PLoS ONE: Indflydelse af Håndtering adgang til oprettelse og Formering af hoved-halscancer Patient Afledt Xenografter

Abstrakt

Baggrund

Patient afledte xenotransplantater (PDXs) for hoved- og halscancer (HNC) og andre kræftformer repræsenterer stærke forsknings-platforme. De fleste grupper implantere patient væv ind immunsvækkede mus straks selvom betydningen af ​​dette tidsinterval er anekdotisk. Vi testede den hypotese, at tiden fra tumorexcision implantation er afgørende for PDX passage og etablering.

Metoder

Vi undersøgte, om tid eller lagermedium påvirkede PDX levedygtighed for passage to etablerede HNC PDXs ( UW-SCC34, UW-SCC52). Tumorer blev høstet, gemt på iskold medier eller saltvand i 0-48 timer, og implanteret i nye mus. Tumorvækst blev sammenlignet ved tovejs ANOVA med hensyn til tid og opbevaringsbetingelser. Tre nye HNC PDXs (UW-SCC63-65) blev dannet ved at implantere patient væv i mus umiddelbart (Time 0) og 24 timer efter modtagelse af væv fra operationsstuen. Salg

Resultater Salg

Lignende mængder tumor blev implanteret i hver mus. Ved afslutningen af ​​eksperimentet blev ingen signifikant forskel ses i gennemsnitlige tumorvægt mellem medier og saltvand opbevaringsbetingelser for UW-SCC34 eller UW-SCC52 (p = 0.650 og p = 0,177, henholdsvis). Ingen forskel i forekomsten tumordannelse blev set på baggrund af tid fra høst til implantation (≥13 af 16 tumorer voksede på hvert tidspunkt). Histologisk analyse viste stor lighed med den oprindelige tumor over alle grupper. Tumorer udviklet på både Time 0 og 24 timer for UW-SCC63 og UW-SCC64.

Konklusioner

Vi viste, at hverken lagermedium eller tid fra tumorexcision implantation (op til 48 timer) påvirket levedygtighed eller histologisk differentiering i en efterfølgende passage for to HNC PDXs. Desuden afslørede vi, at frisk patient væv er levedygtig op til 24 timer efter resektion. Denne information er vigtig, da det gælder for udvikling og deling af PDXs

Henvisning:. Stein AP, Saha S, Liu CZ, Hartig GK, Lambert PF, Kimple RJ (2014) Indflydelse af Håndtering adgang til oprettelse og Formering af hoved- og halscancer Patient Afledt Xenografter. PLoS ONE 9 (6): e100995. doi: 10,1371 /journal.pone.0100995

Redaktør: Jay F. Dorsey, University of Pennsylvania, USA

Modtaget: Marts 24, 2014 Accepteret: Juni 2, 2014, Udgivet: 26 jun 2014

Copyright: © 2014 Stein et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af R00 CA160639 (RK), UWCCC og UWCCC /MIR /WID institutionelle tilskud (PL), og en UW ICTR- Shapiro stipendium (AS). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Et veletableret men nu genopståede model for human cancer er patienten afledt xenograft (PDX) system. PDXs er udviklet ved at opnå tumorprøver direkte fra patienter og efterfølgende implantere og passage disse tumorer i immunsvækkede mus [1]. Fremgangsmåden blev først dokumenteret i 1969, da Rygaard og Povlsen injiceret en tumor cellesuspension fra en patient med tyktarmskræft subkutant i athymiske nøgne mus og kontrolmus [2]. De viste større tumorvækst i athymiske mus sammenlignet med kontrol, hvilket fører til anvendelse af immunsvækkede mus ved at blive almindelig praksis for PDX udvikling [3]. For nylig er PDXs blevet genereret for en række cancersygdomme, herunder pankreatisk [4] – [6], bryst [7], lunge [8], [9], renal [10] og hoved og hals [1], [11] . Disse undersøgelser viste, at PDXs bevarer karakteristika den primære tumor tværs serielle passager både på histologiske [7], [8] og molekylære [1], [7], [11] niveauer. Daniel et al. viste også, at deres primære småcellet lungecancer PDX (kun passeret i mus) bibeholdt større lighed til patientens tumor i sammenligning med en cellelinje genereret fra samme PDX [9]. Desuden er vores gruppe [1] og andre [12] har med succes kryopræserverede og genoplivet PDXs på et senere tidspunkt, hvilket øger anvendeligheden af ​​denne model system. Således PDXs repræsenterer en valideret og pålidelig model til at studere en lang række menneskelige kræftformer.

En stærk brug for PDXs er test af standard og nye behandlinger i en

in vivo

systemet med større heterogenitet end gensplejsede musemodeller og en mere relevant tumormikromiljøet end cellelinier [1], [4], [11]. Når de er etableret, PDXs forstærkes

in vivo

, injiceret i mange mus, og musene efterfølgende stratificeret i forskellige behandlingsgrupper. Kapaciteten af ​​et specifikt behandlingsregime at bremse eller standse tumorvækst kan vurderes ved at sammenligne den gennemsnitlige tumorvækst over tid for hver gruppe sammenlignet med kontrol (ubehandlede) mus. På denne måde kan undersøgere evaluere virkningen af ​​mange alternative terapier på én specifik tumortype afledt af en enkelt patient. Derudover kan molekylære ændringer induceret af de forskellige behandlinger analyseres ved høst efter behandlingen tumorprøver enten ved flash frysning tumor bidder i flydende nitrogen i genomet brede undersøgelser eller befæstelse tumorer i formalin efterfulgt af paraffin indlejring for biomarkør analyse. Det er også blevet fremført, at denne model system kunne anvendes i personlig kræftbehandling ved at generere PDXs fra en patients kræft, teste en række forskellige kemoterapeutika på mus, der bærer deres tumor og derefter vælge en ny behandling regimen for patienten baseret på disse

in vivo

resultater [13].

Der er en række af variationer i de procedurer, der anvendes til at etablere PDXs. For eksempel har nogle grupper beskriver kirurgisk implantation af små (2-3 mm) tumor bidder i flankerne [14], mens andre hakkekød tumorerne at skabe en cellesuspension og sprøjt suspensionen subkutant gennem en stor gauge nål [15]. Desuden visse grupper kun bruge atymiske nøgne mus [3], andre bruger ikke-overvægtige diabetiske svær kombineret immundefekt (NOD-SCID) mus [7], og nogle beskæftiger begge stammer [1]. Betydeligt har disse forskellige teknikker alt ført til vellykket tumorvækst. Et andet tilbagevendende tema, der opstår i PDX udvikling er, at tumorer træffes så hurtigt som muligt (højst inden for 3 timer) fra tidspunktet for biopsi og derefter injiceret i immunsvækkede mus [1], [2], [8], [10 ], [16]. Vores gruppe og andre anvende denne fremgangsmåde på grund af den tro, at tiden fra tumorexcision til xenograft implantation er vigtig. Men der er ingen oplysninger i litteraturen tyder på, at tumor bidder skal injiceres /implanteres så hurtigt som muligt ind i mus [17]. Hertil kommer, mens mus-til-mus passage er typisk så hurtigt som muligt, er der igen, få data til at understøtte nødvendigheden af ​​denne praksis.

På grund af usikkerhed om optimale høst og implantation teknikker, vi påtog denne undersøgelse for at afgøre, om der var en sammenhæng i vækstpotentiale PDX baseret på tidsforsinkelsen fra første tumorexcision til dens endelige implantation i mus. Desuden har vi forsøgt at bestemme, om lagermediet anvendes ved behandling forsinkelse påvirkede PDX levedygtighed. Dette arbejde er vigtigt, da der er en række faktorer uden for forskerens kontrol, der kan påvirke evnen til at opnå tumor biopsier fra samtykke patienter i tide. Desuden, når PDXs er etableret, re-implantation kræver adgang til modtagende mus og deres udbredelse til andre laboratorier kan kræve forsendelse. Begge disse problemer kan føre til forsinkelser i re-implantation. Vores resultater viser tumoren stadig er levedygtig og i stand til at vokse i den næste generation af mus op til mindst 48 timer efter den oprindelige tumor excision og at arten af ​​opbevaringsopløsningen, det være sig vævskulturmedium eller saltvandsopløsning, har ingen virkning på tumorvækst. Desuden afslørede vi, at frisk patient væv fra operationsstuen (OR) er levedygtig og kan bruges til at etablere en ny PDX op til mindst 24 timer efter indledende udskæring fra patienten. Evnen til at forsinke tumor implantation har vigtige implikationer med hensyn til deling af disse ressourcer samt logistikken i indledende PDX etablering og efterfølgende vedligeholdelse.

Materialer og Metoder

Mus

Seks til otte uger gamle mandlige og kvindelige NOD-SCID gamma (NSG, NOD.Cg-

Prkdc

SCID Il2rg

tm1Wjl

/SzJ) mus (købt hos Jackson Laboratories) blev anvendt til PDX udvikling og amplifikation. Alle mus blev holdt i Foreningen for Vurdering og akkreditering af Laboratory Animal Care-godkendt Wisconsin Institute for Medical Research (WIMR) Animal Care Facility. Dyrene blev opstaldet i SPF værelser, og de boede i autoklaveres, aseptiske og microisolator bure med et maksimum på fire dyr pr bur. Mad og vand blev leveret ad libitum. Alle undersøgelser af musene blev udført i overensstemmelse med et dyr protokol godkendt af University of Wisconsin (Protokol nummer: M02518). Under forsøgene blev hver mus vægt og klinisk sundhed vurderes på en ugentlig basis.

Tidligere Etableret Patient Afledt Xenografter

Vores PDXs blev afledt fra patienter med nyligt diagnosticeret eller tilbagevendende hoved- og halscancer ( HNC) der gennemført en skriftlig tilladelse i overensstemmelse med en IRB godkendelse fra University of Wisconsin. Vi har tidligere beskrevet etableringen af ​​vores PDX model mere detaljeret [1]. Som tumorprøver fra OR giver ofte kun nok væv til implantering i to til fire mus, anvendt hovedundersøgelserne beskrevet i dette manuskript etableret PDXs på et tidligt passage. Passage og implantation af PDXs blev opnået ved først at høste tumorer fra NSG mus med tumor af interesse, overføre tumor i en steril måde til en 2,0 ml Eppendorf-rør med en 01:01 blanding af medier (Dulbeccos Modified Eagle Medium med 10% føtalt bovint serum, 1% penicillin /streptomycin, og 2,5 ug /ml amphotericin B) og matrigel (katalog # 354.230, BD Biosciences, Inc) og hakning tumoren i mindre end 1 mm

3 stk. Endelig blev tumoren suspension trukket ind i en 1 ml sprøjte gennem en 18-gauge kanyle og injiceres subkutant i to flanker på NSG mus.

Eksperimentel Design

To PDXs der demonstrerede vedvarende vækst i begyndelsen af passager (UW-SCC34 og UW-SCC52) blev udvalgt til dette eksperiment. Processen blev udført separat for de UW-SCC34 og UW-SCC52 grupper, men en identisk protokol blev fulgt begge gange. Først blev fire NSG mus bærende to tumorer hver af PDX af interesse aflivet, og en timer blev startet når døden blev bekræftet. Alle tumorer blev høstet fra fire mus på samme tid. Puljede tumor bidder blev vejet og fordelt ligeligt på tværs fjorten 2,0 ml eppendorfrør pre aircondition på is: syv indeholder medier og syv med saltvand. Endvidere blev en tumor chunk (benævnt pre-implantation prøve) fikseret i 10% neutral bufret formalin i 48 timer og paraffinindlejret til senere histologisk analyse. Dernæst blev et medie + tumor rør og en saltvand + tumor rør fjernet fra isen. Hver tumor chunk blev overført til sin egen, nyt rør med en 01:01 blanding af frisk medium og matrigel, hakket i 1 mm

3 stykker, og injiceret i fire flankerne af to NSG mus (n = 8). Den tid blev registreret, efter at alle fire mus blev injiceret (Time 0, 40 minutter). På denne måde endte vi med to grupper på dette tidspunkt: “Time 0 medier” og “Time 0 Saline”. Begge grupper blev sammensat af to NSG mus hver med fire injektionssteder. Således hver gruppe havde potentiale til at udvikle otte tumorer (figur 1). Denne proces blev gentaget ved 1, 2, 4, 8, 24 og 48 timer efter timeren blev startet. I mellemtiden blev tumorer i medierne eller saltvand opretholdt ved 4 ° C.

Flow diagram, som viser forsøgsopstillingen.

Tumorer fik lov til at vokse i 3 uger for UW- SCC34 og 6 uger for UW-SCC52. Varigheden af ​​tumorvækst blev dikteret af tumorvækst kinetik og sundheden for mus. Ved slutningen af ​​hvert forsøg blev tumorer fra hver mus høstet, vejet og fotograferet (høstede tumorer 1 og 2 dage senere for de 24 timers og 48 timers grupper, henholdsvis). Hver tumor blev fikseret i 10% neutral bufret formalin i 48 timer og derefter paraffinindstøbte. En tumor blev tilfældigt udvalgt fra hver af de fjorten grupper for yderligere histologisk analyse

Histologi

tumorblokke blev snittet (5 um) og hematoxylin og eosin (H 5% -15%) og nekrose /cystisk ændring (interval 5% -15%). Repræsentative billeder fra de farvede objektglas er vist i figur 4. Dernæst blev UW-SCC52 præ-implantation tumor evalueret og havde moderat differentiering, ingen keratinisering, 20% nekrose /cystisk ændringer og en infiltrativ mønster (tabel 3). Igen, det histologi af tumorerne fra den næste passage (alle tidspunkter og begge lagermedier) var helt ens med hver viser moderat differentiering, ingen keratinisering, nogle nekrose /cystisk ændring (området 5% -25%) og en infiltrativ fænotype . Således histologisk vi har vist, at den samme tumor udviklet uafhængigt af tid eller medium til lagring af både UW-SCC34 og UW-SCC52

Repræsentative billeder fra H . E farvede objektglas for hver gruppe i UW- SCC34 og UW-SCC52 eksperimenter. Vejviser

Effekt af time om nye PDX Etablering

Vi undersøgte, om en 24 timers forsinkelse i implantation tid (tumor gemt i medier ved 4 ° C i løbet af forsinkelse) havde nogen virkning på PDX virksomhed for tre nye HNC PDXs (UW-SCC63, UW-SCC64, UW-SCC65). Omtrent lige store tumorvolumener blev injiceret i de to mus ved tid 0 og 24 timer for hver af de tre PDXs. For UW-SCC63 de præ-implantation tumor vægte var 0,0694 g og 0,0723 g, mens de præ-implantation vægte var meget lavere for UW-SCC64 (0,0115 g og 0,0117 g) og UW-SCC65 (0,0085 g og 0,0093 g).

Ni uger efter indledende implantation, de mus, der bærer hver ny PDX blev vurderet for tumorvækst. Kun mus med UW-SCC64 PDX haft tilstrækkelig tumor volumen for passage. Derfor blev disse mus aflivet, og alle tumorer blev individuelt fotograferet og vejet (figur 5A og 5B). Den gennemsnitlige vægt for den tid 0 tumorerne var 0,104 g (SD 0,156 g) og efter 24 timer var gennemsnittet 0,060 g (SD 0,137 g). Der var ingen statistisk signifikant forskel mellem de gennemsnitlige vægte tumor mellem disse to grupper (p = 0,564). Desuden var der en tilsvarende antal tumorer, der opstod i hver af de to grupper. Fire af otte tumorer voksede ved tid 0 og tre af otte udviklet i 24-timers gruppen. For UW-SCC63, var der tre tydelige tumorer i Time 0-gruppen og to i 24 timer kohorte. På den anden side, har UW-SCC65 ikke påvise nogen palpable tumorer i nogen af ​​grupperne. Samlet set ser det ud i de PDXs der var i stand til at etablere sig, har 24 timers forsinkelse ikke påvirke PDX levedygtighed. Interessant, har præ-implantation tumor vægt ikke ud til at have en vigtig effekt på efterfølgende tumorvækst siden UW-SCC64 tumorer (som demonstrerede den største vækst) havde ca. seks gange mindre tumor implanteret oprindeligt i forhold til UW-SCC63.

(A) Fotografier af alle tumorer høstet ved slutningen af ​​forsøget for UW-SCC64. (B) Bar grafer, der afbilder de gennemsnitlige tumor vægte for Time 0 og 24 timers grupper i UW-SCC64 eksperiment.

Diskussion

PDXs udgør en vigtig og valideret model for undersøgelse af talrige forskellige cancer undertyper, især i retssagen af ​​nye standarder og kemoterapeutika. Fordi patient væv er kostbar og ofte vanskeligt at opnå, skal efterforskerne tage stor omhu for at optimere denne model system. Derfor ønskede vi at yderligere at udforske de potentielle grænser for PDX passage ved at teste de hypoteser, 1) gang fra tumorexcision til ultimativ implantation i ny NSG mus er vigtig, og 2) lagermedium har en effekt på PDX levedygtighed og vækst. Overraskende fandt vi, at hverken lagermediet (medier eller saltvand) eller tid oplagringssted (op til 48 timer ved 4 ° C) påvirkede PDX vækst og etablering i et efterfølgende passage. Desuden afslørede vi at forsinke implantation af frisk patient væv op til 24 timer (tumor opbevaret i iskold medier under forsinkelse) ikke påvirkede indledende PDX etablering.

For fuldt ud at forstå vigtigheden og nødvendigheden af ​​PDXs i inden for kræftforskning, er det værdifuldt at vurdere andre tilgængelige modeller sammen med deres styrker og faldgruber. For det første har cellelinjer spillet en vigtig rolle i historien om onkologisk forskning og lægemiddelopdagelse. HeLa-celler udgør de første humane cancerceller dyrket i laboratoriet, og analyser af disse celler og andre cellelinjer, der fulgte har givet meget af vores nuværende molekylær forståelse af cancer [19]. Desuden standard prækliniske proces for at undersøge nye kemoterapeutika af National Cancer Institute (NCI) begynder med vurdering af

in vitro

aktivitet i 60 etablerede cancer cellelinier (NIC-60) efterfulgt af

in vivo

vurdering af disse cellelinier i mus gennem både hulfiberassay og xenografter [20], [21]. For nylig er gyldigheden af ​​at udnytte cellelinier som surrogater for den primære tumor er blevet sat spørgsmålstegn [22]. Gillet et al. demonstreret ved genetisk analyser, ingen sammenhæng eksisterede mellem patient tumorer og etablerede cancer cellelinjer, og faktisk de cellelinjer bar større lighed med hinanden end til kliniske prøver [23]. Yderligere grupper har også afsløret vigtigste forskelle mellem primære tumorer og afledte cellelinjer [24]. Men efterforskerne også bemærke, at der stadig findes betydelige pathway ændringer i disse tumorceller [25]. På trods forskelle med hensyn til den primære tumor, genetiske udtryk profiler kan anvendes til at vælge cellelinjer til specifikke analyser [26] – [28]

På grund af den voksende bekymring over repræsentativitet cellelinier til. den primære cancer, der er behov for yderligere modeller til at supplere dette arbejde. Transgene musemodeller repræsenterer et andet særskilt system, som er blevet anvendt i kræftforskning. Disse modeller er oftest bruges til at vurdere virkningen af ​​relevante onkogene mutationer til tumorigenese og terapeutisk respons for en lang række menneskelige kræftformer, herunder pancreas duktalt adenokarcinom [29], [30], bløddelssarkom [31], lunge adenocarcinom [32] , HNC [33] og mange andre. Omfanget af spørgsmål, der kan undersøges ved transgene mus er ganske bredt som eksemplificeret ved tidligere undersøgelser på transgene mus, som udtrykker human papillomavirus (HPV) onkogener, hvor interaktioner mellem disse specifikke onkogener med fanconis anæmi mangel gener [34], østrogen og livmoderhalskræft progression [35], og oncoproteinaktivitet ekspression i forhold til lymfocyttrafik [36] er blevet belyst. Alt i alt kan transgene mus forskning giver unik indsigt i mekanismerne for kræftfremkaldende mutationer og potentielle terapeutiske interventioner. Men disse modeller tendens, til at have stærke kørsel onkogen mutationer og andre meget specifikke genetiske ændringer, der kan begrænse omfanget af deres anvendelighed til klinisk onkologi.

For PDX-modellen, hver patients kræft er unik og repræsenterer utallige genetiske ændringer der periodiseres over tid kræft udvikles. Disse celler er ikke med vilje transformeret eller tvunget til at overudtrykke specifikke proteiner som cellelinjer og transgene musemodeller, hhv. Ideelt betyder PDXs bør mere ligner den primære tumor. Som beskrevet i indledningen, har mange grupper valideret anvendeligheden af ​​dette system, herunder evnen til PDXs at rekapitulere den metastatiske potentiale af den primære tumor [7], [37]. Vigtigere, Tentler et al. nylig revideret translationel track record for PDXs i onkologi lægemiddeludvikling for en bred vifte af kræftformer, og fremtiden for PDXs i udviklingen af ​​forudsigende biomarkører for kliniske forsøg vises lovende [17].

PDXs kan sprøjtes ind mus i enten en orthotopisk eller heterotopisk måde [17]. De PDXs, vi har genereret, anvendt og beskrevet i hele dette papir blev implanteret i en heterotopisk mode siden HNCs blev dyrket subkutant i musene. Andre grupper studerer pancreas [4], [6], lunge [9], [10], og renal [10] cancere har også anvendt subkutan tumorimplantation for deres arbejde. Subkutane tumorer give mulighed for lettere adgang for størrelse målinger af calipre under kliniske studier. Desuden kan tumorer dyrkes til en meget større volumen subkutant sammenlignet med ortotopisk steder før at skade de mus. På denne måde subkutane tumorer mulighed for større forstærkning af denne værdifulde væv, som derefter kan høstes til histologisk samt molekylære analyser og til passage til nye mus. Orthotopisk implantation, hvorved tumorceller injiceres på stedet for oprindelse, repræsentere en anden levedygtig måde at udbrede og studere PDXs. Denne teknik er blevet beskrevet for bryst- [7], hjerne [38], og HNCs [37], [39]. Det menes, at denne model giver tumorer at udvikle sig i en mere repræsentativ mikromiljø [39]. Faktisk dette system er specielt nyttigt til undersøgelse metastase [7], [37]. Men især for hoved og hals region, kun små tumorvolumener kan genereres, før at skade de mus. Qiu et al. dokumenteret, at efter to uger mus med orale PDXs kræves modificerede diæter grund svært ved at spise [37]. På grund af disse små tumorstørrelser, er det vanskeligt at udbrede HNC PDXs dyrket orthotopisk.