PLoS ONE: M867, en roman selektiv inhibitor af caspase-3 Forbedrer celledød og Udvider tumorvækstforsinkelse i bestrålede Lung Cancer Modeller

Abstrakt

Baggrund

Lungekræft er stadig den hyppigste årsag til kræft død på verdensplan. Radioresistance af lungekræft celler resulterer i uacceptable sats på loco-regional fiasko. Selvom stråling er kendt for at inducere apoptose, viste vores nylige undersøgelse, knockdown af pro-apoptotiske proteiner Bak og Bax resulterede i en stigning i autophagic celledød og lungekræft radiosensitivitet

in vitro

. For yderligere at undersøge potentialet i apoptose hæmning som en måde at bevidstgøre lungekræft for terapi, testede vi M867, en ny kemisk og reversibel caspase-3-inhibitor, i kombination med ioniserende stråling

in vivo

i vitro

.

Metoder og Resultater

M867 reducerede klonogen overlevelse i H460 lungekræft celler (dER = 1,27, p = 0,007) sammenlignet med de bærerbehandlede behandlede celler. Vi fandt, at administrationen af ​​M867 med ioniserende stråling i en

in vivo

mus bagben lungekræft model var veltolereret, og produceret en betydelig forsinkelse tumor vækst i forhold til stråling alene. Et dramatisk fald i tumorvaskulatur blev observeret med M867 og stråling ved hjælp von Willebrand-faktor-farvning. Desuden Ki67 indeks viste 5-fold reduktion af tumor proliferation i kombinationsbehandling gruppe på trods af de reducerede niveauer af apoptose observeret med terminal deoxynukleotidyltransferase-medieret dUTP nick-endemærkning farvning. Strålingssensibiliserende effekt af M867 gennem hæmmende caspaser valideret

hjælp

caspase-3 /-7 double-knockout (DKO) mus embryonale fibroblaster (MEF) celle model. I overensstemmelse med vores tidligere undersøgelse, autofagi bidraget til mekanismen for øget celledød, efter inhibering af apoptose. Desuden viste matrigel assay et fald i

in vitro

endotel tubulusdannelse under M867 /strålebehandling kombinationsbehandling.

Konklusioner

M867 øger cytotoksiske virkninger af stråling på lunge kræft og dens kar både

in vitro

in vivo

. M867 har potentiale til at forlænge tumorvækstforsinkelse ved at hæmme tumor proliferation. Kliniske forsøg er nødvendige for at bestemme potentialet i denne kombinationsbehandling hos patienter med lokalt fremskreden lungekræft

Henvisning:. Kim KW, Moretti L, Lu B (2008) M867, en roman selektiv inhibitor af caspase-3 Forbedrer celledød og Udvider tumorvækstforsinkelse i bestrålede Lung Cancer Models. PLoS ONE 3 (5): e2275. doi: 10,1371 /journal.pone.0002275

Redaktør: Mark R. Cookson, National Institutes of Health, USA

Modtaget: Februar 5, 2008; Accepteret: 17. april 2008. I Udgivet: 28. maj 2008

Copyright: © 2008 Kim et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde understøttes delvist af det amerikanske National Cancer Institute (NCI) Tilskud 1R01 CA125842-01A1. De finansieringskilder havde ingen rolle i udformningen og gennemførelse af undersøgelsen, i dataindsamling, analyse og fortolkning, og beslutning om at offentliggøre, revision, godkendelse, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklærede, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

Lungekræft er den mest udbredte kræft på verdensplan, og den hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på trods af multi-modalitet terapi, hvilket resulterer i 160,390 estimerede dødsfald i USA i 2007 [1]. Da tumor modstand grænser effektiviteten af ​​nuværende behandlinger [2], [3], [4], såsom strålebehandling, identifikation af nye terapeutiske strategier er afgørende for at forbedre resultatet. De forskellige celledødsprocesser involveret i cancerbehandling, har apoptose været den mest godt undersøgt [5]. Under apoptose, de store mediatorer af cellulære ødelæggelse er effektorer caspase-3 og -7, medlemmer af cystein aspartatproteaser familie, som spalter proteiner efter en aspartatrest [6]. Selvom stråling er kendt for at inducere apoptose, men det udgør en mindre del af celledød i bestrålede faste tumorer [7], og vores seneste undersøgelse viste, at knockdown af pro-apoptotiske proteiner Bak og Bax resulterede i en stigning i lungekræft radiosensitivitet

In vitro

[8]. Autophagy, en ikke-apoptotisk celledød type, blev vist at bidrage til mekanismen for øget celledød.

autofagi er en evolutionært bevaret proces og en overlevelse mekanisme til genvinding af langlivede organeller og proteiner [ ,,,0],9], [10]. Autophagy fungerer også som et selvmord vej med komplet selv-fordøjelse under overdreven stress betingelser [11], [12], der er klassificeret som programmeret celledød Type 2 [9], [10]. Under autophagy, organel nedbrydning sker ved dannelse af cytoplasmatiske dobbelt-membran vakuoler, kaldet autophagosomes med intakte kerner [13]. Autophagy forordning har været stigende interesse på grund af dens konsekvenser i tumorigenese. Desuden kan forlænget autofagi føre til kræft celledød, hvilket fører til den hypotese, at autophagy kan udnyttes som en kræftbehandling mål [14], [15], [16], [17].

For yderligere undersøge potentialet i apoptose hæmning som en måde at bevidstgøre lungekræft for terapi, vi testede M867, en ny kemisk og reversibel caspase-3-inhibitor [18], i kombination med ioniserende stråling

in vivo

in vitro

.

Materialer og metoder

Cell kultur

primære muse embryonale fibroblaster (MEF’er) blev afledt af vildtype (WT) og Caspase3

– /- /7

– /- dobbelt knockout (DKO) mus og udødeliggjort af transfektion med et plasmid indeholdende SV40-T-antigen (leveret af Dr. Richard Flavell, Yale University, New Haven, CT). MEF’er blev dyrket i DMEM (Invitrogen Corporation) suppleret med 10% føtalt bovint (FBS), 1% penicillin-streptomycin og 0,5 pmol /l 2-mercaptoethanol. H460 lungecancerceller blev dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen, Grand Island, NY) suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin ved 37 ° C og befugtet 5% CO2. HUVEC’er blev fremskaffet fra Clonetics og blev opretholdt i EBM-2 medium suppleret med EGM-2 mV enkelt portioner (BioWhittaker). M867 blev opnået fra Merck Co, Inc.

Klonogen Assay

H460 lunge kræftceller blev behandlet med DMSO eller M867 (1,4 nM, 5nM, og 10 nM for 24 timer); WT MEF’er celler og caspase 3/7 DKO MEF’er celler blev behandlet med DMSO eller M867 (5nM og 10 nM i 24 timer); og MEF’er celler blev behandlet med siRNA’er mod caspase-3 og-7, siRNA’er mod Beclin-1 og ATG5, eller kontrol. Celler blev derefter bestrålet med fra 0 til 6 Gy som angivet ved en dosishastighed på 1,8 Gy /min, ved hjælp af en

137 Cs strålerøret (J.L. Shepherd og Asssociates, Glendale, CA). Efter bestråling blev cellerne inkuberet ved 37 ° C i 8-10 dage. Celler blev fikseret i 15 minutter med 3: 1 methanol: eddikesyre og farvet i 15 minutter med 0,5% krystalviolet (Sigma) i methanol. Efter farvning blev kolonier talt under anvendelse af en afskæring på 50 levedygtige celler. Overlevende fraktion blev beregnet som (middel kimtal) /(celler podet) × (plating effektivitet (PE)), hvor PE blev defineret som (middel kimtal) /(celler podet for ikke-bestrålede kontroller). DER blev beregnet som den dosis (Gy) for stråling alene divideret med dosis (Gy) for stråling plus M867 (normaliseret til M867 toksicitet) er nødvendige for en overlevende brøkdel af 0,25. Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer og betyde, SD, og ​​P-værdier blev beregnet.

immunblotting

Celler (0,5 x 10

6) blev behandlet med forskellige Gy og narkotika. De blev opsamlet på forskellige tidspunkter, og derefter blev vasket med iskoldt PBS to gange før tilsætning af lysepuffer (20 mM Tris-HCI, pH 7,4, 150 mM NaCl, 20 mM EDTA, 1% NP40, 50 mM NaF, 1 mM Na3Vo4, 1 mM NaMO4 og cocktail inhibitor (Sigma, 5 pi /ml). Proteinkoncentration blev kvantificeret ved Bio-Rad-metoden. Lige store mængder protein blev fyldt i hver brønd og separeret ved 12,5% SDS-PAGE-gel, efterfulgt af overførsel til PVDF-membraner ( . BIO-RAD) Membraner blev blokeret ved anvendelse 5% fedtfri tørmælk i PBS-T i 1 time ved stuetemperatur blottene blev derefter inkuberet med Caspase-3 (cellesignalering). Caspase-7 (cellesignalering); LC-3 (Medical Biologisk Laboratories Co. LTD) Akt, phospho-Akt (Ser-473), S6 ribosomale protein, og phospho-S6 ribosomale protein (Ser-240/244) (Cell Signaling) og Actin antistoffer til 1 time ved 4 . ° C Goat anti-kanin IgG sekundære (1: 5000, Santa Cruse Biotechnologies).. blev inkuberet i 45 minutter ved stuetemperatur Immunoblots blev udviklet ved anvendelse af kemiluminescens påvisningssystem (PerkinElmer) i henhold til producentens protokol og autoradiografi

Måling af apoptose

Celler (2,5 × 10

5) blev udpladet i 10mm retter for hvert datapunkt. Efter 24 timer på 37 ° C inkubation blev H460-celler behandlet med M867 (100 nM i 2 timer) og straks bestrålet med 5Gy, 10Gy eller 20Gy, og WT og Caspase3

– /- /7

– /- DKO celler blev bestrålet med 5Gy eller 10Gy. Efter 24, blev celler behandlet med 1 ml Accutase (holde alle flydende celler) for 4min og derefter talt for hver prøve. Cellerne blev centrifugeret og resuspenderet i 1 × Binding Buffer ved en koncentration på ~ 1 x 10

6 celler /ml. 100 pi af opløsningen (~ 1 x 10

5 celler) blev overført i 5 ml FACS rør, tilsat 1,2 pi Annexin V FITC og 1,2 pi PI. Efter inkubation i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke 400 pi 1 × bindingsbuffer blev tilsat til hvert rør. Hastigheden af ​​apoptose blev målt under anvendelse af Annexin V-fluoresceinisothiocyanat apoptose afsløring kit I (Pharmingen) med flowcytometri.

Autophagy Assay

MEF’er Celler blev transficeret med 2,5 ug af GFP-LC3 ekspression plasmid (gave fra Dr. Norboru Mizushima) [19] ved hjælp af lipofectamin-reagens (Invitrogen Life Technologies). Efter 24, blev celler behandlet med 5Gy af stråling, med eller uden dosis M867. Efter 24 timer og 48 timer blev fluorescensen af ​​GFP-LC3 observeret ved hjælp konfokal fluoroskopi.

siRNA transfektion

siRNA’er mod mus caspase-3 og-7, blev Beclin og kontrol siRNA indkøbt fra Santa Cruz Bioteknologi. siRNA ATG5 (mus) blev syntetiseret ved Dharmacon Research. Sense- og antisense-strenge af ATG5 blev påbegyndt ved nukleotid, 5′-AACUUGCUUUACUCUCUCAUCAUU-3 ‘(sense) og 3′-UUUUGAACGAAAUGAGAGAUAGU-5’. (Antisense) Celler blev transficeret med 25 nM siRNA’er under anvendelse af lipofectamin 2000. De transficerede celler blev anvendt til eksperimenter 24h senere

endotelcelle Morphorgenesis assay:. Tubulusdannelse

HUVEC’er dyrket til -70% konfluens blev behandlet med 5nM M867, 3Gy eller kombinationsbehandling. Celler blev derefter trypsiniseret og talt. De blev podet ved 48000 per brønd på 24-brønds plader coatet med 300 pi Matrigel (BD Biosciences). Disse celler undergår differentiering til kapilllærlignende rørstrukturer periodisk observeret ved mikroskopi. 24h senere blev celler farvet med hematoxylin og eosin (H barer, SD (

P

= 0,007). Vist er middelværdien +/- standardafvigelsen af ​​tre separate gentagne forsøg. (B) Annexin-V-assay, der viser niveauet af apoptose i H460-celler behandlet med enten kontrol, 100 nM af M867 i 2 timer, stråling (5, 10 eller 20 Gy), og begge modalitet. Dette blev udført tre gange og gennemsnittet af de tre tællinger blev beregnet. Kolonner, gennemsnit; barer, SD.

Kombineret M867 /strålebehandling forlænger tumorvækst forsinkelse og er veltolereret i lunge xenograft model

Efter at have fastslået effektiviteten

in vitro

for M867-induceret strålingssensibilisering af lungekræft celler, blev en mus bagben xenograftmodel genereret til at udforske stråling svar fra M867

in vivo

. H460 lungecancerceller blev injiceret subkutant i atymiske nøgne mus, og tumorer fik lov til at vokse i cirka 7 dage til frembringelse af en gennemsnitlig tumorvolumen af ​​0,25 cm

3 før behandling. De behandlingsgrupper bestod af en kontrol køretøj, M867, køretøj plus stråling, og kombinationen af ​​M867 plus stråling. M867 blev administreret dagligt ved 2 mg /kg intraperitoneal injektion i 7 på hinanden følgende dage. Bagben H460 tumortransplantater i mus blev behandlet som beskrevet i afsnittet Materialer og Fremgangsmåder. Vækstforsinkelse blev beregnet som antallet af dage, der kræves for at nå et tumorvolumen på 2 cm

3 for behandlingsgrupper i forhold til kontrol tumorer. Som vist i figur 2A, blev en betydelig forsinkelse af tumorvækst ses med kombinationsterapi med M867 og stråling sammenlignet med bestråling alene (26 vs 20 dage p 0,005), og M867 alene havde også signifikant påvirke tumorvækst sammenlignet med kontrol (~ 4 dage forsinkelse, p = 0,003). Dette antyder, at M867 kunne øge tumorrespons i kombination med strålebehandling. Desuden blev ændringerne i kropsvægt også spores i de mus for at vurdere, om behandling med M867, stråling eller kombinationsbehandling gav systemisk toksicitet (figur 2B). Kun minimal vægttab blev set ved 10 dage efter den kombinerede M867 og strålebehandling. Ændringer i kropsvægt efter denne periode afspejles tumorvækst. Som forventet kombinationsbehandlingen gruppen, som havde den mest langvarige tumorvækstforsinkelse, havde den mindste stigning i kropsvægt.

H460 lungecancerceller var xenotransplanteret subkutant i athymiske mus. Efter 6-8 dage blev musene behandlet dagligt i 7 dage, med vehikelkontrol, M867 (2 mg /kg), og derefter blev behandlet 1 time efter lægemiddelbehandling med 2 Gy stråling, dagligt over 5 dage i træk. Tumor blev udskåret når nået størrelse på cirka 2,5-3,0 cm

3 og tumorvækstforsinkelse som defineret af det antal dage, der kræves for at nå et tumorvolumen på 2 cm

3 blev målt. (A) Tumorer blev målt regelmæssigt og forsinkelse vækst blev beregnet for behandlingsgrupper i forhold til at kontrollere tumorer. Den kombinerede bi-modalitet terapi inducerede en markant tumorvækst forsinkelse sammenlignet med stråling alene (26 vs 20 dage, s 0,005). (B) Kropsvægt blev målt hver 5 dage og kropsvægt forholdet blev beregnet i forhold til baseline måling.

M867 reducerer tumor spredning indeks trods markant fald i apoptose i bestrålede H460 mus xenograft

for at bestemme den mekanisme, der bidrager til tumorvækstforsinkelse efter kombinationsterapien blev Ki67 proliferative indeks undersøgt ved hjælp af faste H460 tumorsnit i alle behandlingsgrupper. Som vist i figur 3A, M867 plus stråling kombination behandling resulterede i en 6-fold (15% vs. 92%, p 0,001) og 2 gange (15% vs. 33%, p 0,001) reduktion i prolifererende celler sammenlignet med kontrol og stråling alene grupper henholdsvis. Vi vurderede næste apoptose niveauer i faste H460 tumor sektioner ved hjælp TUNEL farvning. Som vist i figur 3B ved hjælp TUNEL-farvning, kombineret M867 og strålebehandling resulterede i to tredjedele reduktion i apoptose (4,5% vs. 15%, p 0,008)., Sammenlignet med stråling alene

Histologiske snit blev opnået fra de tumorer i mus i hver behandlingsgruppe fra tumorvolumen undersøgelse. Antallet af positive celler blev scoret og plottes ved midling tre gentagne evalueringer. (A) Gennemsnitlig Ki67 proliferative indeks af hver behandlingsgruppe blev bestemt ved procent af Ki67-positive celler pr mikroskopisk felt. Dette blev gentaget tre gange. Kolonner, betyder; barer, SD. (B) TUNEL-farvning blev også udført på tumorsnit, og apoptotisk indeks blev tilsvarende beregnet ved procent af positive TUNEL farvede celler pr mikroskopisk felt. Kolonne, betyder; barer, SD.

M867 reducerer vaskulær tæthed i bestrålet lunge tumor model og sensibiliserer HUVEC’er for stråling

Da tumorvaskulatur er et mål for kræftbehandling, mus blev behandlet på samme måde som dem, der i tumor vækst forsinkelse undersøgelse og faste lunge tumor sektioner blev brugt til at bestemme virkningerne af M867 og stråling på tumorvaskulatur

in vivo

. Slides fra hver behandlingsgruppe blev analyseret efter von Willebrand Faktor (vWF) farvning for vaskulær densitet undersøgelse, som vist i figur 4A. Antallet af fartøjer pr mikroskopisk felt blev derefter bestemt for hver behandlingsgruppe. Kombinationsbehandling af M867 og stråling (1,3; SD = 0,57) resulterede i en dramatisk 5 gange reduktion i det gennemsnitlige antal fartøjer pr mikroskopisk felt i sammenligning med kontrol (6; SD = 1; p 0,002) og en ~2- fold reduktion i forhold til strålebehandling alene (2,3; SD = 0,57; p 0,007). (Figur 4A)

(A) Histologiske snit blev opnået fra tumorer i mus i hver behandlingsgruppe fra

in vivo

tumor volumen undersøgelse, og farves for blodkar ved hjælp af et antistof til vWF. Blodkar blev kvantificeret ved tilfældigt at udvælge 400 × felter og tælle antallet af blodkar per felt. Dette blev udført tre gange og gennemsnittet af de tre tællinger blev beregnet. Kolonner, gennemsnit; barer, SD. (B) Human navlestrengsveneendotelceller (HUVEC’er) blev behandlet med 5 nM M867 og derefter straks bestrålet med enten 0 eller 3 Gy. Seks timer senere blev cellerne trypsiniseret og genudpladet på 24-brønds plader coatet med Matrigel. Efter 24 timer blev celler fikseret og farvet med H barer, SD.

For yderligere at undersøge virkningerne af M867 og stråling på dannelse af blodkar, blev humane navleveneendotelceller (HUVEC’er), der anvendes til at undersøge tubuli formation til angiogene funktion

in vitro

. Den endotelcelle morfogenese assay blev udført for at undersøge evnen hos behandlede HUVEC’er at producere kapilllærlignende rørformede strukturer. Et repræsentativt billede og det gennemsnitlige antal optalte rør i tre separate (x100) felter er vist i figur 4B og C hhv. Behandling med M867 kombineres til stråling signifikant nedsat tubulusdannelse sammenlignet med stråling alene (5,7 vs 1,7, p 0,001). Ingen kontrol behandling havde 13 tubuli (SD = 1,0) pr mikroskopisk felt og M867 alene havde 9 tubuli (SD = 1,0), hvilket antyder en anti-angiogen effekt af M867 foruden til radio-sensibilisering.

Caspase 3 /7-mangel fremmer stråling følsomhed ved autophagy induktion, i mangel af apoptose

for at validere, om hæmning af caspaser bidraget til at øge strålebehandling blev caspase-3/7 mangelfuld (DKO) MEF celler anvendes. Disse celler er i stand til at undergå apoptose, eftersom de mangler caspaser 3/7, hvorimod WT MEF’er kan (figur 5A og 5B). Som vist i figur 5C, WT MEF’er behandlet med M867 var mere følsomme for stråling sammenlignet med WT MEF’er behandlet med DMSO (DER = 1,2 for 5nM M867, p = 0,017, og DER = 1,62 for 10 nM M867, p = 0,001). Der var ingen signifikant forskel i overlevelse blandt caspase DKO MEF’er behandlet med noget dosis af M867 i sammenligning med DMSO. Desuden WT MEF’er celler transficeret med caspase-3/7 siRNA’er også fremlagt betydelig stigning i strålefølsomhed, hvilket antyder, at disse resultater ikke skyldes klonal variation af disse celler (data ikke vist). Baseret på vores tidligere undersøgelse, vi hypotesen, at øget stråling følsomhed i caspase DKO celler kan skyldes alternativ programmeret celledød, såsom autofagi [8]. For at teste denne hypotese blev WT og caspase 3/7 DKO-celler transficeret med GFP-LC3 plasmid. Celler med punktformig GFP signalering blev talt som autophagic celler på grund af den karakteristiske lysosomale lokalisering af LC3 proteinet under autofagi [19]. Efter WT og caspase DKO celler blev udsat for 5Gy af stråling, blev procentdelen af ​​celler med GFP punctates steg ca. 3 gange i bestrålede caspase DKO-celler, sammenlignet med bestrålede WT-celler (30% vs 10%, henholdsvis) (figur 6A ). Ved 48 timer post-stråling, procentdelen af ​​autophagic celler steg til ~55% i caspase DKO celler sammenlignet med 15% i WT kontrol. Disse resultater blev også bekræftet ved at vurdere niveauet af forarbejdet LC3 protein, hvori caspase DKO-celler viste øget niveauer af LC3-I og II-proteiner efter bestråling, i sammenligning med WT-celler (figur 6B). Fordi mTOR pathway er kendt for at regulere initiering af autofagi, undersøgte vi Akt /mTOR signalering ved bestemmelse af niveauerne af phospho-Akt og phospho-S6 i de bestrålede WT og caspase DKO MEF-celler. Som vist i figur 6C, blev phospho-proteiner øges i de bestrålede WT celler, hvorimod de blev reduceret i det bestrålede caspase DKO MEF-celler. Disse data antyder, at pro-autophagic signalering opreguleres i de bestrålede caspase DKO-celler.

(A) WT og caspase 3/7 DKO MEF’er blev inkuberet med Annexin V-fluoresceinisothiocyanat og propidiumiodid 24 timer efter bestråling og analyseret ved FACScan. Data er vist som middelværdien af ​​tre eksperimenter S.D. (B) Caspase spaltning blev bestemt ved immunoblotting af spaltet caspase-3 efter WT eller Caspase 3/7 DKO MEF-celler blev behandlet med 0, 2,5, 5, 7,5 og 10 Gy. Cellerne blev høstet efter 24. (C) radiosensibilisering af WT eller caspase 3/7 DKO MEF’er. Cellerne blev bestrålet med de angivne doser af stråling og behandlet med DMSO kontrol eller M867 (dosisinterval fra 5 til 10 nM, for 24 timer). Efter 10 dage blev kolonier farves og afsluttet. Rapporterede værdier er gennemsnit ± standardafvigelse. af tre separate gentagne forsøg.

(A) GFP-LC3-transficerede WT eller Caspase 3/7 DKO MEF-celler blev behandlet med og uden 5 Gy og derefter undersøgt ved fluorescensmikroskopi efter 24 timer. Procentdelen af ​​celler med punktformig GFP-LC3 fluorescens blev beregnet i forhold til alle GFP-positive celler. Fejlsøjler er vist som middelværdi S.D. (B) LC-I og -II ekspression blev bestemt ved Western blot under anvendelse af lysater fra WT og caspase 3/7 DKO MEF celler behandlet med 0 eller 5 Gy efter 24, 48 timer. Actin blev probet for at demonstrere lig belastning. (C) er også vist immunblots af phospho-Akt og p-S6 vha lysaterne fra WT og caspase 3/7 DKO MEF celler behandlet med 0 eller 5 Gy efter 30 min. (D) WT og Caspase 3/7 DKO MEF-celler blev transficeret med enten kontrol siRNA eller 25 nM siRNA’er rettet mod ATG5 og Beclin-1 eller (E) transficeret med vektor eller ATG5 og Beclin-1 cDNA indeholdende plasmider. De blev derefter bestrålet med fra 0 til 6 Gy. Efter 8 dage blev kolonier farves og scorede. De viste værdier er gennemsnit ± standardafvigelse. af tre separate gentagne forsøg.

Autophagy ændrer stråling følsomhed i caspase 3/7 mangelfulde celler

For at afgøre, om autofagi er den mekanisme for videregående radiosensitivitet observeret i caspase DKO celler, udtryk af ATG-5 og Beclin-1, to essentielle autofagi proteiner [21], [22], [23], blev slået ned i vild type og caspase DKO celler. Tidligere undersøgelser har vist, at siRNA mod Beclin-1 og ATG-5 specifikt nedreguleret endogent protein ekspression [8]. Som vist i figur 6D, behandling af caspase DKO celler med siRNA’er rettet mod ATG-5 og Beclin-1 afskaffer sensibiliserende virkning af caspase-3/7 deletion og forårsagede signifikant stigning i klonogenisk celleoverlevelse sammenlignet med kontroldyr siRNA behandling af caspase DKO celler (DER = 1,34, p = 0,008). Omvendt overekspression af Beclin-1 og ATG-5 i caspase DKO celler forårsagede signifikant stigning i klonogenisk celledød under stigende strålingsdosis sammenlignet med Beclin-1 og ATG-5 overekspression i WT-celler (DER = 1,32, p = 0,008) ( Figur 6E). Sammen disse resultater viser, at øget radiosensitivitet i caspase DKO celler er afhængig af de vigtigste autofagi molekyler.

Diskussion

I denne rapport, først viste vi, at M867 behandling resulterede i den effektive strålingssensibilisering af lunge kræftceller

in vitro

. De potentielle terapeutiske virkninger ved M867 blev derefter vist i et

in vivo

mus bagben tumor model. Yderligere in vitro eksperimenter viste, at caspase-3/7-null MEF celler, var mere følsomme over for de cytotoksiske virkninger af stråling, primært som følge af øget autofagi. Denne undersøgelse antyder også, at M867 virkninger på vaskulaturen kan bidrage til den observerede stigning i lunge tumorvækstforsinkelse som reaktion på stråling.

Samtidig kemostråleterapi er en grundpille i behandling af fremskreden lungecancer, men prognosen for disse patienter forbliver globalt fattige. Derfor er der behov hidtil ukendte strategier til at forbedre den nuværende behandling effektivitet ved målretning af ikke-apoptotisk celledød siden apoptose er begrænset efter konventionel terapi. For nylig har der været en stor vægt på autophagy som en kræftbehandling mål, dels drevet af observationer, der kræftmidler induceret autophagy, såsom i bestrålede cancerceller [17], [24]. Vi viste for nylig, at autofagi kan udløses ved at inhibere mammalian target eller rapamycin (mTOR) pathway [17] eller ved at inhibere pro-apoptotiske proteiner Bak /Bax kan forbedre strålingsvirkninger

in vitro

[8]. Et meget attraktivt mål i apoptotiske vej er caspase-3, som har en central rolle i apoptose som den dominerende effektor caspase involveret i den proteolytiske spaltning af proteinsubstrater herunder cytoskeletale proteiner, kinaser og DNA-reparationsenzymer. I denne undersøgelse, analyserede vi de potentielle virkninger af caspase-3 hæmning på lungekræft reaktion på stråling ved hjælp af romanen hæmmer M867. Vi viste, at administration af M867 i kombination med ioniserende stråling faldt drastisk overlevelse H460 lungecancer-celler (figur 1), på en dosis-afhængig måde. Notatet observerede vi øget cytotoksicitet ved en koncentration højere end 10 nM i vores klonogene assay. Alligevel er det blevet vist, at M867 er en potent og reversibel caspase-3 inhibitor (IC

50 på 0,0001 uM), og en mindre potent caspase-7-inhibitor (IC

50 af 0,036 pM) [18]. Desuden fandt vi, at den strålingssensibiliserende virkning M867 er afhængig af caspase-3 og -7, hvilket fremgår af fraværet af dens indvirkning på caspase 3/7 DKO celler.