cox proportional farer model [24], som gennemført tidligere [25], blev brugt til at opdage et sæt miRNA forbundet med endepunkter. “I LASSO analyse ingen miRNA blev udvalgt. Ingen miRNA var betydelig i den univariate Cox analyse efter korrektion for multiple test. I denne sidste analyse, syv miRNA (miR-339-5p, miR-7-1-3p, miR-365b-3P, miR-454-3p, miR-194-3p, miR-15b-3P og HSA-miR- 4461) havde p-værdi under 0,01 med metastaser udvikling som endpoint, mens tre miRNA (mIR-101-5p, HSA-miR-873-5p og HSA-miR-3144-3p) havde p-værdi under 0,01 med endepunkt samlet overlevelse . Alle disse ti miRNA blev udtrykt ved meget lave niveauer i vores kohorte med den højeste median udtryk observeret for miR-454-3p med 187 læser til det laveste for miR-873-3p med 0 læser.

Pathway Analyse for målgener af de fem mest højt udtrykte miRNA

for at undersøge biologiske indflydelse af de mest højt udtrykte miRNA blev målgener identificeret ved hjælp TarBase 6.0 [26]. Denne database indeholder målgener, som har eksperimentel støtte ud over sekvensen baseret forudsigelse. De gen-identiteter blev uploadet i den webbaserede DAVID funktionel annotation værktøj til pathway-analyse ved hjælp af Kegg databasen [27], [28].

Resultater

Små RNA sekventering og Annotation

længden af ​​de detekterede sekvenser varierede mellem 13 og 29 nukleotider efter fjernelse af adapteren sekvens (længere læser blev fjernet). Hoveddelen af ​​læser, 97,9%, var mellem 19 og 23 baser. I gennemsnit 2,6 millioner læser kortlægning til det humane genom blev opnået pr tumorprøve (figur 1A). Vi identificerede frekvenserne af læser falder i forskellige klasser af små RNA eller andre genomiske regioner og beregnede median frekvenser sammenligner alle 88 tumorprøver. Hyppigheden af ​​læser kortlægning til modne miRNA varierede fra 37 til 77% i bibliotekerne og gav en median på 61% (figur 1B). For intron /intergeniske regioner en median læse frekvens på 33% blev fundet, og til for tidligt fødte miRNA og snoRNAs, median læse frekvenser var 4% og 2% (figur 1C). I tilsætning af en lille brøkdel læser kortlagt til snRNA, miscRNA, tRNA, rRNA, og mRNA sammen omfatter en frekvens på ~0.05%. MiRNA med mindre end 10 læser på tværs af alle patientprøver blev betragtet ikke udtrykkes. I alt blev 523 miRNA udtryk i datasættet.

A. Antal læser (x10

6) kortlægges til det humane genom (hg19) for alle prøver. Disse omfatter alle RNA-arter (tidlig miRNA, snoRNA, snRNA, miscRNA, rRNA, tRNA og mRNA) .De sekvenser, der ikke matcher kendt sekvens blev matchet mod databaser intergeniske og intron regioner af det humane genom. B. Hyppigheden af ​​læser kortlagt til annoteret modne miRNA for alle prøver ved hjælp af microRNA-databasen (miRBase frigive 18). C. Pie-diagram, der repræsenterer procentdele af de forskellige RNA klasser findes i datasættet.

Normalisering og Tekniske Gentagelser

Generelt for at sammenligne udtryk værdier mellem prøver er det nødvendigt at normalisere imod læst tæller ved at beregne en normalisering faktor. De fire forskellige normaliserings- metoder gav meget lignende resultater, når man sammenligner den gennemsnitlige ændring beregnes ved forskellen i procent for hver miRNA læs kimtallet pr miRNA (data ikke vist). Figur 2B og 2C viser fordelingen af ​​log2 forvandlet unnormalized læse tæller og læse tæller normaliserede mod modne miRNA fem tilfældige patientprøver. De lavere læste tæller var ikke så påvirket af normalisering i forhold til de højere værdier. Alt i alt, normalisering genereret forholdsvis ligeligt fordelt læse tæller for hovedparten af ​​miRNA tværs af alle prøver.

A. Sammenligning af de tekniske replikater mellem kørsel 1 og kørsel 2. Hver prik repræsenterer den totale ekspression af et enkelt miRNA fra alle patientprøver. Den miRNA udtryk data blev normaliseret og log2 forvandlet. B. unnormalized miRNA læste tællinger (log2) for fem tilfældigt udvalgte patienter. C. Normaliseret miRNA læste tællinger (log2) for de samme fem patienter som i B.

48 prøver blev dybt sekventeret to gange, betegnet kørsel 1 og køre 2, og disse datasæt blev brugt til at sammenligne resultater fra de separate kørsler. Resultaterne viste en meget god sammenhæng mellem de tekniske replikater vist ved nul hældning streg (Figur 2A).

de fem mest højt udtrykte miRNA

De fem mest rigeligt udtrykte miRNA i denne kohorte var miR-10a-5p, miR-21-5p, miR-22-3p, miR-143-3p og miR-192-5p (figur 3). De læste tæller for disse miRNA tegnede sig for 53,7% af det samlede antal miRNA-sekvenser detekteret i patientprøver, mens de 20 miRNA udgjorde 82,6% af den læser (tabel S1). De resterende 503 miRNA udgjorde 17,4% af den læser. Af de fem bedste miRNA, miR-192-5p havde den højeste median udtryk (156.413 læser), mens miR-22-3p havde den laveste (35.284 læser).

Differentiel udtryk for de fem mest rigeligt udtrykte miRNA i vores CRC kohorte. De samlede antal af miRNA læser er log2 forvandlet. Cirklerne repræsenterer outliers og stjernerne repræsenterer ekstreme outliers.

Mange miRNA gener er placeret i umiddelbar nærhed af andre miRNA gener i gen klynger, og to af de fem mest højt udtrykte miRNA (miR-143 -3p og miR-192-5p) er en del af sådanne klynger. MIR-143-3p og miR-145-5p er begge placeret på kromosom 5 10 kb fra hinanden, mens miR-192-5p og miR-194-5p er placeret på kromosom 11 10 kb fra hinanden. Ekspressionsniveauer af MIR-143-3p og MIR-192-5p og to miRNA tilhører deres respektive gen-clustere er afbildet i figur 4. Ingen co-ekspression var tydelig for miRNA tilhører disse gen-clustere, hvilket er i konkordans med tidligere resultater [29].

A. MIR-143-3p findes i det samme gen klyngen som MIR-145-5p på kromosom 5 (positionerne 148.808.481-148.808.586 og 148.810.209-148.810.296 henholdsvis). MIR-192-5p findes i det samme gen klyngen som MIR-194-5p på kromosom 11 (positionerne 64.658.609-64.658.718 og fra 64.658.827 til 64.658.911, henholdsvis). Selv om miRNA i hvert gen klynge er 10 kb fra hinanden, co-ekspression blev ikke observeret

Pathway Analyse for de fem mest højt udtrykte miRNA

1490 målgener blev identificeret som. potentielt reguleret af miR-10a-5p, miR-21-5p, miR-22-3p, miR-143-3p og miR-192-5p. Veje med den mest betydningsfulde gen-berigelse er vist i tabel 2, og omfattede “veje i cancer” (55 gener, p = 3,3 × 10

-7), “Cell cycle” (28 gener; p = 2,2 × 10

-6), og “Tyktarmskræft” (21 gener; p = 1,0 × 10

-5). Fokus på CRC vej, fandt vi, at gener, der reguleres af de fem mest højt udtrykte miRNA inkluderet onkogener (

KRAS, PI3K

), tumorsuppressorer (APC og TGFβRII) og DNA reparation gener (hMSH6) og gener tilhørende til Wnt og MAPK signalveje (figur 5).

pathway analyseresultaterne for de målgener af de fem mest højt udtrykte miRNA i kolorektal cancer pathway. Illustrationen blev taget fra Kegg databasen og miRNA blev tilføjet i blå skrift for at angive de mål, der reguleres af disse miRNA.

Sammenhæng mellem QRT-PCR og Deep Sequencing data

Expression værdier for seks miRNA mIR-21, mIR-31, mIR-92a, mIR-101, mIR-106a og mIR-145, blev tidligere bestemt ved anvendelse QRT-PCR [19]. MiRNA ekspression målt ved QRT-PCR blev sammenlignet med de dybe sekventering data ved hjælp lineær regressionsanalyse af normaliserede Ct-værdier (QRT-PCR) og log2-transformerede dyb sekventeringsdata. De R

2 værdier for de 6 miRNA testede var 0,06, 0,38, 0,10, 0,001, 0,03, og 0,28 for miR-21, miR-31, miR-92a, miR-101, miR-106a, og miR-145 , henholdsvis. Summen af ​​de samlede ekspressionsniveauer blev også beregnet for disse miRNA for hver metode, og de relative niveauer er vist i figur 6. Den relative ekspression mellem individuelle miRNA var rimeligt konsistent mellem metoder for fire af de miRNA (MIR-21, MIR-31 , miR-92a og miR-106a), mens der var klare uoverensstemmelser for miR-101 og miR-145. MIR-101 var næppe detekterbar med QRT-PCR, men udviste detekterbare ekspressionssystemer værdier med dyb sekventering, mens MIR-145 blev påvist ved QRT-PCR og næppe påvises under anvendelse dyb sekventering.

De normaliserede ekspressionsniveauer værdier blev log2 transformeret og analyseret ved ukontrollerede tovejs hierarkisk klyngedannelse hjælp vægtet gennemsnit kobling (WPGMA). Den globale kort indeholder alle udtrykte miRNA vist lodret og patientprøver vandret.

Hierarkisk Clustering og Foreninger mellem miRNA Expression og klinisk-patologisk Parametre

miRNA ekspressionsmønstre observeret med hierarkisk klyngedannelse vises i figur 7 med miRNA på den lodrette akse og patientprøver på den vandrette akse. De fleste af de miRNA udstillet meget lignende udtryk niveauer på tværs af patientprøver. I områder med plottet, nogle miRNA syntes at være differentielt udtrykte, men disse blev næsten udelukkende placeret blandt de miRNA, der havde meget lav udtryk. SAM-analyse af udtryk data og klinisk-patologiske parametre afslørede, at høj ekspression af MIR-10b-5p og MIR-615-3p og lav ekspression af MIR-592 blev associeret med tumorer placeret i højre colon (herunder de opstigende og tværgående tyktarm) sammenlignet med den venstre tyktarm og endetarm (tabel 3). Ekspressionen af ​​disse miRNA viste 2,4 gange, 41,4-gange og 3,9 ganges forskelle, henholdsvis (q 0,05 for alle miRNA) (figur 8). Høj ekspression af MIR-615-3p var også forbundet med dårligt differentieret tumorer sammenlignet med mellemliggende og godt differentierede tumorer (fold ændring 44,4, q 0,05).

Ekspression af seks miRNA (MIR-21, miR- 31, mIR-92a, mIR-101, mIR-106a og mIR-145) er vist fra dyb sekventering og QRT-PCR for 88 patientprøver, der blev analyseret med begge metoder. A. Søjlerne repræsenterer summen af ​​det samlede antal læser (x10

6) for hver miRNA fra dyb sekventering. B. Søjlerne repræsenterer summen af ​​den relative ekspression (2

-dCt) fra QRT-PCR.

Høj ekspression af MIR-10b-5p og MIR-615-3p og lav ekspression af miR-592 var forbundet med tumor lokaliseret i den rigtige kolon i forhold til den venstre tyktarm og endetarm (q 0,001 og p 0,001).

Foreninger mellem miRNA Expression og Outcome

i LASSO og univariate Cox-analyse, 5 miRNA (miR-339-5p, miR-7-1-3p, miR-365b-3p, miR-454-3p, miR-194-3p og miR- 15b-3p) med metastaser udvikling som endpoint opstod, og en miRNA (miR-101-5p) med endepunkt samlet overlevelse blev identificeret, men ingen af ​​disse forblev signifikant associeret med enten samlet-eller metastaser overlevelse efter justering for multiple test. Alle miRNA identificeret af disse analyser blev udtrykt ved meget lave niveauer i vores kohorte med den højeste median udtryk observeret for miR-454-3p med 187 læser til det laveste for miR-194-3p med kun 19 læser.

Discussion

i det nuværende arbejde, var dyb sekventering anvendes til at kvantificere miRNA udtryk i en stor kohorte af CRC tumorprøver. Denne tilgang kan bidrage potentielle fordele i den globale miRNA udtryk analyse, men også indebærer nye udfordringer med hensyn til dataanalyse, som mængden af ​​data indsamlet efter dyb sekventering indeholder millioner af læser, som skal kortlægges til genomet og normaliserede [30]. I de 88 CRC patienter analyseret med succes, blev der påvist 523 modne miRNA. Andre små RNA-sekvenser blev også påvist, men de lave afsløring frekvenser af andre RNA klasser og genomiske regioner viste, at selektion for miRNA var lykkedes, og i overensstemmelse med tidligere resultater [29], [31]. Hertil kommer, at fremragende aftale observeret mellem tekniske gentagelser foreslog tilstrækkelig reproducerbarhed.

De fem miRNA mest rigeligt udtrykt i den undersøgte CRC kohorten var miR-10a-5p, miR-21-5p, miR-22-3p, mIR-143-3p og mIR-192-5p, og alle disse har tidligere vist at blive dysreguleret i CRC [32] – [38]. Disse miRNA var også blandt de mest højt udtrykte miRNA i en tidligere undersøgelse udført ved hjælp af dyb sekventering af 8 CRC prøver og tilsvarende normale væv [39]. Interessant, de fem mest højt udtrykte miRNA udgjorde så meget som 54% af det samlede antal miRNA-sekvenser detekteret. Dette er i konkordans med en tidligere dyb sekventering undersøgelse foretaget på perifere blodprøver, ved hvilken Lad-7 familie udgjorde 77% af den samlede miRNA læste tællinger [29]. Den relative betydning af høj versus lav miRNA udtryk er vanskeligt at fortolke, da fravær eller rigelige tilstedeværelse af miRNA kan repræsentere lige vigtige biologiske regulatoriske signaler. overrepræsentation af et lille antal miRNA kan dog betyde, at disse miRNA spiller en vigtig rolle som negative regulatorer af downstream mål og de biologiske veje, der berøres af disse mål. De forudsagte mål i de 5 mest højt udtrykte miRNA var signifikant associeret med cancer-relevant veje, herunder CRC-vejen. Blandt de forventede mål i CRC-vejen var onkogener, tumor undertrykkere og DNA reparation gener, som er involveret i flere vigtige signalveje, herunder Wnt, MAPK, cellecyklus, TGF-β, og p53. Forventede mål (hMSH2 og hMSH6) blev også involveret med nedregulering DNA reparation gener påvirker mikrosatellitter og derved involveret i mikrosatellit ustabilitet vej. Disse resultater tyder på, at den identificerede top fem mest udtrykte miRNA er kræft relevante og sandsynligvis relevant i CRC, men yderligere undersøgelser er nødvendige for at validere de mål og vurdere downstream effekter.

En af de formodede fordele ved dyb sekventering sammenlignet med microarray analyse og QRT-PCR er forbedret specificitet og følsomhed, hvilket antyder, at denne metode ville returnere mere korrekte målinger af de enkelte miRNA end de andre metoder. Når man sammenligner vores tidligere resultater, måling udtryk for seks miRNA bruger QRT-PCR med dybe sekventering data, korrelation på den enkelte prøve niveauet var dårlig for alle de undersøgte miRNA. Deep sekventering ofte valideret af QRT-PCR, men omfattende sammenligninger mellem de to tilgange er ikke udført. I en dyb sekventering undersøgelse den 9. blære kræft prøver blev udvalgt miRNA fra dyb sekventering valideret af QRT-PCR, og rapporteret at korrelere godt, når analyseret af fold udtryk forskelle i en bar plot [40]. I en anden undersøgelse udført på 10 neuroblastom prøver, korrelationskoefficienter mellem 0,1 og 1, blev fundet ved sammenligning med summen af ​​miRNA ekspression fra QRT-PCR og dyb sekventering [41]. De største forskelle i vores sammenligning mellem QRT-PCR og sekventering blev fundet for miR-101 og miR-145. Assayet anvendes til QRT-PCR samt sekventering var begge i stand til at påvise, men ikke til at adskille mellem kendte isoformer af disse miRNA. I sekventering data blev der ikke nukleotid variationer, der kunne forklare uoverensstemmelserne. I teorien kan manglende påvisning af miR-101 ved QRT-PCR være en følsomhed problem, mens det for miR-145, kan mangel på specificitet QRT-PCR-analysen forklare uoverensstemmelserne. Det synes således uklart, om QRT-PCR kan bruges til validering, da QRT-PCR og dybe sekventering data genereret med forskellige metoder og vises på forskellige skalaer med variable udtryk intervaller, hvilket gør det vanskeligt at sammenligne de to datasæt på en patient -til-patient grundlag.

Et af formålene med denne undersøgelse var at undersøge sammenhængen mellem miRNA udtryk og klinisk-patologiske parametre og resultater. I betragtning af den lave variabilitet observeret mellem prøver, er det ikke overraskende at der blev opdaget få sådanne sammenslutninger. Brug univariate Cox proportional hazard regression, fandtes ingen miRNA at være forbundet med metastase udvikling eller samlet overlevelse efter korrektion for multiple test. Ingen miRNA blev udvalgt i LASSO analyse. Lav ekspression af MIR-592 og høj ekspression af MIR-10b-5p og MIR-615-3p blev associeret med tumorer placeret i højre colon sammenlignet med tumorer i venstre tyktarm og endetarm. Høj ekspression af MIR-615-3p var også forbundet med dårligt differentieret tumorer. MIR-10b er tidligere rapporteret at være nedreguleret i CRC og høj ekspression blev forbundet med fremskreden pT-stadium [42], men ingen sådanne sammenslutninger blev påvist i vores kohorte. MIR-592 har tidligere vist sig at være nedreguleret i tumorer med mangelfuld mismatch reparation sammenlignet med mismatch reparation dygtige tumorer [43], [44]. Mangelfulde mismatch reparation giver anledning til mikrosatellit ustabilitet, og i sporadisk CRC, er mikrosatellit ustabile tumorer ofte placeret i højre side af tyktarmen [45], [46]. Således ville lave udtryk for miR-592 i tumorer i højre colon i nærværende undersøgelse være i overensstemmelse med tidligere resultater, men da meget lidt i øjeblikket kendt med hensyn til målene for denne miRNA, afklare dette spørgsmål vil kræve yderligere undersøgelser. MIR-615 udstillede den mest markante forskel i udtryk mellem højre og venstre colon i denne kohorte, og det var også stærkt udtrykt i dårligt differentierede tumorer. Der er få rapporter om ekspression og funktion af dette miRNA, men i en undersøgelse blev MIR-615-ekspression nedreguleres når de foreslåede tumor suppressor NGX6 blev eksperimentelt introduceret i den humane CRC cellelinie HT29. I vores kohorte, 7 af de 10 ringe differentierede tumorer blev placeret i den højre colon.