PLoS ONE: EZH2 Regulerer Cofilin Aktivitet og Colon Cancer Cell Migration ved Målretning ITGA2 Gene

Abstrakt

Reorganisering af cytoskelet via actin remodeling er et grundlæggende trin i celle bevægelse. Selvom celle migration af normale og cancerceller kan stimuleres ved forskellige intra- og ekstra-cellulære faktorer, alle veje ultimative om regulering af cofilin aktivitet. Cofilin er en lille actinbindende protein stand til at binde begge former for actin, kugleformede og filament, og reguleres af phosphorylering i serin 3. Efter phosphorylering i serin 3 cofilin er inaktivt, derfor ikke kan binde actin molekyler og cytoskelet remodeling forringes. Den histon methyltransferase EZH2 er ofte overudtrykt i mange tumortyper, herunder kolorektal cancer (CRC). EZH2 overaktivitet, hvilket resulterer i epigenetisk gendæmpning, er blevet associeret med mange tumor egenskaber, herunder invasion, angiogenese og metastase men lidt er kendt om de nedenunder molekylære mekanismer. Heri rapporterer vi at EZH2 kan kontrollere cofilin aktivitet og følgelig celle bevægelse af CRC cellelinjer gennem en ikke-konventionel roman akse, der involverer integrin signalering. Faktisk viser vi, hvordan genetiske og farmakologiske hæmning (DZNep og GSK343) af EZH2 funktion producerer hyper phosphorylering af cofilin og reducerer celle migration. Vi har tidligere påvist ved kromatin immuno-nedbør, der Integrin alfa 2 (ITGα2) udtryk er reguleret af EZH2. I den foreliggende undersøgelse giver vi bevis for, at signaleringsaktiviteten af ​​de-undertrykt ITGα2 i EZH2-lyddæmpet celler er i stand til at øge cofilin phosphorylering, hvilket igen reducerer cellemigrering. Denne undersøgelse foreslås også nye mekanismer, der kan give nye anti-metastatiske strategier for CRC behandling baseret på hæmning af epigenetiske faktor EZH2 og /eller sit mål gen

Henvisning:. Ferraro A, Boni T, Pintzas A ( 2014) EZH2 Regulerer Cofilin Aktivitet og Colon Cancer Cell Migration ved Målretning ITGA2 Gene. PLoS ONE 9 (12): e115276. doi: 10,1371 /journal.pone.0115276

Redaktør: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Tyskland

Modtaget: August 6, 2014 Accepteret: 20. november 2014 Udgivet: December 30, 2014

Copyright: © 2014 Ferraro et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af EU FP7 indrømmer FP7-241783 EpiDiaCan til AP

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

Tumor celle migration er afgørende for metastatisk erhvervelse kapacitet [1], [2]. Migration kompetence kræver aktivering af signalveje, der konvergerer i actin polymerisering og de-polymerisering, der kører dannelsen af ​​særlige celle-membran fremspring såsom lamellipodia, invadopodia og filopodia. Actin dynamik reguleres af talrige actinbindende proteiner, deriblandt actin-depolymerisering faktor (ADF), cofilin-1 (non-muscle type) og cofilin-2 (muskel type) er dem, der tillader celle bevægelse gennem den ovenfor beskrevne membranstrukturer [3], [4]. Da cofilin-1 er den mest allestedsnærværende form for actinbindende proteiner, i nærværende undersøgelse analyserede vi kun denne type, og heri vi henvise til det som cofilin. Cofilin aktivering er et vigtigt skridt for tumorcellemigration [5], [6], selvom, mest sandsynligt, er det den generelle aktivitet af cofilin-regulerende veje, der driver motilitet af cancerceller [4]. Adskillige mekanismer cofilin regulering kendes [3], [4]. Den bedst karakteriserede går videre phosphorylering i serin-3 (p-cofilin) ​​ved LIM kinase 1 og 2 (LIMK1, LIMK2) [7], ved testikelkræft proteinkinase 1 og 2 (TESK1, TESK2) [8], og ved de-phosphorylering i serin 3 ved phosphatase slangebøsse (SSH) og chronophin [9], [10]. Phosphorylering i serin 3 inaktiverer cofilin, forhindrer dets binding til de store substrater globulær-actin (G-actin) og filament-actin (F-actin) [11], hvorimod de-phosphorylering i serin-3 tillader substratbinding og F-actin adskillelse . Adskillige signaleringsmekanismer styre cofilin funktioner og følgelig celle-form og -locomotion. De spænder fra Rho familie små GTPaser handler på LIMKs, til integrin-medieret signalering handler på TESK1 /2 [12]. SSH phosphatase kan aktiveres af F-actin, 14-3-3-proteiner, PKDs og ved PLCβ /PI3Kγ-GSK3-signalvejen [12].

Enhancer of Zeste Homolog 2 (EZH2) tilhører Polycomb gruppen familie [13] og er den katalytiske subunit af histon methyltransferase kompleks kaldet Polycomb Undertrykkende Complex 2 (PRC2). PRC2 binder til target-gen promotorer til epigenetisk undertrykkelse via di- eller trimethylation af histon H3 ved lysin 27 rest (H3K27me2-3). EZH2 overekspression er associeret i mange aggressive tumorer [14], [15], med dårlig prognose [16] og tilstedeværelse af fjernmetastaser i kolorektal cancer (CRC) [17]. EZH2 nedregulering kan reducere væksten af ​​invasiv mammacancer [18], tumor angiogenese [19] og

in vitro

cellemigration /invasion af CRC-cellelinjer [17].

veldefineret arkitektur epitel væv, såsom colon mucosa, afhænger i høj grad et udtryk for særlige celle overflade adhæsionsmolekyler såsom integriner, der interagerer med ekstracellulær matrix (ECM) og omkringliggende celler. De pattedyrgenomer koder 18 α- og 8 β-integrin-underenheder, der i kombination frembringer 24 forskellige integrin (α-β-) heterodimerer uden overflødige funktioner lige fra ekstracellulære collagen-receptorer til signaltransduktion mediatorer [20]. Ændringer i integrin udtryk forekommer i mange cancertyper, og om integriner kun handle som tumor forstærkere eller tumorundertrykkere stadig debatteret. ITGα2 danner heterodimerer med ITGβ1 -α2β1- og interagerer med ECM s kollagen fibre [20]. Det er blevet rapporteret, at integrin α2β1 kan blokere celleproliferation [21] – [23] og for at undertrykke metastase i mus og mennesker [24]. I prostatakræft, har ITGα2 nedregulering blevet foreslået som potentielle tumormarkør [25]. Vi beviste for nylig, at EZH2 epigenetisk undertrykker ITGα2 udtryk [17]. Interessant, under karakteriseringen af ​​den nyetablerede EZH2-lyddæmpet cellelinie (opkaldt HCT-Shez-2), en bemærkelsesværdig hyper-phosphorylering af cofilin i HCT-Shez-2 i forhold til HCT116 parentale celler blev opdaget.

Selvom cofilin funktion er beskrevet i tumor cellebiologi, regulatoriske netværk der integrerer epigenetiske faktorer, deregulering af signaltransduktionsveje og cofilin aktivitet er dårligt beskrevet. Her viser vi, at histon methyltransferase EZH2 kontrol cofilin fosforylering og dermed celle bevægelse gennem en roman sti, der involverer ITGα2 og dens signal-transduktion aktivitet.

Materialer og metoder

Cell kultur

Caco-2, DLD-1, HT-29, HCT116 og RKO cellelinier blev opretholdt i DMEM-medium indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 1X penicillin, 1X streptomycin, og 2 mM L-glutamin. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C, 5% CO

2 i fugtig atmosfære. Alle cellelinier, der anvendes i forsøget, er blevet købt fra American Type Culture Collection (ATCC). Proceduren for kloning til HCT-Shez-2-cellelinien er beskrevet i Ferraro et. al. [17].

Western blot og antistoffer

Samlet protein blev ekstraheret med 60 pi RIPA-lysepuffer og Western blotting blev udført ifølge standardprotokoller. Blots blev inkuberet natten over ved 4 ° C med de passende primære antistoffer. Antistoffer anvendt: EZH2 BD Bioscience, USA kode 612.667; fra Millipore, USA H3K27me3 kode 07-449; RAC-1 kode 05-389; fra Santa Cruz, Tyskland: H3 samlede kode sc-8654; Tubulin kode sc-8035; ITGα2 kode sc-74.466; RhoA kode sc-418; Rock1 kode sc-17794; Cdc42 kode sc-87; p-cofilin (Serin 3) kode sc-12912-R; cofilin sc-33.779; TESK1 kode sc-366.681 (for at øge specificiteten af ​​TESK1 antistof i WB analyser nitrocellulose blotting membraner blev skåret vandret mellem -60 og -80 kDa). Protein ekstrakter er blevet fremstillet af mindst to uafhængige forsøg og klatter gentages mindst to gange.

Konfokal mikroskopi

Celler anvendt til immunofluorescens assays blev fikseret med methanol /acetone-opløsning (8:01), vasket, permeabiliseret med 0,3% Triton-X-100, og blokeret med 5% BSA før inkubering med primære antistoffer eller med Alexa fluor 546 phalloidin (Invitrogen USA, kode A22283). Kerner blev modfarvet med Hoechst.

hæmmere og siRNA transfektion

ROCK-1-inhibitor (Y-27632 Sigma, USA kode Y0503-1MG) blev anvendt ved en slutkoncentration på 30 uM i 24 timer . EZH2 inhibitorer (3-Deazaneplanocin A (DZNep) Santa Cruz, Tyskland kode sc-351.856; GSK-343 Aktive Biochemicals, Hong Kong kode A-1416) blev anvendt ved en slutkoncentration på 1, 3 og 5 uM i 48-72 timer . For siITGα2 transfektion blev celler udsået i plader med 6 brønde og transficeret med Lipofectamnine 2000 siEZH2_4 og siEZH2_7 (Quiagen, Tyskland koder SI00063973, SI02665166) siITGα2 (Quiagen, Tyskland koder SI02664081, SI02664088) og siRhoA (Dharmacon, USA kode L-003860 -00-0005) er blevet anvendt i en slutkoncentration på 50 pM i overensstemmelse med producentens anvisninger.

tredimensionale kultur

i tredimensionel kultur Matrigel (BD, Bioscience) blev anvendt . Poly-lysin præ-overtrukne dækglas blev lagt i 24-brønds plade. Matrigel blev fortyndet med kold komplet DMEM-medium til en slutkoncentration på 50%, blev 200 pi afsat på hver brønd indeholdende dækglas, og pladen blev inkuberet ved 37 ° C i 15 ‘. 0,5 × 10

3 celler blev fortyndet i 100 pi kold DMEM og blandet med 100 pi 100% Matrigel. De resulterende 200 pi blev tilsat til brøndene med forvarmet Matrigel. Pladen blev inkuberet i en fugtig atmosfære ved 37 ° med 5% CO

2 i 3 dage.

Migration assay

Celler blev trypsiniseret, vasket med medium indeholdende 1% FBS, og talt . 10

5-celler blev udpladet i øvre kammer af en 8 um-pore Transwell filter (Corning), der er monteret i en 24-brønds skål indeholdende 10% FBS-medium. Filtrene blev præ-coatet med fibronectin. Cellerne fik lov til at migrere ved 37 ° C, 5% CO

2 for 36-40 timer, fikseret med methanol og farvet med 0,1% vægt /volumen krystal violet. Undersiden af ​​filtrene, blev observeret med 40X objektive og migrerende celler blev bestemt i hver brønd. Eksperimenter blev udført in duplo, og gentaget to gange. For migration assay kombineret med siITGα2 transfektion blev cellerne trypsineret 24 timer efter transfektion, podet på transwell og inkuberet ved 37 ° C i andre 24 timer. For migration assay kombineret med rock1 inhibitor blev celler podet på Transwell i overværelse af inhibitoren og inkuberes ved 37 ° C i yderligere 24 timer.

Kuglehoben (G-) og Filament (F-) actin assay

80-85% konfluente celler blev vasket direkte på 15 cm petriskåle to gange med PBS ved stuetemperatur, skrabet over i PBS og pelleteret. Cellepellets blev resuspenderet i 800 pi 37 ° C lysepuffer (1 mM ATP, 50 mM PIPES pH 6,9, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM EGTA, 5% vol /vol glycerol og 0,1% vol /vol for: Nonidet P-40, Tween 20 og Triton X-100) suppleret med proteaseinhibitorer. Celler blev homogeniseret ved forsigtigt at pipettere 10 gange op og ned og inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter. Prøver blev centrifugeret ved 16000 g i 75 min ved 22-25 ° C. Supernatanter blev fjernet til bestemmelse af G-actin. Pellets indeholdende F-actin blev blandet med 800 pi RIPA buffer og sonikeret på is i 5 min (30 sek. ON /30 sek OFF, max effekt) under anvendelse Bioruptor ultralydsapparat (Diagenode, Belgien) for at opløse dem. Tyve mikroliter af hver fraktion blev blandet med SDS-påsætningsbuffer, denatureret i 8 minutter ved 95 ° C og fyldt på polyacrylamidgel. Actin detektion blev udført ved hjælp af en anti-actin monoklonalt antistof (kode sc-8432) indkøbt fra Santa Cruz, Tyskland.

RNA Extraction /Reverse Transcription og Real Time-PCR

Total RNA isoleret fra dyrkede celler blev udført ved anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland). Revers transskription blev udført fra 3,0 ug oprenset RNA ved anvendelse af SuperScript revers transkriptase (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland) ifølge producentens instruktioner.

realtid kvantificering på mRNA-niveau blev foretaget i 96-brønds PCR plader under anvendelse af en Bio-Rad iCycler og iQ5 Flerfarvet realtids-PCR detektionssystem (Bio-Rad, Hercules CA, USA). Hver reaktion indeholdt 1 × iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules CA, USA) og 150 nmol /l af hver primer. Alle gener blev testet i triplikater. Resultater blev analyseret på iCycler software. Værdier blev normaliseret til GAPDH. Anvendte primere var følgende: glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH): GAAGGTGAAGGTCGGAGT (Fw) og CATGGGTGGAATCATATTGGAA (Rv); TESK1:. GCCCTGACACACAATCAG (Fw) og AAGAGGTCTGACCGGCTTC (Rv)

GST pull-down assay

For Rac1-GTP og cdc42-GTP GST pull-down assay, celler blev dyrket i 10 cm petri fade og cellelysater blev fremstillet med lyseringsbuffer anvendt til Western blotting. 50 ug af det identiske proteinekstrakt blev inkuberet med GST-PAK (p21-aktiveret kinase) til glutathion-agaroseperler i 1 time ved rotation ved 4 ° C, og perlerne blev vasket 4 gange i vaskebuffer (50 mM Tris-HCI (pH 7,4 ), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1% (volumen /volumen) Triton X-100, 1 mM dithiothreitol (DTT), 10 ug /ml aprotinin, 10 ug /ml leupeptin og 0,2 mM PMSF).

Resultater

Cofilin phosphoryleringsbegivenheder stiger upon genetisk lyddæmpning og farmakologisk hæmning af EZH2 i CRC-cellelinjer

Vi har tidligere transficeret HCT116 coloncarcinomceller med en kort hårnål RNA (shRNA) vektor, der bærer en stilk løkke oligonukleotid mod EZH2 mRNA. De stabile shEZH2 kloner (HCTshEZ-2) display meget lav mængde EZH2 protein samt lav trimethylation ved lysin 27 af histon H3 (H3K27me3), den EZH2-specifikt substrat (fig. 1A). Vi rapporterede, at HCTshEZ-2 celler viser reduceret vandrende og invasive kapacitet i forhold til forældrenes og mock transficeret (HCTshpSUP) HCT116 celler [17]. For at identificere potentielle faktorer, der kan styre celle bevægelse af HCTshEZ-2 celler, protein udtryk analyse af faktorer, der er involveret i reguleringen af ​​cytoskeleton dynamik såsom RhoA, cdc42, rock1, Rac1, Cofilin og p-cofilin (nedstrømseffektorer af Rho GTPase vejen) er blevet analyseret ved Western blot (WB). Som rapporteret i fig. 1B, silencing af EZH2 påvirkede ikke protein ekspressionsniveauer for ingen af ​​de analyserede actin-modulerende faktorer. Omvendt blev en bemærkelsesværdig hyper-phosphorylering i serin 3 i lille actinbindende protein cofilin påvist (fig. 1B). Desuden har i HCTshEZ-2-celler lyddæmpningssystemer af EZH2 ikke ændre GTPase aktivitet af cdc42 og Rac1 der blev evalueret ved hjælp af GST-PAK pull down assay (S1 Fig.). Vi undersøgte også indirekte den potentielle aktivering af RhoA i HCTshEZ-2 celler. Ved at tavshed RhoA med siRNA teknologi fandt vi, at p-cofilin niveau forblev den samme på tværs af alle cellelinier (HCT116, HCTshpSUP og HCTshEZ-2). Derfor gjorde udtømning af EZH2 udtryk ikke påvirke RhoA aktivitet og dermed cofilin fosforylering (S2A Fig.). For at bevise, at den observerede hyper-phosphorylering af cofilin er ikke en off-target effekt af kloningen blev EZH2 transient depleteret med to forskellige siRNA’er oligoer i HCT116 og RKO-celler og 48 timer efter niveauer af p-cofilin blev analyseret ved WB. Som vist i fig. 1C for HCT116 og i S2B Fig. for RKO, forbigående EZH2 silencing resulterede i en signifikant forøgelse af p-cofilin samt ITGα2 niveauer i begge cellelinier.

A. Proteinekspression og global methyltransferase aktivitet af EZH2 i HCT116 og i HCTshEZ-2 stabile kloner samt i HCTshpSUP mock kontrolceller analyseret ved WB. B. Proteinekspression analyse af Rho GTPase familie komponenter og ITGα2 i HCT116, HCTshEZ-2 og HCTshSUP celler. C. Forbigående udtømning af EZH2 med to forskellige siRNA oligoer øger cofilin fosforylering på samme måde som stabil lyddæmpning. D. fasekontrastmikroskopi billeder af HCT116, HCTshEZ-2 og HCTshSUP celle-fænotyper, skala bar 150 um. E. Repræsentative billeder af konfokal fluorescerende mikroskop i HCT116 og HCTshEZ-2 celler, hvor p-cofilin blev farvet (grøn). Kerner er modfarvet med Hoechst (blå). Scale bar størrelse 150 um. F. EZH2 proteinniveauer sammenlignes med cofilin og p-cofilin niveauer i 7 CRC cellelinjer. Tal under klatter indikerer band kvantificering, som blev udført ved hjælp af en dedikeret software og tubulin udtryk som reference lastning kontrol. Alle WB forsøg er blevet gentaget mindst tre gange, er repræsentative blots og kvantificering præsenteres.

Effekten af ​​cofilin inaktivering på fænotype og vækst egenskaber HCTshEZ-2 celler er godt tydeligt i standard to-dimensionelle kultur. Faktisk, i HCTshEZ-2-celler antallet af celle-membran fremspring er dårlig, mindre fremtrædende og aflange form af kontrol- HCT116 celler er tabt, er HCTshEZ-2-celler mere runde og flade (fig. 1D). Brug af konfokal mikroskopi og fluorescerende immunassay til pletten p-cofilin, bekræftede vi, at inaktive p-cofilin forøges i HCTshEZ-2-celler sammenlignet med de parentale HCT116 celler og at p-cofilin hovedsageligt lokaliseret i kernen af ​​HCT116, hvorimod i HCTshEZ- 2 celler p-cofilin er lokaliseret både i kernen og i cytoplasmaet (fig. 1E).

for at kontrollere, om forholdet mellem EZH2 og p-cofilin er en generel egenskab ved CRC cellelinjer, vi analyserede cofilin , p-cofilin og EZH2 ekspressionsniveauer i 7 CRC cellelinjer. I disse 7 CRC cellelinjer en tidligere sammenligning mellem EZH2 protein og globalt plan for dets substrat H3K27me3 viste, at cellerne over-udtrykkende EZH2 (HCT116, RKO og SW620) også præsentere høje H3K27me3 (data ikke vist, se ref. [17] ). Interessant nok har cellelinier med høj EZH2 proteinniveauer vist næsten udetekterbar (HCT116) eller lav (SW620 og RKO) p-cofilin sammenlignet med de andre undersøgte cellelinier, med undtagelse af Caco-2 mellemliggende adenom-cellelinje (fig. 1F ). Derimod niveauer af cofilin protein (total-cofilin) ​​var i det væsentlige den samme på tværs af de 7 cellelinier undersøgt. For at kvantificere sammenhængen mellem EZH2 ekspression og cofilin phosphorylering i alle CRC-cellelinjer, med undtagelse af Caco2, den absolutte intensitet EZH2 WB bånd af fig. 1F er afbildet mod det absolutte intensiteten af ​​p-cofilin WB bands bruger et punktdiagram. En signifikant negativ korrelation koefficient (

R

= -0,7532) af den rette linje, der opnås med de data-punkter viser, at p-cofilin niveauer omvendt korreleret med hensyn til EZH2 niveauer i 6 ud af 7 CRC cellelinjer ( S3 fig.).

for yderligere at validere p-cofilin western blot data og bekræfter, at p-cofilin ikke bidrager til celle migration, når lokaliseret i kernen, HCT116, HCTsh-EZ-2, HT29 (højeste WB p-cofilin niveau) og RKO (lav WB p-cofilin niveau) cellelinjer blev analyseret med konfokal mikroskop ved co-farvning p-cofilin med G-actin og separat med total-cofilin. Fig. 2A viser, at p-cofilin farvning i HT29-celler er høj i forhold til HCT116, HCT-Shez-2 og RKO, bekræfter WB data. Desuden blev p-cofilin i HT29-celler udelukkende påvist i cytoplasmaet i modsætning HCT116, HCTshEZ-2 og RKO cellelinier. I HT29, blev den samme cytoplasmatiske mønster også detekteret for total-cofilin (HT29 enkelt plan billede i fig. 2B). Interessant nok i HCT116, HCT-Shez-2 og RKO-celler total cofilin blev primært lokaliseret i cytoplasmaet i modsætning p-cofilin (fig. 1 E og 2B). Om G-actin, co-farvende eksperimenter påpegede, at G-actin er lokaliseret i cytoplasmaet og i kernen af ​​alle cellelinier. Vi observerede, at nuklear p-cofilin sjældent co-lokalisere med G-actin i HCT116 og RKO celler, der beviser, at p-cofilin er ikke i stand til at binde G-actin i kernen. Endvidere selvom HCT-Shez-2-celler afledt fra HCT116 de viser p-cofilin også i cytoplasmaet i lighed med HT29-celler er karakteriseret ved lav vandrende kapacitet (fig. 2A).

A. HCT116, RKO, HCT-Shez-2 og HT29 er blevet co-farvet med p-cofilin (grøn) og G-actin (rød) for at studere den intracellulære lokalisering af begge proteiner. Kerner modfarvet med Hoechst (blå). En sammenfletning af alle tre farver er også vist (fusionere). Scale bars 10 um. B. Cofilin (grøn) farvning i CRC celler. Kun HT29-celler præsenteres næsten udelukkende cytoplasmatisk lokalisering som vist ved en enkelt-plane konfokalt billede. Scale bars 50 um. C. Farmakologisk forstyrrelse af EZH2 protein ved DZNep i CRC cellelinjer med høj EZH2 proteinekspression. D. Farmakologisk hæmning af EZH2 enzymatisk aktivitet ved GSK343. Lave niveauer af H3K27me3 i behandlede celler indikerer, at GSK343 ​​effektivt blokerer EZH2 aktivitet. E. TESK1 protein (øverst) og mRNA (nederst) ekspression analyser på CRC-celler med høj (HCT116 og HCT-shpSUP) og bragt til tavshed (HCTsh-EZ-2A /B) EZH2 proteinniveauer. F. siRNAs versus ITGα2 mRNA er blevet anvendt til at reducere ITGα2 proteinekspression. Virkningerne af ITGα2 lyddæmpning på cofilin og p-cofilin blev analyseret ved hjælp af WB. Tal under klatter indikerer band kvantificering, som blev udført ved hjælp af en dedikeret software og tubulin udtryk som reference lastning kontrol. For p-cofilin kvantificering i HCT116 og HCT-Shez-2-celler alle værdier er blevet normaliseret i forhold til p-cofilin værdi utransficeret HCT116. Alle WB forsøg er blevet gentaget mindst to gange, og repræsentative blots er vist.

Forholdet mellem EZH2 og p-cofilin blev også undersøgt ved at blokere methyl-transferaseaktivitet af EZH2 med to EZH2 inhibitorer 3 -Deazaneplanocin A (DZNep) og GSK-343 [26], [27] i cellelinjer hvor EZH2 er stærkt udtrykt: HCT116, SW620 og RKO. DZNep behandling forstyrret EZH2 protein i alle cellelinier resulterer i p-cofilin tilvækst uden at påvirke den samlede cofilin ekspression (fig. 2C). Lignende resultater blev opnået med GSK-343 behandling, som effektivt blokerede den enzymatiske funktion af EZH2, idet der blev observeret en bemærkelsesværdig global reduktion i H3K27me3 varemærke i behandlede celler, uden at påvirke EZH2 og cofilin ekspressionsniveauer trods cofilin phosphorylering (fig. 2D).

De EZH2-target-gen ITGα2 delvis kontrol cofilin phosphorylering /de-fosforylering i CRC-cellelinjer

Ved at kromatin immuno-udfældning (Chip) vi tidligere demonstreret [17], at EZH2 hyper- methylerer lysin 27 af histon H3 på ITGα2 genpromotor forårsager epigenetisk gen-undertrykkelse (fig. 1B). Interessant, TESK1, en kinase i stand til at phosphorylere cofilin på serin 3 og dermed i stand til at regulere sin aktivitet, kan aktiveres af integrin-medieret signalering [8], [28], der foreslår ITGα2 vej som en kandidat til yderligere undersøgelse. Den de-undertrykt signalering aktivitet ITGα2 gennem TESK1 kan være ansvarlig, i det mindste delvis, der skal øge p-cofilin i EZH2-tavshed celler. For at verificere denne hypotese, blev først Real-Time PCR og WB analyser udført for at kontrollere ekspressionen af ​​TESK1 i CRC-cellelinje, der anvendes til undersøgelsen. Det er vist (fig. 2E), som TESK1 blev udtrykt i HCT116 celler, og at lyddæmpning af EZH2 påvirkede ikke sit udtryk, da der ikke er konstateret ændringer i TESK1 mRNA og protein niveauer blandt kontrol og EZH2-silinced celler. Så, for at tage fat på rollen som ITGα2 på cofilin vej, blev små interfererende RNA-oligoer versus ITGα2 (siITGα2) anvendes til at reducere ITGα2 udtryk i HCTshEZ-2 og HCT116 kontrol celler. Interessant reduktion af ITGα2 proteinniveauet negativt påvirket p-cofilin primært på HCTshEZ-2-celler (fig. 2E). Sammenlignelige resultater blev også opnået efter behandling af DLD1 celler med siITGα2. DLD1 udtrykke høje niveauer af ITGα2 protein sammenlignet med HCT116 (fig. 2E) [17].

Cell behandling med EZH2 inhibitorer fastsatte yderligere bevis for den foreslåede epigenetisk mekanisme af p-cofilin regulering roman. Som vist i fig. 2C og 2D, DZNep og GSK-343 behandlinger effektivt de-undertrykt ITGα2 genet i HCT116, RKO og SW620 celler, som er karakteriseret ved lav ITGα2 udtryk [17]. Faktisk EZH2 inhibitor behandlinger resulterede i en bemærkelsesværdig stigning af p-cofilin i HCT116 og SW620 celler, og havde mindre, men stadig betydelig effekt på p-cofilin niveauer i RKO celler.

Tre-dimensionel cytoskelet organisation og migration evne CRC cellelinier styres af cofilin phosphorylering

morfologiske forandringer, der sker, når HCTshEZ-2-celler podes på matrigel (tredimensionel kultur, 3D) indikerer, at cofilin pathway også kan være ansvarlige for adhæsionsegenskaber afgørende for metastatisk celle-spredning. HCT116 og HCTshEZ-2-celler dyrket i 3D er farvet med phalloidin, som binder F-actin, konjugeret til en fluorescerende kemisk forbindelse og analyseret med fluorescerende konfokal mikroskopi (fig. 3A). I HCTshEZ-2 celler inaktive p-cofilin stabiliserer actin strukturer, der er nødvendige for interaktionen med ECM. Faktisk, efter 3 dage på matrigel viste HCTshEZ-2-celler en flad celle-organ, klart synlige kerner og, endnu vigtigere, en enkelt celle monolag med godt synlige actinfilamenter (pile i fig. 3A). I modsætning hertil HCT116 celler ikke viser høje niveauer af F-actin og celler var i stand til at vokse som en tumor sfære.

A. F-actin blev farvet med phalloin konjugeret til en fluorofor (rød) i HCT116 og HCTshEZ-2 celler dyrket i matrigel. Repræsentative fasekontrastmikroskopi billeder af de samme kulturer præsenteres også for hver cellelinie. Pile viser lange F-actin molekyler. Scale bar 20 pm. B. Analyse af relative mængde af F- og G-actin i CRC-celler med høj (HCT116 og HCT-shpSUP) og bragt til tavshed (HCTsh-EZ-2A /B) EZH2 proteinniveauer. Intensitet af WB bands er blevet kvantificeret, og beregnes i vilkårlige enheder. Repræsentative blot af F- og G-actin er også vist for hver cellelinie. Student T-test blev anvendt til at evaluere statistiske signifikans (*** = p-værdi 0,01) mellem HCTsh-EZ-2A /B-celler og HCT116 celler. C. Migration evne CRC cellelinier transficeret med siITGα2. D. WB-analyse af p-cofilin niveauer i CRC-celler med høj (HCT116 og HCT-shpSUP) og tavshed (HCTsh-EZ-2) EZH2 protein behandlet med rock1 inhibitor (Y27632) sammenlignet med de ubehandlede celler. E. Migration evne CRC cellelinjer behandlet med rock1 hæmmer (Y27632) sammenlignet med de ubehandlede celler.

For bedre kontrollere omfordeling af actinfilamenter i HCTshEZ-2-celler, G-actin og F- actin blev forskelligt isoleret fra HCTshEZ-2-celler samt fra kontrol celler dyrket i standard 2D kultur. Som det tydeligt er vist i fig. 3B F-actin niveauer i HCTshEZ-2-celler var meget mere rigelig end i kontrolgruppen HCT116 celler. Faktisk er den gennemsnitlige F-actin /G-actin-forhold var ca. 3,5 gange højere i HCTshEZ-2-celler i sammenligning med kontrollerne. Endelig, for at bevise, at afvigende inaktivering af ITGα2-cofilin akse, medieret af EZH2, øger tumorcellemigration målte vi migreringsevnen af ​​HCT116, HCTshSUP, HCTshEZ-2 og DLD1 celler efter ITGα2 nedregulering. Som allerede vist i fig. 2D og omtalt ovenfor, siITGα2 effektivt reducerede ekspressionen af ​​ITGα2 i alle cellelinjer analyseret med deraf følgende reduktion af cofilin phosphorylering, der forværrer F-actin /G-actin omsætning. Især siITGα2 primært på HCTshEZ-2 og DLD1 celler øget migration kapaciteten med omkring 25% og 12%, hvilket bekræfter, at EZH2-lyddæmpet ITGα2-cofilin aksen er vigtigt for kræftcellen bevægelse (fig. 3C). er også opnået sammenlignelige resultater med sårheling assay (S4 Fig.).

Den centrale rolle p-cofilin i actin dynamik og cellemigration blev også bekræftet af en farmakologisk hæmning af rock1 aktivitet, hvilket ikke indebærer manipulation af ITGα2 ekspression. Konkret har vi brugt rock1 inhibitor Y-27632 for at blokere cofilin phosphorylering [29]. Rock1 hæmmer reducerede p-cofilin i HCT116, HCTshpSUP og HCTshEZ-2 cellelinjer (Fig. 3D). Reduktion af p-cofilin forbedret den del af aktiv cofilin der blev oversat til en gevinst på migration kapacitet primært på HCTshEZ-2 (fig. 3E). Disse resultater beviser, at forholdet p-cofilin /cofilin i CRC celler er afgørende for kræft-celle spredning og at ITGα2 kan regulere cofilin også gennem veje, der involverer rock1.

Diskussion

Forskellige mekanismer blevet beskrevet for at forklare den pro-metastatisk aktivitet af histon methyltransferase EZH2 i forskellige cancertyper [30] – [32], men kun lidt om dets rolle i forbindelse CRC. I den foreliggende undersøgelse har vi undersøgt dette problem ved at bruge et tab af funktion tilgang for at evaluere rollen af ​​histon modifier EZH2 i CRC cellemigrering. Specifikt tog vi fordel af muligheden for yderligere at karakterisere en CRC-cellelinie (HCT-Shez-2), hvor EZH2 er permanent tavshed og en ny forbindelse i stand til specifikt at inhibere EZH2 methyltransferaseaktivitet, opkaldt GSK-343, samt en forbindelse i stand til at forstyrre PRC2 kompleks, opkaldt DZNep. Det vises, at EZH2 i denne cellelinie epigenetisk styrer celle bevægelse ved at holde cofilin støt aktiv. Ja, efter genetisk og farmakologisk inhibering af EZH2 blev cofilin phosphorylering i serin 3 forøget. Serin-3-phosphoryleret cofilin er inaktiv. Som en konsekvens af cofilin inaktivering, invadopodia samling ved den forreste kant af migrerende celler såvel som adskillelse i back-celle-side ikke kan moduleres, hvilket resulterer i en reduktion af celle bevægelsesevne [3], [6]. Dette kan forklare den bemærkelsesværdige nedgang celle mobilitet HCT-Shez-2 sammenlignet med de parentale HCT116 celler [17]. Den direkte lyddæmpning virkning af EZH2 på up-stream komponenter af cofilin pathway blev udelukket. Faktisk har ingen ændringer i proteinekspression og aktivitet blevet opdaget af WB, GST-PAK trække ned og siRNA analyser for, cdc42, Rac1, RhoA, rock1 samt total cofilin i HCT-Shez-2 celler med hensyn til at kontrollere celler. For at bekræfte den hypotese, at EZH2 regulerer cellemigrering via en alternativ biologisk akse og ikke ved at undertrykke Rho GTPase familie komponenter, søgte vi at undersøge rollen som ITGα2 genet. Faktisk er ITGα2 direkte reguleret af EZH2 [17] og potentielt kan handle på cofilin vej. Følgelig har tidligere undersøgelser vist, at TESK1 er i stand til at phosphorylere cofilin i serin 3 og især TESK1 kan aktiveres ved integrin-medieret signalering [8], [28]. Kvantitativ PCR og WB-analyse afslørede, at TESK1 udtrykkes i HCT116 cellelinie og at EZH2 silencing ændrede ikke TESK1 ekspressionsniveau. Det er endvidere vist, at ITGα2 er den største regulator af cofilin phosphorylering med lyddæmpende ITGα2 protein i HCT116, HCT-Shez-2 og i DLD1 celler. Faktisk efter ITGα2 dæmpende p-cofilin niveauer reduceres, beviser en direkte relation mellem ITGα2 og p-cofilin muligvis medieret af TESK1, selvom vi ikke kan udelukke inddragelse af andre kinaser målrettet mod integriner.