PLoS ONE: Antistof Anerkendelse af kræft-relaterede Gangliosider og deres Efterligner Undersøgt Brug i silico site Mapping

Abstrakt

Modificerede gangliosider kan overudtrykt i visse former for kræft, og dermed er de betragtes som en værdifuld mål i kræft immunterapi. Strukturel viden om deres interaktion med antistoffer er i øjeblikket begrænset, på grund af den store størrelse og høj fleksibilitet af disse ligander. I denne undersøgelse anvender vores tidligere udviklede websted mapping teknik til at undersøge anerkendelse af kræftrelaterede gangliosider af anti-gangliosid-antistoffer. Resultaterne afslører en potentiel gangliosid-bindende motiv i de fire antistoffer undersøgt, hvilket antyder muligheden for strukturelt konvergens i anti-gangliosid immunrespons. Den strukturelle grundlag af anerkendelsen af ​​gangliosid-mimetiske peptider er også undersøgt ved hjælp af webstedet kortlægning og sammenlignet med gangliosid anerkendelse. Peptiderne vist at virke som strukturelle efterligninger af gangliosider ved at interagere med mange af de samme bindingssted rester som de beslægtede kulhydrat epitoper. Disse undersøgelser giver vigtige fingerpeg om, det strukturelle grundlag af immunologisk mimicry af kulhydrater

Henvisning:. Agostino M, Yuriev E, Ramsland PA (2012) Antistof Anerkendelse af kræft-relaterede Gangliosider og deres Efterligner Undersøgt Brug

i silico

site Mapping. PLoS ONE 7 (4): e35457. doi: 10,1371 /journal.pone.0035457

Redaktør: Bostjan Kobe, University of Queensland, Australien

Modtaget: Februar 6, 2012; Accepteret: 19 Marts 2012; Udgivet: 20. april, 2012 |

Copyright: © 2012 Agostino et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev understøttet af en lille bevilling fra det Farmaceutiske Fakultet og Farmaceutiske Fakultet, Monash University, til EY. MA er en modtager af Monash University Postgraduate publikation Award. PAR er Sir Zelman Cowen Senior Research Fellow (Sir Zelman Cowen Fellowship Fund, Burnet Institute). Forfatterne takker bidraget til dette arbejde af den victorianske Operationel Support Infrastructure Program modtaget af Burnet Institute. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Gangliosider er glycosphingolipider som byder en eller flere sialsyrerester. De er oftest forbundet med nervesystemet funktion, hvor de spiller en afgørende rolle i opretholdelsen af ​​stabiliteten af ​​myelin og axoner [1]. Ændringer i gangliosid ekspressionsniveauer har været forbundet med flere neurodegenerative tilstande, herunder Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom, Huntingtons sygdom og HIV-associeret demens [2]. Produktionen af ​​anti-gangliosid-antistoffer er en af ​​de vigtigste biokemiske funktioner i Guillain-Barré syndrom, en autoimmun neuropati [3]. Mens de specifikke årsag til syndromet er ukendt i de fleste tilfælde, er det almindeligt Forud infektion med

Campylobacter jejuni

[4], [5].

Gangliosider er blevet identificeret som tumor associeret carbonhydrat-antigener (TACAs), en gruppe, der omfatter Lewis Y, Lewis X, Thomsen-Friedenreich og Thomsen-nouvelle [6]. Gangliosiderne oftest findes i nervesystemet er GM1, GD1a, GD1b og GT1b [1], men gangliosiderne i betragtning til vaccine og antistof-baserede målretning er generelt biosyntetiske mellemprodukter med disse, såsom GM2, GM3, GD2 og GD3 [ ,,,0],7], [8], [9], [10] (figur 1). Mens der findes i små mængder i nervesystemet, forekommer de ofte i høje densiteter på en række tumorcelletyper [11], [12], [13]; de er således attraktive mål for cancerimmunterapi. Ud over disse, gangliosider ender i

N

-glycolylneuraminic acid (Neu5Gc), såsom

N

-glycolyl GM3 (Neu5Gc-GM3), er også anvendelige mål for kræftbehandling [14] , [15]. I modsætning

N

-acetylneuraminic syre, Neu5Gc ikke kan syntetiseres af mennesker, på grund af manglen på et funktionelt sialinsyre hydroxylase [16]. Fremkomsten af ​​Neu5Gc på humane celler menes at ske gennem enzymatisk inkorporering fra kosten [17]. Da Neu5Gc udtryk i høj grad er begrænset til kræftceller i mennesker, rettet Neu5Gc-afslutning gangliosiderne sandsynligvis opnå en meget selektiv terapeutisk resultat

CNS gangliosiderne:. A. GT1b. B. GD1a. C. GD1b. D. GM1. Cancerrelaterede gangliosider: E. GD2. F. GD3. G. GM3. H. Neu5Gc-GM3. Da hver struktur er differentieret ved fjernelse af en eller flere rester fra GT1b, glycosidbindingerne angivet på GT1b gælder for alle de strukturer, herunder Neu5Gc-GM3. Kulhydrat symboler følger nomenklatur konsortiet for Funktionelle Glycomics [63]:

N

-acetylneuraminic syre – lilla diamant; galactose – gul cirkel;

N

-acetylgalactosamine – gule firkant; glukose – blå cirkel;

N

-glycolylneuraminic syre -. Lyseblå diamant

Kulhydrater normalt betragtes T-celle-uafhængige antigener, typisk ikke er i stand til at fremkalde et stærkt immunrespons [18], [19]. En måde at løse dette problem er ved at udvikle kulhydrat mimetika, der er i stand til at inducere et anti-kulhydrat immunrespons. Peptider er blevet overvejet til dette formål over for en lang række mål [20]. Peptidefterligninger af GD2 [21], [22], [23] og GD3 [24], [25] gangliosider er identificeret, typisk ved fagvisning mod anti-gangliosid-antistoffer. Nogle af disse har vist sig at inducere anti-gangliosid-immunresponser [23], [25], [26]. Peptid efterligner af anti-Neu5Gc-GM3 antistoffer er i øjeblikket ikke kendt, men er blevet identificeret antiidiotypiske antistoffer mod disse antistoffer [27], [28].

Selvom tidligere strukturelle undersøgelser anerkendelse af gangliosider og deres efterligner af antistoffer er blevet udført [21], [29], [30], [31], disse har generelt udnyttet simple molekylære docking metoder. Vi har tidligere udviklet sitet mapping teknik, som vi har vist at være effektive til at studere kulhydrat-antistof [32], [33] og kulhydrat-lectin anerkendelse [34], samt peptid-antistof anerkendelse [35], [36 ], [37], [38]. Her, evaluerer vi en række molekylære docking programmer for deres evne til at forudsige de bindende former for sure sukkere til antistoffer og anvende vores hjemmeside mapping teknik til at studere antistof-genkendelse af sure sukkerarter (tabel 1). Den beregningsmæssige tilgang mest egnet til validering sager bliver så brugt til at undersøge anerkendelse af kulhydrat epitoper af gangliosider med fire anti-gangliosid antistoffer: R24, ME36.1, chP3 og 14F7 (tabel 2). Mens der er eksperimentelt løst native strukturer af alle antistoffer af interesse rådighed, strukturen af ​​et af disse antistoffer, chP3, mangler et kort segment af nøglen HCDR3 sløjfe. Vi har således udvidet sitet mapping teknik til at overveje flere protein konformere, i en proces betegnet “dynamisk websted mapping”. Endelig er det websted mapping teknik, der anvendes til at undersøge antistof anerkendelse af gangliosid-mimetiske peptider, der er i forhold til anerkendelse af kulhydrat determinanter for gangliosiderne.

Metoder

Validering og testsystemer

for metodevalidering, høj opløsning komplekser ( 2,5 Å) af de antichlamydial antistoffer S25-2, S73-2 og S25-39 med poly-Kdo (ketodeoxyoctulosonic syre) blev opnået antigener fra Protein data Bank (FBF) (tabel 1). De undersøgte testsystemer (anti-gangliosid antistoffer og deres ligander) er sammenfattet i tabel 2. Antistoffer blev nummereret og CDR defineret efter IMGT unikke nummersystem [39].

Molekylær docking

Glide 5.6 [40], [41], GOLD 4.1.1 [42], Autodock 4.2 [43] og DOCK 6.4 [44] blev evalueret for deres evne til at reproducere den krystallografiske bindende tilstand i hvert af valideringssystemer. De indstillinger, der bruges til disse programmer er beskrevet andetsteds [34], [45]. Kort fortalt blev liganderne behandles fleksibelt af hver docking program, med undtagelse af de pyranoseringe, som blev holdt i stol konformationer. I validering tilfælde, alle krystallografiske farvande og buffer molekyler samt ioner, blev fjernet fra strukturerne. Den Protein Forberedelse guiden i Maestro 9.2 [46] blev brugt til at tilføje hydrogenatomer og bestemme de mest sandsynlige protonering tilstande af titrerbare proteinrester i alle tilfælde.

site mapping

procedure Sitet Kortlægningen blev anvendt til testsystemet som tidligere beskrevet [32]. Kort fortalt interaktionerne finder sted i top 100 sorteret poses opnået fra molekylær docking optalt ifølge Proteinresterne hvormed de forekom og den type interaktion finder sted (dvs. hydrogenbinding eller van der Waals interaktion). De tallies normaliseres ved at dividere antallet af konstaterede interaktioner med en særlig rest med det samlede antal interaktioner observeret. Normalisering udføres separat for hydrogenbinding og van der Waals interaktioner. De normaliserede tallies sorteres fra størst til mindst bidrag, og den kumulative sum beregnes. Alle rester, som opstår over en given kumulativ sum cutoff anses vigtige for anerkendelse.

De målinger for reproduktion og korrekthed blev brugt i vurderingen af ​​oversigtskort kvalitet. Gengivelse er beregnet som antallet af krystallografiske interaktioner identificeret af oversigtskort divideret med antallet af krystallografiske interaktioner observeret. Korrekthed er beregnet som antallet af krystallografiske interaktioner identificeret af oversigtskort divideret med det samlede antal kortlagte interaktioner. Reproduktion og korrekte værdier tæt på én indikerer, at den genererede websted maps præcist at identificere de krystallografiske interaktioner, uden inddragelse af fejlagtige kontakter. Produktet af reproduktion og korrekthed blev brugt til at vurdere kvaliteten af ​​kortlægning; større værdier indikerer optimal reproduktion og korrekthed. Den kumulative sum cutoff blev optimeret til valideringssystemerne ved at vurdere den gennemsnitlige produkt af reproduktion og korrekthed på 10% cutoff intervaller fra 0-100%. Den cutoff som gav den største gennemsnitlige produkt til den serie af validering tilfælde (tabel 1) blev anvendt til at undersøge anerkendelse af gangliosiderne og gangliosid-mimetiske peptider af de udvalgte anti-gangliosid antistoffer (tabel 2).

Dynamisk websted mapping

Tre rester af HCDR3 loop mangler fra strukturen af ​​chP3 (FBF 3IU4) [30]. Den manglende del blev manuelt bygget, og lavenergi konformere af denne del, samt resten støder op til hver side af manglende del (dvs. i alt fem rester), blev dannet ved anvendelse af loop raffinement værktøjet i Prime [47]. Proceduren sitet mapping (se ovenfor) blev udført på de ti lavest energi konformere. Den mest sandsynlige konformer fra sættet blev valgt på grundlag af dens lighed med ensemblet gennemsnit af hydrogenbinding og Van der Waals site maps. De ensemble gennemsnitlige kort blev beregnet ved at tage gennemsnittet af interaktion bidrag hver kortlagt rest hele sæt af ti konformere. Ligheden af ​​hver konformer websted kort til ensemblet gennemsnit blev bestemt ved hjælp af følgende udtryk: hvor

en

er cutoff for udvælgelse af vigtige brint bonding kontakter (som en brøkdel),

b

er cutoff for udvælgelse af vigtige van der Waals kontakter (som en brøkdel),

r

2

HB

er korrelationskoefficienten beregnet mellem en bestemt konformer og ensemblet gennemsnit for brint bonding kontakter, og

r

2

VDW

er korrelationskoefficienten beregnet mellem en bestemt konformer og ensemblet gennemsnit for van der Waals kontakter. Den konformer udviser den højeste lighed med ensemblet gennemsnitlige maps blev valgt som den mest sandsynlige konformer.

Peptid mimicry af gangliosider

gangliosid-mimetiske peptider blev separeret i overlappende hexapeptid fragmenter og forankret til antistoffet mål ved hjælp af guld. Sitet kortlægningsteknik (se ovenfor) blev påført på de resulterende samlinger af udgør. De interaktion data for det sæt af hexapeptider blev samlet for at give et sæt af site kort til de fuldstændige peptider, som tidligere beskrevet [36].

Sammenligning af gangliosid og mimisk anerkendelse

For at sammenligne anerkendelse af gangliosider og deres peptidbaserede efterligner blev scatter plots sammenligner interaktion bidrag antistof rester i gangliosid anerkendelse og efterligner anerkendelse genereret. Afstanden mellem hvert punkt og den linje, der repræsenterer ækvivalens gangliosid og efterligner anerkendelse (

d

) blev beregnet som tidligere [36] beskrevet. Positiv

d

værdier indikerer et større antal interaktioner af denne rest med mimik, mens negativ

d

værdier indikerer flere interaktioner med gangliosidet. Rester med

d

større end en absolut værdi på 3,00 blev anset for at variere betydeligt fra ækvivalens linje.

Resultater

Molekylær docking evaluering

Flere molekylære docking programmer blev vurderet for deres evne til at forudsige den krystallografiske bindingsmåde af en række antichlamydial antistoffer i kompleks med poly-KDO-antigener (tabel 1). Resultaterne af molekylær docking evaluering viser, at de fleste programmer er generelt medhold i nøjagtigt ranking den krystallografiske bindende tilstand (tabel 3). Men alle programmerne kunne identificere den korrekte binding tilstand (dvs. mindre end 2,0 Å RMSD mellem positur og krystallografisk bindende tilstand) i mindst ét ​​tilfælde, uanset klassificering. En undtagelse fra dette er guld, som var i stand til både præcist at identificere og rang, som den øverste positur, den korrekte bindende mode i fire tilfælde, disse er alle de S73-2 komplekser (FBF-koder 3HZK, 3HZV og 3HZY), og komplekset af S25-39 med Kdoα (2 → 4) Kdoα (2-OAII) (PDB 3OKK). To af disse vellykkede tilfælde er vist i figur 2. I almindelighed øge størrelsen og fleksibiliteten af ​​kulhydrat determinant, der undersøges førte til reducerede kvalitet forudsigelser. Endvidere kan bindingssted topografi også påvirke kvaliteten af ​​forudsigelser, som observeret tidligere [45], men for få egnede model komplekser er til rådighed til at bekræfte dette.

A. Sammenligning af højest rangerede pose fås fra molekylær docking (gul) med den krystallografiske bindende tilstand (blå) i Kdoα (2 → 4) Kdoα (2-OAII): S25-39 kompleks (FBF 3OKK). B. Sammenligning af højest rangerede positur (gul) opnået fra molekylær docking med den krystallografiske bindende tilstand (blå) i Kdoα (2 → 8) Kdoα (2 → 4) Kdoα (2-OAII): S73-2 kompleks (FBF 3HZV ). C. Skematisk fremstilling af interaktioner i Kdoα (2 → 4) Kdoα (2-OAII): S25-39 forudsagt ved molekylær docking. D. Skematisk fremstilling af interaktioner i Kdoα (2 → 8) Kdoα (2 → 4) Kdoα (2-OAII): S73-2 kompleks. Molekylær docking udføres med GOLD 4.1.1. Figur 2A og 2B fremstillet ved anvendelse PyMOL [64]. Figurerne 2C og 2D fremstillet ved anvendelse LIGPLOT [65]. Legend til figur 2C og 2D: hydrogenbindinger – grønne streger; hydrofobe interaktioner – red buer; carbon – sort; ilt – rød; kvælstof – blå; ligand obligationer – lilla; protein obligationer -. appelsin

Optimering af site mapping for antistof anerkendelse af sure sukker

Da GOLD produceret de mest nøjagtige rejser, uanset muligheden for at rangere disse rejser, det blev brugt til at give stillingen ensemble input til webstedet kortlægning. En kumulativ sum cutoff på 80% for både hydrogenbinding og van der Waals interaktioner har vist sig at være optimal, når stedet kortlægning anti-kulhydrat antistoffer, hvor kortere, mindre fleksibelt og mindre funktionelt forskelligartede kulhydrater blev anset [32]. Denne cutoff er også blevet anvendt med succes til peptid-genkendende antistoffer og kulhydrat-lectin interaktioner [34], [36]. For at afgøre, om denne cutoff var egnet til at studere antistof anerkendelse af sure sukker med meget fleksible bindinger (dvs. (1 → 6) eller (2 → 8) bindinger), en række cutoff-værdier blev undersøgt (tabel S1). Cutoff 90% viste sig at være mest konsekvente, hvilket gav en lavere standardafvigelse i produktdata (dvs. reproduktion × korrekthed) opnået for sættet af tilfælde (S.D. = 0,05). 80% cutoff gav et identisk middel til 90% cutoff tværs sættet af undersøgte tilfælde, men var lidt mindre konsekvent end 90% cutoff (S.D. = 0,08). Imidlertid er anvendelsen af ​​90% cutoff resulterede i relativt dårlig kort korrekthed (~0.5-0.6) sammenlignet med tidligere sager [32], [34], [36]. Denne lave kort korrekthed kan tilskrives optagelse af mange fejlagtige van der Waals kontakter.

For at optimere udvælgelsen af ​​interagerende rester, hydrogenbindinger og van der Waals kontakter blev betragtet med separate cutoffs, i stedet af samme cutoff for hver interaktion type som tidligere anvendt [32], [34], [36]. Når hydrogenbindinger blev betragtet alene, blev cutoff på 90% fundet at være optimal for den række af testsystemer (Tabel S2) og gav bedre resultater at overveje både brint limning og van der Waals med samme cutoff. Behandling af nogle van der Waals kontakter er nødvendige til identifikation af vekselvirkninger med ikke-polære sidekæder. Det blev konstateret, at en 40% cutoff for van der Waals kontakter, i kombination med en 90% cutoff for hydrogen bonding interaktioner, forudsat den optimale forudsigelse af krystallografiske kontakter (tabel S3).

Brug denne optimerede cutoff, det blev påvist, at stedet kortlægning og toppen udgøre opnået fra molekylær docking udføres sammenligneligt ved forudsigelse af interagerende rester (Figur 3, tabel 4). Desuden er denne optimerede cutoff giver oversigtskort kvalitet sammenlignelige i reproduktion og korrekthed til tidligere studeret antistof-og lectin-kulhydrat-systemer [32], [34].

Kdoα (2 → 4) Kdoα (2 → 4) Kdoα (2-OAII) binding til S73-2 (PDB 3HZY) beskrevet af hydrogenbinding kort (A) og van der Waals interaktion kort (B). Kdoα (2 → 8) Kdoα (2 → 4) Kdoα (2-OAII) binding til S25-39 (PDB 3OKO) beskrevet af hydrogenbinding kort (C) og van der Waals interaktion kort (D). Den farvedybde angiver niveauet af involvering af en bestemt rest i ligand anerkendelse; stærkere belyste rester er mere involveret i ligand anerkendelse end svagt belyste rester. Krystalstrukturen bindende tilstand er vist i hver struktur i pinde farvet af atom type (C, gul, O, rød). Billeder gengives ved hjælp PyMOL [64].

Dynamisk hjemmeside kortlægning af chP3

Strukturen af ​​chP3 (FBF 31U4) mangler tre rester fra HCDR3 sløjfe [30] . Det er kendt, at rester fra denne løkke er vigtige for antigen-genkendelse af chP3. For at identificere den mest hensigtsmæssige konformation af denne sløjfe, “dynamisk” site kortlægning af chP3, hvorved stedet kortlægning af flere chP3 konformere – kun varierer i konformationen af ​​den manglende del af HCDR3 loop – blev gennemført. Da mindre end ti poses blev opnået, når docking Neu5Gc-GM3 til den fjerde laveste energi konformer af chP3 HCDR3, kunne stedet mapping ikke udføres på denne struktur. Den ellevte-laveste energi konformer blev brugt i stedet, for at gøre et sæt af ti strukturer.

Fra site-styret mutagenese undersøgelser, er det kendt, at Arg111.2H (Arg100AH ​​i Kabat nummerering) er kritisk for gangliosid anerkendelse [ ,,,0],30]. Det ville derfor forventes, at denne rest er stærkt involveret i antigen interaktioner. Når proceduren sitet kortlægning blev udført på den laveste energi chP3 HCDR3 konformer, Arg111.2H udgjorde kun 5,31% af alle observerede hydrogenbindinger, mens andre restprodukter tegnede sig for en væsentlig større antal hydrogenbindinger (Tabel S4). Således toppen scoring konformer er potentielt ikke den mest repræsentative for den biologisk relevante tilstand. Lignende site kort til dette blev observeret for femte- og niende-laveste energi chP3 strukturer. Den næstlaveste energi chP3 HCDR3 konformer featured næsten ingen interaktioner med Arg111.2H (0,90% af hydrogenbindinger og 1,34% af van der Waals interaktioner), hvilket tyder på, at sløjfen er også sandsynligt, at være i en biologisk irrelevant kropsbygning. Ved inspektion af denne struktur, sidekæden af ​​Arg111.2H stakke med sidekæden af ​​Trp57H, og kan således ikke nemt at interagere med liganden (figur 4). I det tredje laveste energistruktur blev de fleste hydrogenbindinger observeret med Arg111.2H – lidt over 20% af alle hydrogenbindinger. Derfor er sandsynligvis at være repræsentativ for den biologisk relevante tilstand denne struktur. Andre vigtige kontakter i denne struktur inkluderet Ala112.1H, His107L og Tyr108L. Den sjette-laveste energistruktur featured Arg111.2H og Ala112.1H som vigtige kontakter, men ikke fremtrædende har de to rester fra den lette kæde, er identificeret som vigtige for interaktioner i den tredje laveste energistruktur. I stedet Ser38H blev identificeret som en central kontaktperson. Den ottende laveste energistruktur var ligner denne, med lidt større vægt på interaktioner med His107L og Tyr108L. I det syvende laveste energistruktur, Arg111.2H dominerede brint bonding interaktioner, der tegner sig for næsten en tredjedel af alle hydrogenbindinger observeret med denne struktur. Men Ala112.1H, Gln112H, His107L og Tyr108L hver tegnede sig for ca. 10% af alle hydrogenbindinger. Den tenth- og ellevte-laveste energistrukturer ydes lignende site kort til hinanden, med hydrogenbindinger nogenlunde ligeligt fordelt mellem Arg112.2H, Ala112.1H, Gln112H, Ala113H, His107L og Tyr108L.

A. Den næstlaveste energi konformer, fremhæver stabling mellem sidekæder af Arg111.2H og Trp57H. B. tiende-laveste energi konformer, forventes at være mest tilbøjelige til at blive involveret i ligandbinding. C. Hydrogen bonding oversigtskort for tiende-laveste energi konformer. D. van der Waals map tiende-laveste energi konformer. Rester der bidrager til det gangliosid-bindende motiv er fremhævet på brint bonding site maps.

I alle tilfælde blev van der Waals kontakter domineret af Trp57H og Trp116L (tabel S5). HCDR3 rester – Arg111.2H, Ala112.1H og Gln112H – var også vigtigt for van der Waals kontakter. Deres betydning er normalt på linje med deres betydning for hydrogenbindinger (dvs. rester, der er stærkt vigtige for hydrogenbinding, er typisk stærkt vigtige for van der Waals kontakter).

I analysen af ​​de genererede site maps, blev det fastslået, at chP3 konformer mest repræsentative for den gennemsnitlige tilstand var den tiende-rangeret konformer (figur 4, tabel 5). Denne konformer har signifikant hydrogenbinding med Arg111.2H, der vides at være vigtige for anerkendelse fra site-styret mutagenese studier, men foreslår også vigtigheden af ​​nærliggende hCDR3 rester (Ala112.1H, Gln112H, Ala113H) og LCDR3 resterne His107L og Tyr108L. De van der Waals interaktioner stort set forekomme med tryptophanrester i positionerne 57H og 116L. Denne rest udnyttelse ligner andre anti-kulhydrat antistoffer [32].

Bestemmelse af den sandsynlige gangliosid-erkendelse motiv

Vi havde undersøgt gangliosid anerkendelse af de fire anti-gangliosid antistoffer (tabel 2) ved hjælp af identisk hydrogenbinding og van der Waals cutoffs, som pr vores tidligere arbejde [20], [32], [34], og det identificerede nogle af de restkoncentrationer, som vil blive inddraget i gangliosid anerkendelse [48]. For at bekræfte resultaterne af denne forundersøgelse, disse sager er nu blevet fornyet overvejelse ved hjælp af de optimerede cutoff værdier. De tilsvarende kulhydrat epitoper af gangliosiderne blev forankret til R24, ME36.1 og 14F7, og de optimerede cutoffs blev anvendt til at identificere sandsynlige antistofrester involveret i gangliosid anerkendelse. De genererede site maps, samt at der genereres af den dynamiske kortlægningsprocedure påføres chP3, blev anvendt til at identificere tilstedeværelsen af ​​en potentiel gangliosid-bindende motiv i de anti-gangliosid-antistoffer. De vigtigste rester involveret i gangliosid anerkendelse er opsummeret i tabel 6.

gangliosid genkendelse af antistofferne blev generelt domineret af interaktioner med den tunge kæde (figur 4 og 5). I tilfælde af mAb’erne R24 og 14F7, anerkendelse var helt afhængige af tung kæde-rester, mens det for mAb’erne ME36.1 og chP3, ca. en tredjedel af alle interaktioner skete med let-kæde-rester. Disse forskelle i CDR udnyttelse kan forklares med hensyn til bindingsstedet topografi hver af antistofferne; de bindende hulrum i R24 og 14F7 er begge består udelukkende af tung kæde-rester, med adgang til de LCDRs blokeret af HCDR2.

hydrogenbinding og Van der Waals site maps af R24 (A og B), ME36.1 (C og D) og 14F7 (E og F). Rester, der bidrager til den sandsynlige gangliosid-bindende motiv er mærket på brint bonding site maps.

På trods af forskellene i bindende websted topografi, der er centrale ligheder mellem de antistoffer, som bliver tydelige ved strukturel undersøgelse af site maps. Fire rester, arrangeret i et forholdsvis ens “spiral” omkring hvert antistof bindingssted, er i vid udstrækning ansvarlige for brint limning interaktioner med gangliosiderne. Proceeding uret, den sandsynlige gangliosid-bindende motiv af antiganglioside antistoffer omfatter to polære rester (typisk Ser, efterfulgt af Tyr, Thr eller Asp), en aromatisk rest (typisk Tyr) og en basisk rest (Arg). Ikke alle antistofferne strengt i overensstemmelse med denne motiv; for eksempel R24 er udstyret med en threoninrest hvor en arginin ville forventes, og chP3 har en alaninrest hvor en serin ville forventes

peptid mimicry af gangliosiderne

Peptid efterligner af GD3. – RHAYRSMAEWGFLYS – kunne replikere næsten alle af van der Waals interaktioner foretaget af gangliosid med R24, men nogle markante forskelle i hydrogenbindingen profil indtraf (tabel S6). Kortene viste, at peptidet har undladt at kopiere antallet af hydrogenbindinger indgået mellem GD3 trisaccharid og antistof rester Gly38H og Ser58H. Men en betydelig stigning i hydrogenbindinger med HCDR3 rester, Tyr113H og Tyr114H, blev observeret. Den reducerede potentiale af peptidet til dybt og konsekvent trænge bindingsstedet tværs stillingen ensemble kan forklare, hvorfor færre interaktioner blev observeret med Gly38H og Ser58H. Tyr113H og Tyr114H kan give flere interaktioner med peptid, da de er mere let tilgængelige. Fra sammenligning af ganglioside- og peptid-afledt site maps (figur 6), ser peptidet at være en delvis strukturel efterligning af GD3 [20]. Denne delvise strukturel mimicry kunne forklare den observerede immunologiske mimicry af GD3 af dette peptid [25].

A. Hydrogen bonding site map beskriver peptid (RHAYRSMAEWGFLYS) anerkendelse af R24. B. van der Waals interaktion site map beskriver peptid anerkendelse af R24. maps Siden er udført og gengives ved hjælp PyMOL [64]. C. Sammenligning af hydrogenbindinger websted maps beskriver GD3 og peptid anerkendelse. D. Sammenligning af van der Waals websted maps beskriver GD3 og peptid anerkendelse. I figur 6C og 6D, udestående punkter indikerer rester, som afviger væsentligt fra den linje, der repræsenterer ækvivalens kulhydrat og peptid interaktioner (dvs., |

d

| 3,00). Det udestående punkt ikke er mærket på figur 6C svarer til Tyr114H.

Peptid efterligner af GD2 kunne tættere efterligner kulhydrat binding til ME36.1 sammenlignet med peptid efterligne GD3 binding til R24 (tabel S7) . Svarende til kulhydrat og peptid-binding til R24, de van der Waals interaktioner kulhydratet var udmærket replikeres af peptidet, mens der sås nogle mindre forskelle i hydrogenbindingen profil. En betydelig stigning i hydrogenbindinger med Asp55H og Ser108H blev observeret, ledsaget af et lille fald i hydrogenbindinger med Tyr55L og Ser56L. På trods af disse forskelle, at ganglioside- og peptid-afledt site maps til ME36.1 er generelt meget lig hinanden. Da peptidet kendt for at være en immunogen efterligner af GD2 [23], udgør dette et tilfælde af strukturel mimicry omsætte til immunologisk mimicry (figur 7) [20].

A. Hydrogen bonding site map beskriver peptid (LDVVLAWRDGLSGAS) anerkendelse af ME36.1. B. van der Waals interaktion site map beskriver peptid anerkendelse ME36.1. C. Sammenligning af hydrogenbindinger websted maps beskriver GD2 og peptid anerkendelse. D. Sammenligning af van der Waals site maps beskriver GD2 og peptid anerkendelse.

Diskussion

Kulhydrat-protein anerkendelse er særligt udfordrende for molekylær docking at forudsige præcist, på grund af de mange kemisk ækvivalente hydroxylgrupper i kulhydrater og deres potentiale til at danne mange specifikke interaktioner, herunder CH-π interaktioner [45], [49]. Evaluering af en række molekylær docking metoder til bekæmpelse af egnede testcases er ønskeligt at sikre udviklingen af ​​en optimal modellering protokol. Vi har tidligere vist, at molekylær docking kan være et effektivt redskab til at studere antistof anerkendelse af strukturelt enklere kulhydrater [45]. Men gangliosider har forskellige kemiske funktionalitet, herunder carboxylatgrupper og fleksible hydroxylerede kæder. Desuden GD2 og GD3 indeholder α (2 → 8) bindinger, som byder en ekstra grad af konformationel frihed i forhold til for eksempel (1 → 3) og (1 → 4) bindinger, som vi tidligere har undersøgt [45]. Så vidt vi ved, sådanne systemer er ikke blevet behørigt evalueret med molekylært docking. Mens høj opløsning gangliosid-antistof-komplekser er ikke tilgængelige til brug i evalueringsmetode, en serie af høj opløsning strukturer af antichlamydial antistoffer i kompleks med Kdo-holdige kulhydrater er tilgængelige [50], [51], [52] (Tabel 1); disse repræsenterer de bedst egnede modelsystemer for at vurdere sandsynligheden for succes forudsige gangliosid-antistof-anerkendelse. Et andet problem med molekylær docking er behovet for at overveje potentialet i multiple ligand bindende tilstande. Deres virkning på genkendelse af proteiner kan være vigtige for meget fleksible ligander, såsom kulhydrater og peptider [49]. For at overveje effekten af ​​multiple ligandbindende modes om anerkendelse af proteiner [53], udviklede vi webstedet mapping teknik, som vi har vist sig at være effektive til at studere kulhydrat-antistof [32] og kulhydrat-lektin anerkendelse [34],