PLoS ONE: komplementære roller i Cancer Prevention: Protease Inhibitor Gør Cancer Forebyggende Peptide Lunasin Biotilgængeligt

Abstrakt

Baggrund

Den lavere forekomst af brystkræft blandt asiatiske kvinder sammenlignet med vestlige lande er delvist tilskrives soja i den asiatiske kost, hvilket fører til bestræbelserne på at identificere de bioaktive komponenter, der er ansvarlige. Soy Bowman Birk Inhibitor koncentrat (BBIC) er en kendt kræft forebyggende middel nu i humane kliniske forsøg.

Metodologi /vigtigste resultater

Formålet med dette arbejde er at etablere tilstedeværelse og afgrænse i vitro-aktiviteten af ​​lunasin og BBI findes i BBIC, og studere deres biotilgængelighed efter oral indgivelse til mus og rotter. Vi rapporterer, at lunasin og BBI er de to vigtigste bioaktive ingredienser i BBIC baseret på hæmning af foci dannelse, lunasin være mere effektiv end BBI på en ækvimolær basis. BBI og soja Kunitz Trypsin Inhibitor beskytte lunasin fra

in vitro

fordøjelse med pancreatin. Oral administration af

3H-mærket lunasin med lunasin-beriget soja resulterer i 30% af peptidet nå målvæv i en intakt og bioaktive formular. I en xenograft model af nøgne mus transplanteret med human brystcancer MDA-MB-231-celler, intraperitoneale injektioner af lunasin, ved 20 mg /kg og 4 mg /kg legemsvægt, fald tumorincidensen med 49% og 33%, sammenlignet med den vehikel-behandlede gruppe. I modsætning hertil injektion med BBI ved 20 mg /kg legemsvægt viser ingen effekt på tumorincidens. Tumor generation reduceres betydeligt med de to doser af lunasin, mens BBI er ineffektiv. Lunasin hæmmer celledeling og inducerer celledød i brystet tumor sektioner.

Konklusioner /Betydning

Vi konkluderer, at lunasin er faktisk det bioaktive kræft forebyggende middel i BBIC, og BBI blot beskytter lunasin fra fordøjelse når sojabønner og andre frø fødevarer bliver spist af mennesker

Henvisning:. Hsieh CC, Hernández-Ledesma B, Jeong HJ, Park JH, de Lumen BO (2010) komplementære roller i Cancer Prevention: Protease Inhibitor Gør Cancer Forebyggende Peptide Lunasin Biotilgængeligt. PLoS ONE 5 (1): e8890. doi: 10,1371 /journal.pone.0008890

Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada, Canada

Modtaget: November 12, 2009; Accepteret: 16. december 2009; Udgivet: 26 Jan 2010

Copyright: © 2010 Hsieh et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Projektnummer 05B087 udstedt af amerikanske Institute for Cancer Research (https://www.aicr.org/site/PageServer). Projektnummer W81XWH-04-1-0128 tildelt af det amerikanske forsvarsministerium Congressionally Directed Medical Research Program (https://cdmrp.org). Projekt LUNAMICE 039.241 tildelt af Europa-Kommissionen og den spanske National Research Council for Marie-Curie postdoc-stipendium af BHL. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. BODL er medstifter af FilGen BioSciences, Inc ,. som har eksklusiv licens til at kommercialisere lunasin teknologi omfattet af patenter ejet af University of California Berkeley. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere (https://www.plosone.org/static/policies.action#sharing).

Introduktion

Brystkræft er den mest almindelige ondartet svulst blandt kvinder og de førende dødsårsager af kvinder i vestlige lande [1]. I modsætning hertil brystkræft incidens i de fleste asiatiske lande er ca. 10% for den almindelige befolkning i USA og Europa [2]. Af alle miljømæssige faktorer vides at påvirke brystcancer, forekommer kost til at være en af ​​de mest betydningsfulde. Asiatiske kostvaner er rig på soja, der indeholder faktorer, der har vist sig at give vigtige beskyttelse mod initiering, promotion og /eller progression af brystkræft i dyremodeller [3]. I 1980 Troll og medarbejdere foreslået den mulighed, at sojaprotein kan have en rolle i forebyggelsen af ​​brystkræft hos bestrålede rotter [4]. Dyreforsøg udført i det sidste årti har bekræftet brystkræft forebyggende rolle sojaprotein [2], [3]. Navnlig bioaktive peptider isoleret fra sojabønner, såsom lunasin og Bowman-Birk-proteasehæmmer (BBI) bliver nu intensivt undersøgt som cancer kemoforebyggende midler.

Lunasin er et nyt peptid indledningsvist identificeret i sojabønne [5] og efterfølgende isoleret i hvede, byg og andre frø [6] – [9]. Det er en 43-aminosyre peptid, som virkning er påvist i pattedyrceller mod kemiske carcinogener og virale onkogener [10], [11]. Den første musemodel bekræftede kemoforebyggende aktivitet af lunasin mod hudkræft induceres af en kemisk carcinogen [10]. Disse resultater antyder, at lunasin kan udøve en lovende rolle som forebyggende middel mod andre typer cancer, såsom brystcancer.

BBI er et polypeptid på 71 aminosyrer med evnen til at inhibere serinproteaserne trypsin og chymotrypsin. Den trypsininhibitorisk site af BBI er blevet forbundet med negative følger for biotilgængelighed af kosten proteiner, hvorimod chymotrypsin websted er blevet impliceret i cancer kemoforebyggende virkninger [12], [13]. Den høje pris på BBIs rensningsprocessen har nødvendiggjort anvendelse af en uren form af BBI kaldet BBI-koncentrat (BBIC), som er blevet rapporteret at udøve kemoforebyggende aktivitet mod forskellige typer af kræft fremkaldt af kemiske carcinogener og stråling [14]. Disse undersøgelser, at BBI er hovedkomponenten ansvarlig for BBIC s ​​kemoforebyggende aktivitet, uden at vurdere bidraget fra andre peptider, der er indeholdt i BBIC på kræft forebyggende aktivitet.

Oral administration er blevet anerkendt som en plausibel og omkostningseffektiv tilgang til at nedbringe kræft sygelighed og dødelighed ved at hæmme forstadier begivenheder før forekomsten af ​​klinisk sygdom [15]. Da lunasin- og BBI er peptider, er det afgørende at fastslå, om de, når oralt indtaget, overlever fordøjelsen og få absorberes, når målet væv og organer i en intakt og bioaktive tilstand. Park og kolleger udført

in vitro

undersøgelser, der påviser rolle BBI i beskyttelsen lunasin fra fordøjelse når sojaprotein blev oralt forbrugt [16]. Men der er ingen

in vivo

studier der undersøger den rolle, BBI beskytte lunasin fra fordøjelsen i mave-tarmkanalen af ​​dyr.

Formålet med dette arbejde er at vurdere tilstedeværelsen og

in vitro

aktivitet af lunasin og BBI indeholdt i BBIC og undersøge deres biotilgængelighed efter oral indgivelse til mus og rotter. En xenograft brystkræft musemodel blev valgt til at afgrænse og evaluere

in vivo

de kemoforebyggende egenskaber lunasin- og BBI separat og at belyse carcinogenesen involverede veje i brystkræft, der er berørt af disse peptider.

Resultater

lunasin Er en Bioaktive ingrediens af BBIC

for at bestemme sammensætningen af ​​BBIC blev dette præparat underkastet SDS-PAGE og Western blot for at identificere lunasin- og BBI. Resultaterne viser, at begge peptider er til stede i BBIC ved koncentrationer på 360 og 74,4 ng /ug protein, henholdsvis (figur 1A). De to udgør ca. 44% af totalt protein af BBIC, hvilket indikerer, at andre proteiner er til stede og kan bidrage til de egenskaber, som tillægges dette præparat

A:. Western-blot af BBIC anvendelse af antistoffer specifikke for BBI og lunasin . (1) Marker, (2) 6,25 ug protein, (3) 12 ug protein, (4) 25 ug protein, (5) Standard BBI (3 ug) eller standard lunasin (200 ng). B: Foci-dannelse inhiberende aktivitet i DMBA-inducerede NIH3T3-celler. (A) Vehikelbehandlede celler (b) positiv kontrol eller DMBA-behandlede celler, (c) BBIC (100 nM lunasin 1160 nM BBI), (d) BBI (100 nM) fra BBIC, (e) Lunasin (100 nM ) fra BBIC, (f) Standard BBI (100 nM), (g) Syntetisk lunasin (100 nM). Barer med forskellige bogstav betegnelser er statistisk signifikant forskellige fra hinanden (

P

0,05, n = 6)

Foci dannelse hæmmende aktivitet af BBIC indeholdende 1160 nM BBI. og 100 nM lunasin blev analyseret. BBIC undertrykt foci formation med 80% i 7,12-dimethylbenz [a] anthracen (DMBA) -induceret NIH3T3 celler, sammenlignet med bærerbehandlede celler (Figur 1B-C). Lunasin og BBI blev individuelt oprenset fra BBIC og deres aktiviteter analyseret. 100 nM af ren lunasin isoleret fra BBIC reducerede foci-dannelse med 73% (figur 1B-E), som er identisk med den observeret med 100 nM syntetisk lunasin (Figur 1B-G). Pure BBI isoleret fra BBIC ved en koncentration på 100 nM falder foci-dannelse med 60% (figur 1B-D). Således lunasin var mere effektivt end BBI med 18% på en ækvimolær basis, men BBI har også en kemoforebyggende virkning af sine egne, sandsynligvis på grund af hæmning af proteolytiske processer involveret i carcinogenese.

Soy proteasehæmmere Protect Lunasin fra

In vitro

Fordøjelse

for at fastslå hvilken rolle de forskellige proteaseinhibitorer indeholdt i sojabønne, såsom BBI og Kunitz Trypsin Inhibitor (KTI) blev syntetisk lunasin underkastet en

in vitro

fordøjelse proces med pancreatin. Lunasin blev inkuberet med dette præparat i fravær og tilstedeværelse af BBI og KTI og evalueret af vestlige-Blot. De mønster viser (figur 2), at begge proteasehæmmere beskytter lunasin fra fordøjelsen, selv efter at være denatureret ved varmebehandling. Cirka 93% og 97% af lunasin forbliver intakte efter fordøjelsesprocessen i nærvær af ukogt BBI og KTI hhv. Lignende procentdele af lunasin (98% og 84%) forblev intakt, når dette peptid blev inkuberet med pancreatin i nærvær af kogt BBI og KTI hhv. Lunasin modstår varmebehandling [17], og er til stede i forskellige forarbejdede sojabønner produkter, der også indeholder BBI [18]. Alle disse resultater viser, at lunasin ville være biotilgængeligt efter indtagelse af disse produkter på grund af den beskyttende rolle af BBI og andre soja proteasehæmmere.

De øvre, lettere bånd er Coomassie Blue protein pletter og de lavere, mørkere ringe er Western blots. (M) Markers, (1) Lunasin (600 ng) + pancreatin (600 ng) inkuberet i 0 timer ved 37 ° C, (2) Lunasin (600 ng) + pancreatin (600 ng) inkuberet i 1 time ved 37 ° C , (3) Lunasin (600 ng) + BBI (18.000 ng, ukogt) + pancreatin (600 ng) inkuberet i 1 time ved 37 ° C, (4). Lunasin (600 ng) + KTI (18.000 ng, ukogt) + pancreatin (600 ng) inkuberet i 1 time ved 37 ° C, (5) lunasin (600 ng) + BBI (18.000 ng, kogt) + pancreatin (600 ng) inkuberet i 1 time ved 37 ° C, (6) Lunasin (600 ng) + KTI (18.000 ng, kogt) + pancreatin (600 ng) inkuberet i 1 time ved 37 ° C, (7) BBI (ukogt), (8 ) KTI (ukogt).

lunasin Er Biotilgængeligt Når administreres oralt til mus og rotter

Mus og rotter blev brugt til at bestemme, om mundtligt indtages lunasin overlever fordøjelsen, ender i væv og forbliver intakt og bioaktive som målt ved en

in vivo

assay. I det første sæt eksperimenter, modtog CD-1-mus

3H-mærket syntetisk lunasin blandet med lunasin-beriget soja (LES) ved tvangsfodring. Lunasin absorberes og fordeles i diverse indsamlede væv, herunder dem, der er mål for de mest almindelige cancerformer, såsom lunge-, mælkekirtlen og prostata (figur 3A). Det er bemærkelsesværdigt, at lunasin er i stand til at krydse blod-hjerne-barrieren, nå hjernen. Ved 3 timer efter sondeernæring, er ca. 30% af den totale orale dosis af lunasin optages (fig S1)

A:. Fordeling af

3H-lunasin aktivitet i forskellige væv og gastrointestinale indhold mus efter () 3 H, () 6 H, () 9 H, () 12 timer og () 24 timer ved oral administration af LES. Fejlsøjler vist for 3H-resultater. B: Foci-dannelse inhiberende aktivitet i DMBA-inducerede NIH3T3-celler. (A) Vehikelbehandlede celler, (b) DMBA-behandlede celler, (c) syntetisk lunasin, (d) lunasin ekstraheret fra lever fra rotter fodret kontroldiæten, (e) lunasin ekstraheret fra lever fra rotter fodret LES kost. Barer med forskellige bogstav betegnelser er statistisk signifikant forskellige fra hinanden (

P

0,05, n = 6).

Siden

3H-radioaktivitet ville ikke viser den molekylære størrelse og bioaktivitet af lunasin i vævene blev rotter fodret kosten LES i 4 uger blev blod og lever opsamlet og lunasin blev ekstraheret, oprenset og analyseret ved Western-blot. Lunasin er til stede i blodet hos LES-rotter som en monomer i en koncentration på 17,5 ng /ml. Men lunasin isoleret fra leveren af ​​LES-fodret rotter eksisterer som en dimer i en koncentration på 3,1 ug /g lever (figur S2). Lunasin (1 uM) ekstraheret fra leveren af ​​LES-fodret rotter undertrykker foci formation så effektivt som en ækvimolær mængde syntetisk lunasin (figur 3B). I modsætning hertil kontrol protein band udvundet fra LES-unfed rotter er ineffektiv i at undertrykke foci formation.

Lunasin Reducerer Tumor Forekomst og Generation

For at undersøge

in vivo

effekt af lunasin og BBI i brystcancerceller blev MDA-MB-231-celler implanteret subkutant i nøgne mus efter 2 måneders intraperitoneal (ip) injektion af lunasin og BBI. Ingen signifikante forskelle i kropsvægt blev observeret blandt de fire grupper (figur 4A), hvilket antyder, at lunasin eller BBI behandlinger har ingen bivirkninger på den almene helbredstilstand. Disse resultater er i overensstemmelse med undersøgelser foretaget af Johnson og medarbejdere [19] som rapporterede ingen signifikante effekter på kropsvægt efter daglig gavage af BBIC (500~2000 mg /kg /dag) i seks måneder

A.: kropsvægt af mus behandlet med (♦) PBS (kontrol), (□) 20 mg BBI /kg legemsvægt, (▴) 20 mg lunasin /kg legemsvægt, og (x) 4 mg lunasin /kg legemsvægt, og injiceret med 1 × 10

7 MDA-MB-231 celler i flanken af ​​15 uger gamle nøgne mus. Der blev ikke påvist signifikante forskelle blandt fire grupper. B: Tumorhyppigheden i mus behandlet med PBS, BBI og to doser af lunasin. Lunasin reducerede antallet af mus, der viste tumorer og forsinkede fremkomsten af ​​disse brysttumorer. C: Tumor generation i mus behandlet med PBS, BBI og to doser af lunasin. Lav dosis af lunasin (4 mg /kg legemsvægt) signifikant reduceret tumor generation sammenlignet med kontrolgruppen (*

P

= 0,029). Data er vist: middelværdi ± SEM (n = 8)

Brystkræft incidens af mus er vist i figur 4B.. På syv uger post-celler injektion, 75% og 88% af mus i kontrol og BBI-grupper, viste henholdsvis tumorer. I modsætning hertil tumorincidensen var 38% og 50% i mus behandlet med 20 mg /kg og 4 mg /kg lunasin hhv. , Sammenlignet med kontrollen, det tumorincidensen var således 49% og 33% lavere i lunasin-behandlede grupper hhv. I forhold til BBI gruppe, tumorincidensen var 57% lavere i 20 mg /kg og 43% lavere i 4 mg /kg lunasin- behandlede gruppe. Mus behandlet med lunasin viste også en forsinkelse i fremkomsten af ​​tumorer. Desuden tumor generation, blev reduceret i de to grupper af mus behandlet med lunasin, er væsentligt lavere i mus behandlet med den laveste dosis af lunasin, 70% og 69% lavere i forhold til kontrol og BBI gruppe henholdsvis (

P

= 0,029 vs kontrol) (figur 4C).

vækst sats og endelige størrelse af tumorerne forskelligt for de fire grupper. Væsentlige tumorer dukkede op i kontrolmus efter celler injektion henviser størrelserne af tumorer i mus behandlet med 20 mg /kg og 4 mg /kg lunasin blev nedsat med henholdsvis 23% og 34%, henholdsvis (figur 5A). Ved afslutningen af ​​eksperimentet, vægten af ​​tumorer var også lavere i mus behandlet med begge doser af lunasin sammenlignet med kontrol-gruppen (

P

= 0,2134, 0,1880, henholdsvis) og BBI-gruppe (

P

= 0,0909, 0,0569, henholdsvis) (figur 5B)

A:. Tumor volumen (mm

3) af brystkræft induceret ved administration af (♦) PBS (kontrol), ( □) 20 mg BBI /kg legemsvægt, (▴) 20 mg lunasin /kg legemsvægt og (x) 4 mg /kg af lunasin. B: brysttumorer vægt induceret af PBS (kontrol), 20 mg BBI /kg legemsvægt, 20 mg lunasin /kg legemsvægt (

P

= 0,2134 vs kontrolgruppen og 0,0909 vs BBI gruppe) og 4 mg lunasin /kg legemsvægt (

P

= 0,1880 vs kontrolgruppen og 0,0569 vs BBI-gruppe). Data er vist gennemsnit ± SEM (n = 8).

Palpable og ikke-palpable brysttumorer blev opsamlet og udsat for histologisk analyse og immunfarvning. Efter H *

P

= 0,0158 i lav lunasin gruppe). C: Procentdel af apoptotiske celler i tumorer fra mus målt med TUNEL-assayet. Farvning afslørede signifikant højere niveauer af apoptotiske tumorceller i lunasin grupper versus kontrolgruppen. (*

P

= 0,0088 i høj lunasin- gruppe; 0,0141 i lav lunasin gruppe). Data er vist gennemsnit ± SEM.

Diskussion

Den høje forekomst af brystkræft har givet en god grund til at identificere nye forbindelser til brug som forebyggende og /eller terapeutiske midler. Epidemiologiske undersøgelser, dyreforsøg og humane forsøg har vist tegn på, at folk indtager en soja-rig kost har lavere forekomst og dødelighed af brystkræft, hvilket fører til undersøgelser på forskellige forbindelser fra soja, som giver beskyttelse mod brystkræft [21], [22]. Daglig indtagelse af disse anticancerforbindelser kan sammenlignes med en forebyggende, ikke-toksisk version af kemoterapi, er uskadeligt for fysiologien af ​​normalt væv og stopper microtumours [23], [24]. For at vurdere de potentielle risici og fordele ved fytokemikalier for menneskers sundhed, forståelse af den fysiologiske adfærd af disse forbindelser efter oral indtagelse samt deres absorption, fordeling, metabolisme og udskillelse er nødvendig [15].

sojabønne BBIC er stort set et præparat indeholdende proteaseinhibitoren BBI, der er blevet anvendt til at demonstrere de kemoforebyggende egenskaber af dette peptid undgår de høje omkostninger ved dets oprensning. Flere undersøgelser har rapporteret den kemoforebyggende rolle BBIC mod forskellige former for kræft fremkaldt af kemiske kræftfremkaldende stoffer og stråling [14], [25]. Disse undersøgelser har antaget, at BBI er den vigtigste bioaktive forbindelse med ansvar for BBIC s ​​kemoforebyggende aktivitet, uden at vurdere bidraget fra andre mindre peptider. Vores resultater viser, at BBIC indeholder både lunasin og BBI repræsenterer 44% af det samlede proteinindhold.

in vitro

foci dannelse hæmmende aktivitet assay viser, at lunasin udøver 18% højere aktivitet i DMBA-inducerede NIH3T3 celler end BBI på en ækvimolær basis. Det er imidlertid klart, at de protease inhibitoriske aktiviteter af BBI og KTI er afgørende i at beskytte lunasin fra

in vitro

fordøjelse med pancreatin.

In vivo

eksperimenter, udført med mus og rotter fodret LES, har vist, at lunasin, oralt indtaget, modstår fordøjelsen, bliver absorberet og når målet væv og organer i en intakt og bioaktive tilstand. For nylig er det blevet påvist, at lunasin er biotilgængeligt i mennesker fodret sojaproteinprodukter, en vigtig forudsætning for dets anticancer potentiale [26]. Således er de beskyttende roller BBI og KTI og måske andre naturligt forekommende protease spille en vigtig rolle i at gøre lunasin findes i sojaprotein til at udøve sine kemoforebyggende egenskaber. Biotilgængelighed efter oral administration af en kemoforebyggende middel er afgørende for at forstå de forskellige

in vivo

mekanismer, der er ansvarlige for dens kræft forebyggende aktivitet [27].

For at afgrænse den enkelte

in vivo

forebyggende egenskaber mod brystkræft af lunasin og BBI blev hvert peptid injiceret separat i nøgne mus før og efter injektion af MDA-MB-231-celler. I vores undersøgelse blev en dosis af BBI og to doser af lunasin vurderet. Den lave dosis (4 mg /kg legemsvægt) af lunasin svarer til den daglige indtagelse af sojaprotein anses af FDA til at reducere kardiovaskulær sygdom, og også i overensstemmelse med resultaterne af vores nuværende undersøgelse, der viser, at 30% af indtaget lunasin når målet væv. Anvendelsen af ​​den højere dosis (20 mg /kg legemsvægt) er baseret på den opdagelse, at intraperitoneal administration af BBI ved denne dosis undertrykker effekt på 3-methylcholanthren-induceret lungetumorer i A /J-mus [28] betydeligt. Begge doser af disse peptider synes at være godt tolereret af musene som påvist ved mangel på ændring i legemsvægt i løbet af behandlingsperioden 15 ugers. Mus behandlet med lunasin show reduktion i brysttumor incidens og forsinkelse i fremkomsten af ​​tumorer. Tumor generation også signifikant hæmmet ved den lavere dosis af lunasin. Desuden er mængden og vægten af ​​tumorer genereret i lunasin-behandlede grupper lavere sammenlignet med kontrol og BBI-grupper. Ingen effekt på bryst tumor udvikling er observeret, når BBI blev anvendt i MDA-MB-231 xenograft mus.

For bedre at forstå de specifikke mekanismer, hvormed lunasin- udøver sine virkninger på MDA-MB-231 brysttumorer, biomarkører for celleproliferation og apoptose, der er gode indikatorer for tumorstørrelse i xenograft model blev evalueret [29], [30]. Histologisk farvning af snit opnået fra lunasin-behandlede tumorer viser, at tumordestruktion områder erstattes af apoptotiske og nekrotiske celler. Lunasin behandling resulterer også i en betydelig reduktion af celleproliferation og induktion af apoptose i MDA-MB-231 tumorer. Disse effekter er ikke observeret i tumorer fra BBI-behandlede mus.

kemopreventive egenskaber lunasin er blevet demonstreret

in vivo

i tidligere undersøgelser. I den første dyremodel, lunasin påført topisk på 250 mg /uge undertrykker hudpapillomer dannelse i Sencar mus behandlet med DMBA og tetradecanoylphorbol-13-acetat med 70% sammenlignet med kontrollen. Tumor mangfoldigheden er også reduceret, og udseendet forsinkes med 2 uger i mus behandlet med lunasin i forhold til kontrollen [10]. Dette er i overensstemmelse med en anden observation, at lunasin sinker epidermal celleproliferation i musehud i fravær og nærvær af DMBA anvendelse af en fremgangsmåde

2H

2O mærkning for at måle celleproliferation

in vivo

[31] . Alle disse støtter vores resultater, der lunasin fungerer som en kræft forebyggende middel

in vivo

.

Kennedy har vist, at BBI har betydelig kræft kemoforebyggende aktivitet i både

in vitro

in vivo

bioassay-systemer [25]. Selvom BBI har et bredt spektrum af kræft-beskyttende aktiviteter, dens virkninger på brystkræft fortsat begrænset. BBI er tidligere blevet analyseret for bioaktivitet mod andre typer cancer, såsom oral mucosa, colon og lunge cancer [28], [32], [33]. Dog ingen

in vivo

undersøgelser rapporterer effekten af ​​BBI som brystkræft forebyggende peptid er blevet offentliggjort. Alligevel er der nogle

in vitro Salg undersøgelser viser, at BBI faldt østrogenafhængig human brystcancer cellevækst [34] – [36]. Wan og medarbejdere [37] demonstrerede vækstinhiberende egenskaber af BBI i human prostatacancer-xenotransplantater i nøgne mus. Vores resultater ved hjælp af xenograft model, hvor lunasin og BBI blev vurderet separat viser, at BBI udviser meget lidt kemoforebyggende virkning mod brystkræft. er behov for flere undersøgelser for at bestemme, om tumor celletype og dens særlige carcinogenese veje kan være bestemmende for de kræft kemoforebyggende egenskaber BBI.

Sammenfattende vores resultater viser, at lunasin og BBI er de to vigtigste bioaktive ingredienser i BBIC . I foci-dannelse assay lunasin er omkring 18% mere effektiv end BBI.

in vivo

xenograft model viser imidlertid, at mens lunasin udviser betydelig kemoforebyggende og terapeutiske virkninger, BBI viser meget lidt. Vi foreslår, at for at forklare de observerede kemopræventive egenskaber af soja og andre frø indeholder lunasin, naturligt forekommende proteasehæmmere såsom BBI og KTI, primært beskytte lunasin fra fordøjelsen, hvilket gør det biotilgængelige. Dette tema af komplementaritet naturligt forekommende molekyler i at gennemføre sundhedsmæssige fordele for mennesker sandsynligvis ret almindelig i naturen og taler for at spise hele fødevarer snarere end isolerede komponenter.

Materialer og Metoder

Rensning af Lunasin og BBI fra BBIC

for at forberede BBIC blev 50 g fint formalede sojabønner ekstraheres med 1250 ml hexan ved 4 ° C i 24 timer, og derefter re-ekstraheres med 1250 ml 60% ethanol ved 55~ 60 ° C i 1 time. Efter ekstraktion blev opløsningens pH justeret til 5,3, og BBIC blev udfældet med 2500 ml acetone i 15 min. Bundfaldet blev opløst i 100 ml destilleret vand, dialyseret ved 4 ° C i 24 timer, og frysetørres.

Separation af lunasin og BBI fra BBIC blev udført ved ionbytningskromatografi. Søjlen (AG MP-1M, 5,0 x 50 cm, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) blev ækvilibreret med 0,1 M natriumphosphatpuffer saltvand (PBS, pH 7,0). Fem hundrede mg BBIC opløst i 0,1 M PBS blev påført i kolonnen og kromatografiske separationer blev udført med forskellige koncentrationer af NaCI i PBS ved 4 ° C ved en strømningshastighed på 30 ml /time. De forskellige opsamlede fraktioner blev underkastet Western-Blot for detektion af lunasin og BBI som tidligere beskrevet [8]. Kort fortalt blev SDS-PAGE udført under anvendelse 16.5% tris-tricingeler (Bio-Rad). Proteinerne blev transblottet på nitrocellulose-membran og blokeret i 5% fedtfri tørmælk opløses i Tris-bufret saltvand 1% Tween 20 (TBS-1T). Membranen blev vasket med TBS-1T og inkuberet med lunasin polyklonalt antistof (Zymed, Inc., South San Francisco, CA, USA), eller monoklonalt antistof BBI, venligst leveret af Dr. David Brandon (USDA, WRRL, Albany, CA, USA). Efter vask blev membranen inkuberet i 1 time med peberrodsperoxidase konjugeret sekundære antistoffer (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Membranen blev påvist under anvendelse detekteringsmidlet (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) og straks udviklet ved hjælp 667 Polaroid film. Intensiteten af ​​båndene blev kvantificeret ved hjælp af softwaren

Un-SCAN-IT gel

udgave 5.1 (Silk Scientific, Inc. Orem, UT, USA). Lunasin- og BBI indhold blev beregnet ved at sammenligne bandets intensiteter med de kendte standarder lunasin- og BBI køre under de samme betingelser.

Foci Formation Assay

foci dannelse assay blev udført i overensstemmelse med Reznikoff et al [38]. NIH3T3-celler blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC) og dyrket i RPMI 1640 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Celler blev udpladet ved en densitet på 500 celler /brønd i plader med 12 brønde, inkuberet natten over ved 37 ° C og behandlet med lunasin eller BBI i 4 timer. Derefter blev celler behandlet med 1,5 ug /ml DMBA i 20 timer. Efter vask med PBS, blev frisk medium tilsat. Peptider blev tilsat, og mediet blev ændret hver uge i 6 uger. Ved slutningen af ​​forsøget blev cellerne vasket med 0,9% NaCl, fikseret med methanol, farvet med Giemsa, og scoret for transformerede foci. Den negative kontrol var et sæt af celler, der får ingen DMBA, mens den positive kontrol bestod af celler induceret af DMBA men uden behandling.

In Vitro

In Vivo

Biotilgængelighed Undersøgelser

In vitro

fordøjelse af lunasin blev udført efter den metode, offentliggjort i United States Pharmacopeia [39]. Syntetisk lunasin (American Peptide Company, Inc. Sunnyvale, CA, USA) (5 ug) blev inkuberet med proteasehæmmere BBI eller KTI (Sigma, St. Louis, MO, USA) i 30 minutter ved 25 ° C. Pancreatin fra porcin pancreas (Sigma) blev tilsat (enzyme:protein forhold på 1:10) og opløsningen blev inkuberet ved 37 ° C i 1 time. Tris-tricin-prøvebuffer blev tilsat ved slutningen af ​​reaktionen og straks standses ved at anbringe rørene i et kogende vandbad i 5 minutter. De fordøjer blev analyseret ved SDS-PAGE og Western blot følge protokollen beskrevet tidligere.

Biotilgængelighed studier i mus blev udført på North View Pacific Laboratories (Hercules, CA, USA), ifølge med Animal Care og brug Udvalg (ACUC) menneskelige retningslinjer. CD-1-mus (3-5 uger gamle) blev erhvervet fra Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA) og konditioneres på AIN76A kost i en uge. Fyrre mus (20 mænd og 20 kvinder) blev fastet i 8 timer før oral indgivelse ved sondeernæring. Mus blev opdelt i to grupper, en kontrolgruppe, der modtager 240 mg LES formulering og en behandlingsgruppe modtog 240 mg LES formulering plus 8 uCi

3H-lunasin (SibTech, Inc. Brookfield, CT, USA) i 0,1 ml 10% saccharoseopløsning. Fire mus fra hver gruppe blev aflivet efter 3, 6, 9, 12 og 24 timer efter oral administration. Vævsprøverne blev opsamlet og gjort klar til scintillationstælling ved solubilisering i TS-2 væv solubiliseringsmiddel (Research Products International Corp., Chicago, IL, USA) og tilsætning af 15% benzoylperoxid.