PLoS ONE: Expression og immunrespons mod MAGE Antigener forudsige overlevelse i Epithelial kræft i æggestokkene

Abstrakt

De MAGE kræft-testis-antigener (CTA) er attraktive kandidater til immunterapi. Formålet med denne undersøgelse var at bestemme frekvensen af ​​ekspression, humoral immunitet og prognostisk betydning af MAGE CTA i human epithelial ovariecancer (EOC). mRNA eller protein ekspressionsfrekvenser blev bestemt for MAGE-A1, A3, -A4, -A10 og -C1 (CT7) i vævsprøver opnået fra 400 patienter med EOC. Tilstedeværelsen af ​​autologe antistoffer mod de MAGE-antigener blev bestemt fra 285 serumprøver. Det indbyrdes forhold mellem MAGE-ekspression, humoral immunitet over for MAGE-antigener, og klinisk-patologisk karakteristika blev studeret. De individuelle frekvenser af ekspression var som følger: A1: 15% (42/281), A3: 36% (131/390), A4: 47% (186/399), A10: 52% (204/395), C1 : 16% (42/267). Stærk overensstemmende udtryk blev bemærket med MAGE-A1: -A4, MAGE-A1: -C1 og MAGE-A4: -A10 (

s

0,0005). Ekspression af MAGE-A1 eller -A10 antigener resulterede i dårlig progressionsfri overlevelse (PFS) (OR 1,44, CI 1,01-2,04,

s

= 0,044 og OR 1,3, CI 1,03-1,64,

p

= 0,03, henholdsvis); henviser til, at blev MAGE-C1 udtryk forbundet med forbedret PFS (OR 0,62, CI 0,42 til 0,92,

s

= 0,016). De forbedrede PFS observeret for MAGE-C1 udtryk, blev formindsket med co-ekspression af MAGE-A1 eller -A10. Spontan humorale immunitet til de MAGE-antigener var til stede i 9% (27/285) af patienterne, og det forudsagte dårlig samlet overlevelse (log-rank test

s

= 0,0137). Disse resultater viser, at MAGE-A1, MAGE-A4, MAGE-A3, og MAGE-A10 er prioriterede attraktive mål for polyvalent immunterapi i æggestokkene kræftpatienter

Henvisning:. Daudi S, Eng KH, Mhawech-Fauceglia P Morrison C, Miliotto A, Beck A, et al. (2014) Udtryk og immunrespons mod MAGE Antigener Forudsige overlevelse i Epithelial kræft i æggestokkene. PLoS ONE 9 (8): e104099. doi: 10,1371 /journal.pone.0104099

Redaktør: Sophia N. Karagiannis, Kings College London, England

Modtaget den 22. april 2014 Accepteret: 7 jul 2014; Udgivet: 7 August, 2014

Copyright: © 2014 Daudi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet delvist af Cancer Research Institute Kræft i æggestokkene arbejdsgruppe Grant, Cancer Vaccine Collaborative Udstedelse af Cancer Research Institute og Ludwig Institute for Cancer Research, Anna-Maria Kellen Klinisk Investigator Award for Cancer Research Institute (til Kunle Odunsi), National Institutes of Health 5T32 CA 108.456, National Institutes of Health R01CA158318-01A1 og Roswell Park Cancer Institute-universitetet i Pittsburg Cancer Institute kræft i æggestokkene Specialized Program for Forskning Excellence National Institutes of Health P50CA159981-01A1. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Epithelial ovariecancer (EOC) repræsenterer den mest dødbringende gynækologisk malignitet hos kvinder. Trods en betydelig indsats rettet mod tidlig opsporing og forbedre responsrater, de fleste kvinder til stede med dissemineret sygdom på første diagnose, bære en uacceptabel tilbagefald på ca. 85% og en 5-års samlet overlevelse på 20-30% [1], [ ,,,0],2]. Derfor vil målrettede behandlingsstrategier, såsom immunterapi være forpligtet til at forbedre det kliniske resultat af æggestokkene kræftpatienter.

Udviklingen af ​​succesfulde immunterapi kræver karakterisering af tumor-associerede antigener (TAA), der almindeligvis udtrykkes i æggestokkene tumorer, med et begrænset ekspressionsmønster i normale væv. Endvidere bør den ideelle antigen udviser en høj frekvens af ekspression i cancer og tegn på immunogenicitet. Kandidat TAA identificeres ofte hos patienter med stærke cellulære og /eller humorale immunresponser, der indikerer robust iboende immunogenicitet til disse antigener [3] – [5]

cancer testis-antigenerne (CTA) er en underklasse af TAA. kodet af ca. 140 gener. På trods af deres dårligt karakteriserede biologisk funktion, er udtryk for disse antigener er kendt for at være begrænset i immun privilegerede steder såsom testiklerne, moderkagen og føtal æggestok, men ikke i andre normale væv. Unormal ekspression af disse kimlinje-gener i maligne tumorer kan afspejle aktiveringen af ​​en lyddæmpet “gametogenic program”, som i sidste ende fører til tumorprogression og bred immunogenicitet [6]. Immunogeniciteten af ​​CTA har ført til den udbredte udvikling af cancervacciner målrettet mod disse antigener i mange faste tumorer. Inden for denne store klasse af TAA, har melanom-associerede antigener (MAGE) dukket op som lovende kandidater til kræft immunterapi [7] – [9].

Mere end 30 cancer testis (CT) gener er blevet rapporteret som medlemmer af multi-genfamilier, der er organiseret i genklynger på kromosom X (CT-X antigener). De CT genklynger er placeret mellem Xq24 og Xq28 og omfatter genfamilier såsom MAGE og NY-ESO-1 [10]. Type I MAGE genklynger er de mest grundigt karakteriseret og indbefatter MAGE-A, MAGE-B og MAGE-C familierne. MAGE-A-proteiner kodes af 12 forskellige MAGE-A-genet familiemedlemmer (MAGE-A1 til MAGE-A12) og er defineret ved et konserveret 165-171 aminosyre base, kaldet MAGE homologi domæne (MHD). Den MHD svarer til den eneste region i fælles aminosyrer af alle de MAGE-A familiemedlemmer. MAGE-C1 /CT7 er strukturelt forskellig fra MAGE-En familie, med et protein produkt af 1142 aminosyrer (vs. 400 rester for MAGE-A-proteiner), der indeholder en tandem repeat sekvens, der er fraværende i MAGE-A [ ,,,0],11].

i den foreliggende undersøgelse har vi analyseret ekspressionen og immunogeniciteten af ​​et panel af fem MAGE CTA i en stor kohorte af patienter med ovariecancer. Derudover har vi undersøgt sammenhængen mellem koordineret ekspression af MAGE gener og klinisk-patologisk udfald.

Materialer og metoder

Patienter og Prøver

formalin-fikseret paraffinindlejret (FFPE, for immunhistokemi) og snap-frosne vævsprøver (for revers transkriptase-PCR) blev opnået fra 400 patienter, der gennemgår cytoreduktive operation for ovariecancer, primær peritoneal og æggeleder kræft ved Roswell Park cancer Institute (Buffalo, NY) mellem 1992 og 2008. Vi identificerer, og henviser til, disse tre kræftformer som EOC på grund af deres fælles oprindelse i mullerian epitel. Alle vævsprøver blev indsamlet under en godkendt protokol fra den institutionelle Review Board (IRB) i Roswell Park Cancer Institute. Patienterne underskrev en IRB godkendt skriftligt informeret samtykke, og disse blev indgivet i IRB kontor. Alle patologi prøver blev revideret i vores institution, og den histopatologiske undertype af tumorerne blev klassificeret i henhold til retningslinjerne i World Health Organization (WHO) [12], [13]. Scenen og kvalitet af de tumorer blev vurderet i henhold til den internationale sammenslutning af Gynækologi og obstetrik (FIGO) [14], [15]. I en undergruppe af patienterne, blev serumprøver opsamlet ved diagnose. De medicinske registreringer af disse patienter blev efterfølgende revideret henhold til en godkendt institutionel Review Board protokol. Gennemgangen omfattede ambulant og stationær behandling. Undersøgelse resultater omfattede samlet overlevelse (OS) og progressionsfri overlevelse (PFS). Begge kriterier overlevelse blev målt fra tidspunktet for diagnosen. Gentagelse blev defineret via objektive kriterier, som alle terapi blev givet i adjuverende. Varigheden af ​​OS var intervallet mellem diagnose og død. PFS repræsenteret intervallet mellem diagnose til sygdomsprogression, tilbagefald eller død. Observation tidspunkt var intervallet mellem diagnose og sidste kontakt (død eller sidste opfølgning). Data blev censureret i sidste opfølgning for patienter uden tegn på tilbagefald, progression eller død.

Samlet Tissue RNA Isolation

Samlet væv RNA blev isoleret fra frosne tumorvæv ved brug af TRI Reagent (Molecular Research center Inc., Cincinnati, OH, USA) ifølge producentens protokol. Potentielt kontaminerende DNA blev fjernet ved behandling med RNase-fri DNase I (Boehringer-Mannheim, Mannheim, Tyskland) efterfulgt af phenol /chroloform ekstraktion. RNA blev opløst i RNase-fri H

2O. Den resulterende RNA-koncentrationen blev målt spektrofotometrisk (DU500 spektrofotometer, Beckman Coulter, Fulleron, CA, USA), og kvaliteten af ​​RNA’erne blev kontrolleret ved elektroforese på 1,5% agarosegel.

revers transkriptase-PCR-analyse af MAGE -A1, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A10 og MAGE-C1 Expression

To mikrogram af hver RNA prøve blev anvendt til at generere cDNA med Ready-To-Go revers transkriptase-PCR (RT- PCR) perler (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK). RNA fra normal testikelvævet (Clontech, Mountain View, CA) blev anvendt som en positiv kontrol. PCR blev efterfølgende udført for at undersøge ekspressionen af ​​MAGE-A1, A3, -A4, -A10 og -C1 i 305 patienter med EOC. Glyceraldehyd-3-phosphodehydrogenase (GAPDH) primere blev anvendt som en test for RNA integritet. Tabel S1 angiver primersekvenserne for hvert gen og dens respektive amplikon længde. Amplificeringsbetingelserne for alle genprodukter var 5 minutter ved 95 ° C, efterfulgt af 35 cykler, der bestod af 1 minut ved 95 ° C, 1 min ved 60 ° C, og 1 min ved 72 ° C. Disse cykler blev efterfulgt af en 6-min forlængelsestrin ved 72 ° C (BioRad iCycler, BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA). PCR-produkterne blev separeret over en 1,5% agarosegel og visualiseret med ethidiumbromid på en ultraviolet transilluminator (IS-4400 ChemiImager, Alpha Innotech, San Leandro, CA). Intensiteterne af PCR-produkterne var heterogene, og nogle prøver viste kun svage amplicon bands. Disse blev scoret positiv, hvis resultatet kunne blive reproduceret af en gentagen RNA-ekstraktion og specifik RT-PCR fra samme tumorprøver. Sager med meget lave transkriptniveauer, som ikke var reproducerbart positivt blev ikke betragtet som positive. PCR-produkt bånd blev udskåret fra agarosegelen og associerede DNA blev isoleret med QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). DNA-prøver blev sendt til sekventering til at verificere PCR-produktet.

immunhistokemisk analyse af MAGE-A3, MAGE-A4 og MAGE-A10 Expression

immunhistokemisk (IHC) analyse blev udført ved hjælp af FFPE væv fra 304 patienter på væv microarrays (TMA). TMA blev bygget ved hjælp 0,6 mm FFPE væv kerner udstansede fra hver donor blok. For at overvinde tumor heterogenitet, blev tre repræsentative kerner valgt blandt hver tumor. De 4 um tykke væv kerner blev afparaffiniseret og forbehandlet med et specifikt antigen Retrieval Solution (DakoCytomation, Carpenteria, CA) over 20 minutter. Objektglas blev afkølet i 20 minutter og derefter behandlet i 3% H

2O

2 for at standse endogen peroxidaseaktivitet. TMA Objektglassene blev derefter inkuberet med et serum-frit protein blok (DakoCytomation, Carpenteria, CA) i 30 minutter. Tabel S2 angiver antistofferne og IHC betingelser. MAGE-A3 kanin-anti-humane polyklonale antistof (LS-B4662, Levetid Biosciences, Inc.) blev kommercielt erhvervet. Anti-MAGE-A4 mAb (klon: 57b) og anti-MAGE-A10 (klon: A3) hybridomsupernatanter blev produceret på University Hospital Basel (Basel, Schweiz) [16], [17]. Kanin-IgG eller muse lgG1 (Sigma, St. Louis, MO) blev anvendt som negativ isotype matchet kontrol. Mærket streptavidin biotin (LSAB +) reagenser (DakoCytomation, Carpenteria, CA) blev anvendt ifølge producentens instruktioner, efterfulgt af en 3,3′-diaminobenzidin (DAB) + (DakoCytomation, Carpenteria, CA) inkubation. Snit blev modfarvet med hæmatoxylin. En afskæring på 5% positive tumorceller blev anvendt til at definere positivt udtryk.

Måling af serum-antistof ved ELISA

serologisk analyse af humorale immunresponser blev udført som tidligere beskrevet [18]. 285 serumprøver fra en delmængde af patienterne blev analyseret ved ELISA for seroreaktivitet til bakterielt produceret fuld længde rekombinante proteiner MAGE-A1, A3,-A4, -A10 eller -C1. Som en negativ kontrol-antigen blev rekombinant dihydrofolatreduktase-protein fremstillet og anvendt i hvert assay. Serum blev fortyndet serielt fra 1:100 – 1:100,000 og tilsat til små mængder plader med 96 brønde (Corning) overtrukket natten over ved 4 ° C med 1 ug /ml antigen i 25 pi og blokeret i 2 timer ved stuetemperatur med PBS indeholdende 5% fedtfri mælk. Efter inkubation natten over blev pladerne vasket grundigt med PBS indeholdende 0,2% Tween 20 og skyllet med PBS (BioTek ELx405 automatiske vasker). Serum IgG bundet til antigener blev påvist med gede-anti-humane IgG antistoffer konjugeret til alkalisk phosphatase (Southern Biotech). Efter tilsætning af ATTOPHOS substrat (Fisher Scientific), blev fluorescerende signal målt under anvendelse af en Cytofluor Series 4000 fluorescenslæser (PerSeptive Biosystems). En gensidig titer blev beregnet for hver plasmaprøve som den maksimale fortynding stadig betydeligt reagere på et specifikt antigen. Specificitet blev bestemt ved sammenligning seroreaktivitet mellem de forskellige testede antigener. I hvert assay blev sera fra patienter med kendt reaktivitet anvendt som kontroller. Et positivt resultat blev defineret som gensidige titre . 100

Statistisk analyse

Alle statistiske analyser blev genereret ved hjælp af SAS-software (SAS System Copyright 2002 SAS Institute Inc. v.9.2) og R 2.15.3 statistisk sprog computing. En nominel signifikansniveau på 0,05 blev anvendt i alle forsøg. Anvendelse af en 2 × 2 kontingenstabel blev niveauet af sammenfald mellem de forskellige MAGE genekspressionsprofiler bestemt. Fordelingerne af MAGE-A1, A3, -A4, -A10 og -C1 udtryk og kliniske udfald blev analyseret af Wilcoxon Rank Sum Test eller Pearson Chi Square Test. Multivariat analyse for uafhængige prædiktorer for overlevelse blev testet ved hjælp af Cox proportional hazard model [19]. Anslåede overlevelse distributioner blev beregnet ved metoden ifølge Kaplan og Meier [20], og test af betydning med hensyn til overlevelse distributioner var baseret på log-rank test. Relativ prognose blev opsummeret ved hjælp estimater og 95% konfidensgrænser for hazard ratio (HR). Ingen justeringer blev foretaget for multiple sammenligninger. En fylogenetisk træ konstrueres ved en Manhattan afstand, kodning udtryk som nul (fraværende) og en (til stede), og standard nabo sammenføjning algoritme.

Resultater

Undersøgelse Befolkning

i alt 400 væv fra patienter med ovariecancer, primær peritoneal og fallopian rør cancere blev undersøgt ved RT-PCR og IHC. Kendetegnene for patienterne i denne undersøgelse er vist i tabel 1. Den mediane alder af patienten prøve var 63 (interval: 21-93), med en median opfølgning på 35 måneder (interval: 1-176 måneder) . Som forventet, at størstedelen af ​​patienterne med fremskredent sygdom (82%), ringe differentierede tumorer (74%) og med serøs histologi (64%). Platinum følsomme sygdom blev demonstreret i 182 af de 400 patienter (46%), med 116 patienter, der har platinmodstandstermometer (29%), og 16 patienter med en platin ildfast respons (4%). Den mediane OS til alle patienter var 40 måneder (interval: 0-173), mens den mediane PFS var 12 måneder (interval: 0-160).

Angivelse af MAGE-A1, MAGE-A3 , MAGE-A4, MAGE-A10 og MAGE-C1 i kræft i æggestokkene

Angivelse af MAGE-antigener blev vurderet af både RT-PCR og IHC for de fleste patienter, fra hvem passende prøver var til rådighed. Udtrykket af MAGE-A4 og MAGE-A10 blev opdaget samstemmende med begge metoder (r = 0,31, OR = 3,88, p 0,001; r = 0,14, OR = 2,00, p 0,001 henholdsvis), men MAGE-A3 resultaterne var ikke reproducerbart overensstemmende (r = -0,06, OR = 0,86, p = 0,9198) på grund af en lav detektion (tabel S3). Medmindre andet er angivet, fortsatte vi med at klassificere væv som antigen positive, hvis de blev identificeret ved RT-PCR eller IHC (tabel 2). Derfor når de overvejer alle 400 væv prøver analyseret ved RT-PCR eller IHC i denne undersøgelse, de frekvenser for MAGE-A3, -A4 og -A10 udtryk ved enten metode var 36% (131/390), 47% (186/399 ) og 52% (204/395) af væv (tabel 2). MAGE-A1 og -C1 demonstrerede den laveste frekvens af udtryk på 15% (42/281) og 16% (42/267), hhv. Tabel S3 er et sammendrag af hyppigheden af ​​MAGE mRNA og protein-ekspression i tumor prøver fra EOC patienter.

MAGE-A3, -A4 og -A10 udviste ingen immunfarvning i normale væv (Figs.1A -C) men intens immunofarvning i testis (Figs.1D-F). Farvningsmønstret var cytoplasmisk og nuklear for MAGE-A3 og A-4, og diffus cytoplasmatisk farvning for MAGE-A10 (Figs.1G-I).

Prøver blev farvet med polyklonalt antistof for MAGE-A3 (X20 ), kloner 57b og A3 hybridomsupernatanter for MAGE-A4 og MAGE-A10, henholdsvis (x15). Prøver fra den normale æggestok og testikler blev anvendt som negative og positive kontroller, hhv. A-C: Farvning af normalt ovarie viser ingen reaktivitet. D-F: Farvning af testis viser sædkanaler med stærk intratubulær farvning, og fraværende uspecifik reaktivitet. G-I:. Farvning af æggestokkene tumor viser stærk cytoplasmatisk og /eller nukleare farvede mønstre

Co-ekspressionen af ​​MAGE-A og MAGE-C1 i kræft i æggestokkene

Hyppigheden af co-ekspression af MAGE-antigener er vist i tabel 2. Den højeste hyppighed af co-ekspression blev observeret for -A4: -A10 (29%). Mens de er begge forholdsvis sjældne, den MAGE-C familien antigen (-C1) tendens til at være co-udtrykkes med MAGE-A1 [OR 4,4, p = 0,00015, CI 3,6-5,2], og at blive udtrykt selvstændigt med den anden MAGE- En familie antigener (figur 2a). MAGE-En familie antigener -A1: -A4 [OR 3,7, p = 0,0003, 3,0-4,4], og -A1: A3 [OR 2,8 p = 0,0022, CI 2,2-3,5] har den stærkeste co-udtryk; næsten alle par er forbundet bortset -A1: -A10 (OR = 1,2, p = 0,7 CI 0,6-1,8), som antyder, at de udtrykkes uafhængigt. For at karakterisere den flerdimensionale mønster af MAGE udtryk, blev det fylogenetiske træ i figur 2b skabt, hvorved hvert blad der ender i et cirkeldiagram symboliserer en person eller et sæt af mennesker. Der er to forskellige mønstre af udtryk, der observeres. Den MAGE-A4-gen dirigerer en stor mønster af udtryk (nederste højre clader), og senere udvikler sig til MAGE-A3 og -A10 udtryk i denne patientpopulation. Den anden unikke ekspressionsmønster består af en selvstændig ekspression af MAGE-A3 og -A10, som derefter udvikler sig til -A4 (øverste højre clader). I stærk kontrast, MAGE-C1 udtryk sjældent forekommer alene og dukker sporadisk hele fylogenetisk træ. Tilsvarende vises MAGE-A1 sjældent og sjældent i MAGE-A10 clade. Disse observationer omsættes til stærke kliniske implikationer inden for dette store studie kohorte.

(A) MAGE-A1 er co-udtrykt med A3 eller -A4 eller -C1. MAGE-A3 co-udtrykkes med -A10. MAGE-A4 er co-udtrykkes med MAGE-A10. Den mørkere farve intensitet repræsenterer en stærkere betydning. De stærkeste foreninger er mellem MAGE-A1 til a4, MAGE-A1 til -C1 og MAGE-A1 til A3. Odds ratio (OR) er større end 1 indebærer antigenerne tendens til at blive vist sammen. (B) fylogenetisk træ for MAGE-ekspression. Hvert blad ender i et lagkagediagram symboliserer en person.

Korrelation af MAGE antigen Expression med Klinisk Outcome

Forholdet mellem MAGE udtryk og klinik-patologiske parametre blev undersøgt. Vi fandt, at MAGE-A3 og A4 ikke havde individuelle prognostiske virkninger. Derfor har vi fokuseret yderligere analyse af MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-C1 og andre kendte klinisk-patologisk prognostiske faktorer i kræft i æggestokkene.

Alene, MAGE-A10-ekspression (204/395, 52%) var forbundet med dårligere klinisk resultat (median PFS 8,8 [7,2-12,3] vs. 15,5 [13.6-18.4] måneder,

s

= 0,009; OS 37.8 [28,2-45,0] vs. 45,0 [39,8-52,2] måneder, p = 0,0781). Co-udtryk med MAGE-C1 (25/204, 12%) vendt denne tendens til PFS, men ikke OS: A10 (+) /C1 (-) patienter havde median PFS på 7,9 måneder (7.0-12.1) versus A10 (+) /C1 (+) 13.1 måneder (CI9.5-29.9). Stratificeret i fire grupper baseret på A10 /C1 udtryk mønster, dette mønster holder (log-rank test p = 0,0133), og foreslår, at A10 (-) /C1 (+) udtryk kan være beskyttende (median PFS 20 [15,7-NA] måneder ) (fig. 3).

samlet overlevelse kurver for patientgrupper baseret på MAGE-A10 og -C1 udtryk. MAGE-C1 udtryk forudsiger en forbedret progressionsfri overlevelse og en tendens til forbedret samlet overlevelse. Ekspression af MAGE-A10 dæmper overlevelse resultater til graden af ​​patienter med negativ MAGE udtryk.

Expression mønstre var ikke i fællesskab er forbundet med alderen (p = 0,900), fase (p = 0,1373), bedømmelse ( p = 0,4532), histologi (p = 0,737), primære sted (p = 0744) eller debulking status (p = 0,112) (tabel 3). MAGE-C1-ekspression var forbundet med platin følsomme sygdom (28/38, 74% versus 70/142, 49%; p = 0,009) og den kliniske respons (30/38, 79% versus 92/164, 56%, p = 0,015).

Selvom vi fokuseret på MAGE-A10, den mindre udbredt MAGE-A1 (42/281, 15%) blev også mildt forbundet med dårligere overlevelse resultater (median PFS 10,3 [6.2- 15,0] vs 12,8 [10.5-15.7] måneder

s

= 0,043, OS 38,7 [20,3-78,4] vs. 41,3 [36.5-46.6] måneder p = 0,607). For PFS, MAGE-A1 co-ekspression med A10 er overflødigt (stratificeret log-rank test p = 0,57), men A1 (+) /A10 (-) patienter har lidt dårligere prognose (median PFS 12.7 [5,3-36,6] vs. 16,3 [14.1-19.4] måneder, p = 0,0187). For at modellere alle tre antigener fællesskab, anbefaler vi overvejer udtryk for enten A1 eller A10-antigen sammen med ekspression af MAGE-C1; effekten er ikke signifikant forskellig fra den lagdeling præsenteret i Tabel 3.

Korrelation af antistofrespons på den MAGE Antigen med Klinisk Outcome

ELISA til serum MAGE-antigen-specifikke antistoffer blev udført på serumprøver opnået ved diagnose fra 285 af de 400 EOC patienter (tabel 2). Spontant inducerede humorale respons på mindst ét ​​MAGE-A-antigen blev observeret hos 9% (27/285) af patienterne, hvoraf 85% (23/27) udtrykte ligeledes et MAGE-A-antigen. Den serologiske reaktion på enhver MAGE antigen blev ligeligt fordelt mellem alle klinisk-patologiske parametre (tabel 4). Tilstedeværelsen af ​​humorale immunrespons på nogen af ​​de MAGE-antigener forudsagt en dårligere samlet overlevelse (median PFS 12.3 [6,4-19,7] vs. 13,5 [10.9-16.5] måneder, p = 0,231; median OS 27.8 [17,3-52,2] vs 45,4 [40.2-51.9] måneder, p = 0,002) (Figur 4).

samlet overlevelse kurver for patienter grupper baseret på tilstedeværelsen af ​​anti-MAGE autoantistof. Humoral svar på enhver MAGE-antigen forudsiger dårlig samlet overlevelse, og ingen signifikant sammenhæng med progressionsfri overlevelse.

Diskussion

Immunterapi er en lovende tilgang til at forbedre overlevelse og klinisk resultater i æggestokkene kræftpatienter [21] – [23]. Blandt de mulige tumorantigen mål, er CTA betragtes som de mest lovende kandidater til udvikling af anti-cancer-vacciner. For at vurdere nytten af ​​MAGE-familien TCL som mål for specifik immunterapi i EOC, blev den nuværende omfattende analyse foretaget på et stort panel af tumorer i æggestokkene. Vores resultater viser afvigende ekspression af MAGE-A1, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A10 og MAGE-C1 i 15%, 36%, 47%, 52% og 16% af EOC prøver henholdsvis. Desuden fandt vi, at i betragtning af nogen af ​​disse MAGE-antigener, ca. 78% viste ekspression af mindst et af disse fem CT-antigener. Desuden blev MAGE-A1 og MAGE-A10 udtryk forbundet med dårlig klinisk resultat, mens MAGE-C1 /CT7 var forbundet med forbedret overlevelse.

Hyppigheden af ​​MAGE udtryk i EOC, at vi rapporterer er generelt i overensstemmelse med den rapporteret for de fleste andre tumorer, undtagen for melanom og ikke-småcellet lungekræft [16], [24]. Ekspression af MAGE-A3-mRNA er blevet fundet i 10-40% af flere tumortyper, herunder blære [25], bryst [26] og myelomatose [27]. Med hensyn til EOC, hyppigheden af ​​MAGE-A1 og A3 udtryk, vi rapporterer er den samme som rapporteret i tidligere undersøgelser, med undtagelse af Zhang

et al

som fandt en 54% og 37% ekspression i ovariecancer væv, henholdsvis [28] – [30]. Det kan afspejle forskelle i undersøgelsens population, da der var langt flere tidlige stadie tumorer end vores studiegruppe. I en tidligere undersøgelse, udtryk for MAGE-A4 negativt korreleret med overlevelse eller indirekte til etablerede prognostiske faktorer i ovariecancer [31]. I overensstemmelse med disse undersøgelser, vores resultater viser en klar sammenhæng til MAGE udtryk og prognose. I denne henseende mens MAGE-A1 og MAGE-A10-ekspression blev forbundet med dårlig klinisk resultat blev MAGE-C1 forbundet med forbedret overlevelse. Disse modsatrettede overlevelse fund blandt de forskellige MAGE antigen familier rejser mange væsentlige spørgsmål vedrørende den rolle, som MAGE gener i tumorigenese, invasion og metastase i EOC.

Generelt MAGE antigener oftere udtrykt i patienter med fremskreden sygdom og dårligt resultat, hvilket indikerer, at deres ekspression kan bidrage til tumorgenese [26], [32] – [37]. Flere undersøgelser har vist, at MAGE-proteiner er kritiske for celleoverlevelse, hvilket øger tumorgene egenskaber af celler og derfor kan aktivt bidrage til udviklingen af ​​maligniteter [38] – [40]. Da CT antigen ekspression er blevet associeret med tumorigen transformation af cancer stamceller [41], er det muligt, at MAGE-A1 og MAGE-A10 udtrykkende ovariecancerceller repræsenterer en population med selvfornyende stamceller egenskaber, og derfor mere modstandsdygtigt immun eliminering eller kemoterapi.

i modsætning til MAGE-A1 og MAGE-A10, den mulige mekanisme (r), hvorved ekspression af MAGE-C1 /CT7 medfører en forøget overlevelse er mindre klar. Ved sammenligningen proteinstrukturen af ​​MAGE familiemedlemmer, mens de første og andet domæne er stærkt konserverede blandt MAGE-A og -C familiemedlemmer, MAGE-C1-proteinet bærer en unik funktion. Foruden en 275-aminosyre MAGE-homolog segment på dets C-terminus, MAGE-C1 /CT-7 har en 867-aminosyre region sammensat af tre typer af tandemgentagelser i dets N-terminus [11]. Denne region kan være af væsentlig betydning som den repetitive proteinsekvens kan forme epitoperne frembydes til immungenkendelse af MAGEC1 /CT-7 og potentielt derved bestemme kvaliteten af ​​de resulterende immunreaktioner.

Desuden vores resultater tyder at patienter med anti-MAGE humoral immunitet havde dårligere prognose. Disse resultater ikke nødvendigvis, at anti-MAGE immunreaktioner direkte forringe behandlingsresultater i æggestokkene kræftpatienter. Da antigen densitet præsenteret af antigenpræsenterende celler

in vivo

differentielt påvirker danne anti-tumor humorale og T-celle responser [42], foreslår vi, at patienter, som udviklede spontane immunreaktioner er dem med høj antigen densitet fordi af fremskreden sygdom byrde, og derfor med dårligere prognose. Disse patienter er stadig tilbøjelige til at drage fordel af MAGE-rettet immunterapi, fordi deres igangværende anti-MAGE-A immunreaktioner er ikke effektive. I en tidligere undersøgelse af spontane humorale immunrespons mod NY-ESO-1 CT-antigen, virkningen af ​​humorale immunitet var neutral på patientens prognose [43].

Fordi udtryk for MAGE-antigener er reguleret af epigenetiske mekanismer såsom methylering og histonacetylering, vi ræsonnerede, at MAGE-antigen ekspression i tumorer kan være resultatet af aktiveringen af ​​en koordineret gen-ekspression program, snarere end en række uafhængige begivenheder [6]. Ved hjælp af analysemetoder, nærværende undersøgelse identificerede væsentlige co-ekspression blandt MAGE-antigener. Disse resultater understøtter forestillingen om, at kræft i æggestokkene erhverver en gametogenic transskription profil, hvor der typisk tavshed gener nu aktiveret fører til tumor progression. Vores resultater viser, at MAGE-A4 er den centrale gen, der dirigerer det mønster af ekspression af de andre gener, med MAGE-C1 kun spirende sporadisk i fylogenetisk træ. Tilsammen vores resultater antyder, at MAGE-A1, -A10 og -C1 er mulige prognostiske faktorer i ovariecancer, med MAGE-A1 og A-10 er forbundet med dårlig prognose; og MAGE-C1 /CT7 associeret med forbedret prognose. Vi foreslår MAGE-A1 og MAGE-A10 som prioriterede mål for immunterapi i kræft i æggestokkene. Da MAGE-A4 udviser en relativt høj frekvens af udtryk, og synes at lede en større mønster af co-ekspression af andre MAGE-antigener (Fig. 2b), vi også foreslå MAGE-A4 som et prioriteret mål for kræft i æggestokkene immunterapi.

Støtte oplysninger

tabel S1.

Primere til MAGE gener for RT-PCR

doi:. 10,1371 /journal.pone.0104099.s001

(DOCX)

tabel S2. Salg MAGE antistoffer og betingelser for IHC

doi:. 10,1371 /journal.pone.0104099.s002

(DOCX)

tabel S3.

MAGE-antigen status i kræft i æggestokkene

doi:. 10,1371 /journal.pone.0104099.s003

(DOCX)

Tak

Forfatterne vil gerne takke Erika Ritter og Christina Sedrak, fra LICR NY gren, for deres fremragende teknisk bistand.