PLoS ONE: Benchmarking af Mutation Diagnostics i Clinical Lung Cancer Specimens

Abstrakt

Behandling af

EGFR

-mutant ikke-småcellet lungekræft patienter med tyrosinkinaseinhibitorer erlotinib eller gefitinib resultater i høje svarprocenter og langvarig progressionsfri overlevelse. Trods udviklingen af ​​følsomme mutation sporingstilgange, en grundig validering af disse i et klinisk miljø er hidtil manglet. Vi udførte, i et klinisk miljø, en systematisk validering af dideoxy- ‘Sanger’ sekventering og pyrosekventering mod massivt parallel sekventering som et af de mest følsomme mutation detektionsteknologier rådighed. Mutations annotation af kliniske lunge tumor prøver viste, at af alle patienter med en bekræftet svar på

EGFR

hæmning, kun massivt parallel sekventering opdaget alle relevante mutationer. Derimod dideoxysekvensbestemmelse savnet fire responders og pyrosekventering savnet to respondenter, hvilket indikerer en dramatisk mangel på følsomhed dideoxysekventering, som er almindeligt anvendt til dette formål. Desuden præcis kvantificering af mutant alleler afslørede en lav korrelation (r

2 = 0,27) af histopatologiske estimater af tumor indhold og hyppighed af mutant alleler og dermed spørgsmålstegn ved brugen af ​​histopatologi for lagdeling af prøver for de enkelte analytiske procedurer. Vores resultater tyder på, at øget analytisk sensitivitet kritisk kræves for at identificere patienter, der responderede på

korrekt EGFR

hæmning. Mere generelt, vores resultater understrege behovet for grundig evaluering af alle mutation afsløring metoder til bekæmpelse af massivt parallelle sekventering som en forudsætning for enhver klinisk implementering

Henvisning: Querings S, Altmüller J, Ansén S, Zander T, Seidel D. , Gabler F, et al. (2011) Benchmarking af Mutation Diagnostics i Clinical lungekræft Enheder. PLoS ONE 6 (5): e19601. doi: 10,1371 /journal.pone.0019601

Redaktør: Markus Schuelke, Charité Universitätsmedizin Berlin, NeuroCure Clinical Research Center, Tyskland

Modtaget: December 7, 2010; Accepteret: April 2, 2011; Udgivet: 5 maj 2011

Copyright: © 2011 Querings et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af den tyske Cancer Aid som en del af Centers of Excellence i Onkologisk program til centrum af Integrated Oncology Köln – Bonn og ved den tyske ministerium for videnskab og uddannelse (BMBF) som en del af det nationale Genome Research Network-programmet (NGFNplus , giver 01GS08100 og 01GS08101) til Jürgen Wolf, Peter Nürnberg og Roman Thomas. De finansieringskilder havde nogen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Roman K. Thomas modtaget forskningsstøtte fra AstraZeneca og modtaget foredrag eller konsulenthonorarer fra Roche , Boehringer Ingelheim, Johnson Johnson, AstraZeneca, Lilly, Merck, Atlas Biolabs og Sanofi-Aventis. Jürgen Wolf fik forskningsstøtte og fungerede som konsulent for Roche og AstraZeneca. Forskning support nævnt i dette afsnit blev ikke brugt til at udføre denne undersøgelse. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

I første omgang begrænset til sjældne tumorer såsom kronisk myeloid leukæmi (CML) eller gastrointestinale stromale tumorer (GIST), har succes behandle mutation aktiverede kinaser med kinase hæmmere nåede gruppen af ​​de hyppige “solide” tumorer og har dermed dybt ændret klinisk onkologi. Behandling af patienter med

EGFR

-mutant kræftformer med

EGFR

hæmmere medfører objektiv respons [1], [2], [3], til en fordobling i progressionsfri overlevelse sammenlignet til standard kemoterapi og til lange samlet overlevelse [4], [5]. Lignende par af genomiske læsioner og målrettede lægemidler er

BRAF

mutation og

BRAF

hæmning [6]

PARP

hæmning og

BRCA1 /BRCA2

mutationer [7 ], [8] eller

PDGFRA

/

KIT

mutation og imatinib [9]. I lyset af den nuværende indsats til systematisk rigtig rækkefølge genomer for alle store tumortyper (https://www.icgc.org/eller www.cancergenome.nih.gov), en liste over genetisk definerede tumorer, der er modtagelige for en bestemt terapeutisk indgriben derfor sandsynligvis udvide dramatisk i de kommende år. Tilsammen udgør disse observationer antyder en hastigt voksende behov for følsom og præcis mutation påvisning i kliniske prøver som en del af rutinemæssig klinisk pleje.

Desværre, trods vises trivielle, klinisk gennemførelse af mutation afsløring møder både prøve-relaterede og metodiske problemer : første, de fleste kliniske prøver til rådighed, er små, formalinfikseret og paraffinindlejret (FFPE) biopsier eller cytologiske prøver typisk eftergivende begrænsede mængder af lav kvalitet DNA, som alle influerer kraftigt PCR-amplifikation og efterfølgende analyser. Endvidere tumor sammensætning samt flere typer af ikke-neoplastiske celler påvirker påvisning af tumorspecifikke somatiske mutationer i en baggrund af ikke-mutant, “vildtype” alleler. For det andet, konventionelle sekventering tilgange mangler følsomhed til påvisning af sådanne sjældne alleler.

Adskillige metoder blev etableret for at tilbyde følsomme mutationsdetektion, alle herunder DNA-ekstraktion, PCR-amplifikation og efterfølgende mutation analyse ved sekventering eller genotypebestemmelse assays [ ,,,0],10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19]. I flere tilfælde er berigelse af tumorceller opnået mutationsdetektion forudgående, fx ved laser-assisteret mikrodissektion af tumorprøver [15], [17]. Desværre er der en næsten universel mangel på validering af klinisk relevant mutation afsløring tilgange i kliniske omgivelser mod en følsom guldstandard tilgang.

Vi har for nylig introduceret massivt parallel sekventering for mutation påvisning i kliniske kræft prøver [20]. Sådanne tilgange er almindeligt anset for at tilvejebringe den højeste følsomhed i øjeblikket tilgængelig til dette formål på grund af evnen til at prøve sjældne mutante alleler i en fremherskende baggrund af vildtype alleler i nogen tumorprøve [20]. Desuden er denne fremgangsmåde ikke begrænset til en a-priori udvalg af mutationer vurderes relevant. Derfor er massivt parallelle sekventering velegnet til at validere andre mutation detekteringsmetoder.

I denne undersøgelse har vi valideret to sekventering baseret mutationsdetektion tilgange (dideoxy og pyrosekventering) mod parallel sekventering i et klinisk miljø, idet tages hensyn til indholdet tumorceller samt kvaliteten og typen af ​​væv (f.eks FF, FFPE) af hver prøve.

Materialer og metoder

Etik Statement

Dette undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité i det medicinske fakultet på universitetet i Köln og alle patienter gav skriftligt informeret samtykke. En undergruppe af patienter (n = 9) deltog i ERLOPET forsøget (NCT00568841).

Tumorprøver og cellelinier

I denne undersøgelse har vi analyseret 24 tumorprøver opnået fra 22 patienter ( tabel 1). Denne undersøgelse blev godkendt af den lokale etiske komité, og alle patienter gav skriftligt informeret samtykke. En undergruppe af patienter (n = 9) deltog i ERLOPET forsøget (NCT00568841). Tumor prøver blev revideret af en henvisning patolog til at bestemme indholdet af tumor-celle til efterfølgende dissektion af områder med højeste indhold tumor-celle. NSCLC cellelinjer huser forskellige

EGFR

KRAS

mutationer blev opnået og dyrket som tidligere beskrevet (Supplerende tabel S1) [21]. Genomisk DNA fra alle tumorprøver og cellelinier blev ekstraheret under anvendelse Gentra Pure Gene Tissue Kit (Qiagen) efterfulgt af DNA kvantificering under anvendelse Picogreen dsDNA reagenser (Invitrogen).

PCR og direkte dideoxysekventering

EGFR

exon18-21 og

KRAS

exon 2 og 3 blev forstærket af nested PCR og gen specifikke eksterne og interne primerpar (supplerende tabel S2). Interne primere er udstyret med M13-primersekvensen at lette sekventering. For eksterne PCR-reaktioner, vi brugte 5-10 ng (40-60 ng DNA lav kvalitet) af genomisk DNA. PCR-reaktioner blev udført i et totalt volumen på 50 pi (0,2 pM af hver primer, 2 mM MgC

2, 200 uM af hver dNTP og 1,25 U HotStarTaq

Plus

DNA Polymerase Kit (Qiagen)) og følgende cyklusbetingelser: 95 ° C i 5 min, 30 cyklusser ved 95 ° C i 30 sek, 60 ° C i 30 sek og 72 ° C i 1 min og endelig forlængelse ved 72 ° C i 10 min. Efter ExoSAP-IT (USB Corporation) behandling PCR-produkter blev tovejs sekventeret ved anvendelse af M13-sekventeringsprimere og BigDye Terminator Mix version 3.1 (Applied Biosystems) på ABI 3730 (Applied Biosystems). Sekventeringsreaktioner elektroferogrammer blev analyseret ved visuel inspektion af elektroferogrammer og ved mutation Surveyor 2,03 Software (SoftGenetics). Fragment længde analyse af

EGFR

exon 19 blev udført af standard PCR (For-Hex-ctggatccagaaggtgaga og Rev-ccacacagcaaagcagaaac) resulterer i amplikoner af 118 bp (Ta = 59 ° C) i vildtype exon 19 . PCR-produkter blev analyseret på ABI 3700 DNA sequencer og scoret af GeneMarker software (SoftGenetics).

Pyrosequencing analyser

Vi har designet fem forskellige pyrosekventering [22] assays til sekventering analyse af

EGFR

exon 19-21 og

KRAS

exon 2 og 3 (supplerende tabel S3). Template-DNA (6 ng genomisk DNA eller eksterne PCR-produkter) blev amplificeret under anvendelse HotStarTaq

Plus

DNA Polymerase Kit (Qiagen) og standardprotokol (0,2 pM af hver primer, 160 mM dNTP’er, 2 U enzym) og cykliseringsbetingelser (45 cykler og Ta = 59 ° C i

EGFR

exon 19, Ta = 60 ° C i

KRAS

exon 2, Ta = 63 ° C i

EGFR

exon 20, Ta = 61 ° C i

EGFR

exon 21 og

KRAS

exon 3 og Ta = 60 ° C i

KRAS

exon 2). Reverse PCR-primere blev biotinyleret til efterfølgende pyrosekventering analyse. Pyrosequencing reaktioner blev udført på PSQ HS96A instrument ved hjælp PSQ HS96A SNP reagenser og pyrosekventering SNP analyse software (Biotage AB, Uppsala, Sverige, nu hedder PyroMark ™ Q96MD af Qiagen). For følsomhed undersøgelser, kvantificeret PCR-produkter af

EGFR

-mutant celler eller

KRAS

-mutant celler blev fortyndet med vildtype

EGFR

eller vildtype

KRAS

amplikoner henholdsvis. Pyrosequencing rå datasignaler blev normaliseret under anvendelse af kendte vildtype-signaler. Signifikant mutation kald blev bestemt ud fra eksperimentelle støj ved statistisk analyse af rådata bruger T-test (p ≤ 0,05).

Massively parallel sekventering analyse

Massively parallel sekventering blev udført ved hjælp af GS FLX Standard eller GS FLX Titanium kemi ifølge standard protokoller (Roche). Amplikon biblioteker blev genereret ved hjælp af eksterne PCR-produkter som skabeloner og standard protokoller og betingelser for FastStart Hifi PCR-system (Roche) (Supplerende tabel S4). Vi brugte i gennemsnit 340.000 perler pr løb giver 80,000 til 120,000 læser i alt og en amplikon dækning spænder fra 600 × til 1500 × med en gennemsnitlig amplicon længde på 250-300 bp dækker hele exon. Alle læser blev tilpasset til chromsome 7 og 12 af referencen genom (hg18) ved hjælp af BWA [23]. Endelig justeret læser blev visualiseret og analyseret af Integrativ Genomics Viewer (https://www.broadinstitute.org/igv/). Den Studerende T-test blev anvendt til sammenligning af relativ læse frekvens mellem

EGFR

muterede og vildtype tumorer. Vi sætter sekventering fejlprocenten til 0,1% i områder uden homopolymerer [24]. Tærsklen for betydelig påvisning af muterede alleler blev defineret under anvendelse af en Poisson-fordeling af det kendte fejlprocent under hensyntagen til dækning fører til en detektionsgrænse mellem 0,3 og 0,5% mutante alleler.

Resultater Salg

patienter og tumor prøver

Siden september 2008 til april 2009 har vi analyseret patienter med histologisk bekræftet NSCLC for tilstedeværelse af mutationer i exon 18-21 af

EGFR

og exon 2 og 3 i

KRAS

. Patienter indskrevet i denne mutation analyse undersøgelse er ikke repræsentativ for forekomsten af ​​sådanne mutationer i NSCLC, som de blev beriget for sager med en øget sandsynlighed for at være

EGFR

mutation-positive baseret på histologiske og kliniske funktioner (f.eks, lunge adenocarcinom i aldrig eller lys ex-rygere). I denne benchmarking-undersøgelse, har vi analyseret 24 tumorer fra 22 patienter (tabel 1) for en systematisk sammenligning af mutation afsløring udførelsen af ​​konventionel dideoxy og pyrosekventering mod en af ​​de mest følsomme sekventering teknologi, massivt parallel sekventering [20]. Indholdet af hver af disse prøver tumor-celle blev estimeret ved en patolog og varierede fra 5% til op til 95%. Kliniske prøver bestod formalin-fikseret og paraffin-embedded (FFPE) tumor væv blokke samt frisk-frosset (FF) biopsier eller cytologiske dias opnået fra pleuraekssudat (tabel 1).

Påvisning af klinisk relevante mutationer ved metoder af forskellig følsomhed

Vi uropført konventionel dideoxy-nukleotid kædeterminering-baserede ( “Sanger”) sekventering på alle disse prøver, fordi, trods sine begrænsninger, denne metode er stadig den mest udbredte metode til mutation afsløring i kliniske prøver. Vi bestemt følsomheden af ​​denne sekventering teknik til at variere fra 20-30% af muterede alleler ved at blande PCR-produkter fra

KRAS

-mutant og vildtype cellelinjer (Supplerende fig. S1). Mutation screening af 24 tumorprøver ved dideoxysekventering afslørede korte i-ramme nukleotiddeletioner i

EGFR

exon 19 (tabel 1, fig. 1A og 1B) i otte prøver og kun én prøve (tilfælde 03), indeholdt den L858R punktmutation i exon 21 i

EGFR

(tabel 1). Desuden tre prøver (case 19, 24 og 30) havde mutationer i exon 2 i

KRAS

gen (tabel 1).

Sekventering analyse af

EGFR

exon 19 blev udført ved dideoxysekventering (elektroferogrammer i de venstre paneler), pyrosekventering (pyrogams i de midterste paneler) og massivt parallel sekventering (programmer i højre panel). (A) Wild-typen

EGFR

exon 19 opdaget af alle tre sekventeringsteknikker; (B) L747_A750del, P753S mutation opdaget af alle tre sekventeringsteknikker; (C) E746_A750del (Del-1A) mutation identificeres ved pyrosekventering og massivt parallel sekventering; (D) E746_A750del (Del-1 B) kun opdaget af massivt parallelle sekventering. del, sletning; Mut, mutation; WT, vildtype. Pile angiver position af forventede mutation specifikke signaler.

Vi næste testede, om konventionel pyrosekventering [22] var i stand til at bekræfte mutationer fundet af dideoxysekventering og hvis yderligere mutationer kunne findes ved denne metode i patientens kohorte testet. Pyrosekventering tilbyder omkostningseffektiv kvantitativ påvisning af sekvensvarianter og er tidligere blevet vist at aktivere følsomme

KRAS

mutationsdetektion i kolorektal cancer [12], [25], [26]. Den forøgede følsomhed til detektion af sjældne varianter skyldes genereringen af ​​ikke-forstyrrende, individuelle signaler for mutant- og vildtype-alleler. Vi etablerede følsomme (5-10% mutant allel), reproducerbare og lineære pyrosekventering analyser til de mest prominente mutation hotspots i

EGFR

KRAS

(Supplerende fig. S2, S3, S4, S5 , S6, S7, S8, S9, S10). Pyrosequencing bekræftede alle mutationer påvises ved dideoxysekventering (tabel 1). Men vi opdaget også fire ekstra mutationer i vores prøve kohorte, der havde været savnet ved dideoxysekventering (tabel 1, fig. 1C og supplerende Fig. S3A, S6B, S9A). For eksempel har vi opdaget erlotinib resistensmutation, T790M, i tumor prøve 10 (80% af tumorceller indhold) opnået på tidspunktet for tilbagefald (supplerende fig. S6B), og denne prøve også nærede de L747_S752del_P753S sletning oprindeligt opdaget af dideoxysekventering (tabel 1 og fig. S4C). Vi fandt endvidere en tidligere uopdaget G12A substitution i exon 2 af

KRAS

i prøve 11 (50% af tumorceller indhold, supplerende Fig. S9A) og bekræftet denne mutation ved subkloning af

KRAS

exon 2 amplikoner og efterfølgende dideoxysekventering (data ikke vist).

EGFR

exon 19 pyrograms prøve 27 (40% tumorceller) og prøve 05 (50% tumorceller) udviste fluorescenssignalerne indikative for tilstedeværelsen af ​​mutationer, der var betydeligt over niveauet for eksperimentel støj (Fig. 1C og supplerende fig. S3A). Fragment-længde analyser af

EGFR

exon 19 PCR-produkter valideret denne sletning i prøve 27 (Supplerende fig. S11).

Endelig har vi ansat massivt parallelle vifte-baserede pyrosekventering-by-syntese [ ,,,0],20] for at validere mutationen resulterer fra traditionelt dideoxy og pyrosekventering. Vi sekventeret alle af de 24 prøver til en gennemsnitlig dækning på 1079 × og et minimum dækning på 600 × pr exon og prøve. Dataanalyse bekræftede tilstedeværelsen af ​​

EGFR

KRAS

mutationer i 13 prøver indledningsvis konstateret af begge, dideoxysekventering og pyrosekventering (tabel 1). Desuden massivt parallel sekventering valideret også de fire yderligere mutationer, der var nyligt opdaget af følsomme pyrosekventering:

EGFR

exon 19 sletninger i prøve 05 og 27, den G12A mutation af

KRAS

i prøve 11 og den T790M mutation af

EGFR

i prøve 10 (tabel 1). Den parallelle natur af denne sekventering tilgang aktiveret præcis kvantificering og identifikation af disse lavfrekvente varianter. Konkret har vi identificeret exon 19-mutationen i prøve 05 at være en 9-bp deletion i ramme kodende for aminosyredeletion-substitution E746_R748del_A750, ved en frekvens på 11% af 1315 læser (tabel 1). Endvidere har vi kvantificeret en 12-bp deletion (E746_A750) at forekomme med en frekvens på 11% af 854 læser i prøve 27 (fig. 1C). Den G12A substitution i prøve 11 var til stede i 21% af 1358 læser og T790M resistensmutation i prøve 10 forekom med en hyppighed på 20% ud af 909 læser (tabel 1).

Udover at validere den tidligere fundne mutationer parallel sekventering identificerede

EGFR

exon 19 deletioner i prøve 31 og 13a, som var umulig at skelne fra eksperimentel støj i både konventionelle dideoxy- og pyrosekventering analyser. Parallel sekventering muliggjorde detektion af en E746_A750del i prøve 31 ved en frekvens på 6% af 1081 læser (tabel 1 og fig. 1D). Bemærkelsesværdigt havde denne prøve blevet anslået til at indeholde 60% tumorceller ved histopatologi (tabel 1). Tilsvarende flowgrams prøve 13a (5% tumorceller) afslørede en 12-bp deletion (L747_A750del_T751P) ved en frekvens på ca. 8% af 658 læser (tabel 1). Denne mutation var identisk med den, der allerede detekteres ved dideoxysekventering i en anden prøve af den samme patient (prøver 13b) med højere tumor-indhold (70%), fremstillet på tidspunktet for tilbagefald (tabel 1). Således ud over validering alle de andre mutationer, som var blevet kaldt ved dideoxysekventering (n = 12) og pyrosekventering (n = 16), massivt parallelle sekventering identificerede to yderligere muterede prøver, der var blevet savnet af de to andre metoder på grund af utilstrækkelig følsomhed . (tabel 1 og Supplerende tabel S5)

Vi næste analyseret høj kvalitet 454 sekventering læser (Phred score 30) med det mål at afsløre T790M mutationer forekommer ved lav frekvens i prøver taget før behandlingen. Exon 20 blev dækket til et midlet dybde af 1018 læser i region codon 790. Hos patienter, hvis tumorer havde en deletion i exon 19 eller L858R vi observeret en signifikant højere (p = 0,03) antal læser indeholdende T790M-mutationen i forhold til patienter med vildtype

EGFR

(EGFR mut: middelværdi = 2,5 /1000; interval 0-7,5 /1000; EGFR vægt:. betyde 0,8 /1000 (0-2.3 /1000) Vi ​​bemærker, at disse allelfrekvenserne er i rækken af ​​den teknologiske grænse for nøjagtighed. men antallet af læser med T790M var over tærsklen for mutation ringer i 27% af prøverne med sletning i exon 19 eller L858R men i ingen prøve uden

EGFR

mutation (Supplerende fig. S12).

samlet set massivt parallel sekventering identificeret i alt 18 mutationer i

EGFR

KRAS

resulterer i en følsomhed på 67% for dideoxy- sekventering og 89% for pyrosekventering (tabel 1 og Supplerende tabel S5). på trods af den begrænsede størrelse vores prøvesæt, disse resultater understreger den dramatiske mangel på følsomhed dideoxysekventering i klinisk påvisning mutation.

følsomhed mutation afsløring som en funktion af tumor celleindhold

tumor-celleindhold er en kritisk parameter for udførelsen af ​​mutationspåvisning i cancer [20] og er grundlaget for mikrodissektion-baserede tumor-celle berigelse. Vi søgte derfor at analysere effektiviteten af ​​de tre mutation analysemetoder som en funktion af histopatologisk beregnede indhold tumor-celle. Den gennemsnitlige tumor indhold af prøver identificeret som mutant ved dideoxysekventering var 78% (interval 35-95%) og 71% (interval 35-95%) i tilfælde af pyrosekventering (fig. 2A). Alle prøver, hvor dideoxysekventering havde ubesvarede mutationer, indeholdt 80% tumorceller eller mindre. Derimod prøverne, hvor pyrosekventering havde forpasset mutationer havde 60% tumor indhold eller mindre (fig. 2A).

(A) Sammenhæng mellem det beregnede indhold tumor celle og den aktuelle frekvens af muterede alleler bestemt af massivt , parallel sekventering data. Sort, mutationer detekteret ved dideoxy og pyrosekventering; Grøn, mutationer påvises ved pyrosekventering, men savnet af dideoxysekventering; Rød, mutationer kun påvises ved parallel sekventering. (B) Følsomhed af dideoxysekventering, pyrosekventering og massivt parallel sekventering hos patienter med bekræftet klinisk respons på behandling med erlotinib.

Vi næste vurderet sammenhængen mellem tumor-celle indhold og hyppighed af muterede alleler som bestemt ved massivt parallelle sekventering (fig. 2A). Vi observerede en lav korrelation mellem analytisk bestemt allel frekvens og indhold tumor-celle (

r

2

= 0,27,

s

= 0,029). Bemærkelsesværdigt er detektionsgrænsen for de forskellige tilgange bestemt ved tælling af mutant og vildtype alleler detekteret af massivt parallelle sekventering i de primære tumorer var meget lig dem, der observeres i de indledende allel blande eksperimenter (Supplerende fig. S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8, S9, S10): 29% for dideoxysekventering og 11% for pyrosekventering (tabel 1 og figur 2A).. Allelfrekvenserne af mutationer fundet af pyrosekventering men ikke dideoxysekventering lå på mellem 11% og 21% (fig. 2A). Mutationer kun påvises ved massivt parallelle sekventering forekom ved allel frekvenser på mindre end 10% (tabel 1 og fig. 2A). Påfaldende, havde tumoren indholdet i disse tilfælde anslås til at være 60% og 5%, henholdsvis. Således histopatologiske estimater af tumor-celleindhold ikke prædiktiv for frekvensen af ​​mutante alleler, mens evnen til at detektere mutationer er begrænset af den allel frekvens, men ikke ved indholdet tumorcellen.

EGFR mutationer og kliniske resultater

Tidligere analyser af sammenslutningen af ​​

EGFR

mutationer og klinisk fordel fremkaldt af

EGFR

hæmning har undertiden givet inkonsistente resultater i at nogle undersøgelser har rapporteret en mangel på en sådan forening [ ,,,0],27], [28], [29] Sådanne uoverensstemmelser kan skyldes den manglende opdage mutationer med tilstrækkelig følsomhed og nøjagtighed. Vigtigere er det, i vores kohorte, kun massivt parallel sekventering var i stand til at opdage en sensibiliserende

EGFR

mutation i

alle

patienter, der havde oplevet et partielt respons (i henhold til RECIST kriterier) efter behandling med erlotinib ( fig. 2B). Derimod blev kun 7 ud af 11 patienter med bekræftet PR detekteret ved dideoxysekventering og 9 af 11, blev identificeret ved pyrosekventering (fig. 2B). På trods af den begrænsede størrelse vores patient kohorte, disse resultater støtter den tanke, at de dramatiske forskelle i følsomhed stærkt forvrænge sammenhængen mellem tilstedeværelsen af ​​

EGFR

mutationer og respons på erlotinib. Patienter med

EGFR

-Wild-type tumorer og

KRAS

-mutant tumorer, som havde modtaget erlotinib udvist stabil eller progressiv sygdom (tabel 1) i overensstemmelse med tidligere rapporter [30].

diskussion

Her viser vi, hvordan den begrænsede følsomhed metoder, er almindeligt anvendt til klinisk mutation diagnostik kunne føre til en kritisk unøjagtighed i genetisk patient lagdeling. Især den lave følsomhed dideoxysekventering ført til misdiagnoses i 6 af 24 lungekræft prøver. Hvis tilstedeværelsen af ​​en

EGFR

mutation havde været kriteriet for behandling med

EGFR

hæmmere, fire patienter ville ikke have fået den rigtige behandling integration. På trods af den begrænsede størrelse vores prøvesæt, understreger disse resultater utilstrækkelige dideoxysekventering til kliniske kræft genmutationstestene diagnostik. Derimod bliver konventionel pyrosekventering tilbudt forøget følsomhed med kun to patienter fejldiagnosticeret. Desuden massivt parallel sekventering håndfast og præcist identificeret alle mutationer findes i datasættet. Vi viser endvidere, at parallel sekventering kan afsløre allerede eksisterende T790M mutationer i en brøkdel 27% af

EGFR

-mutant patienter [31]. Disse resultater understøtter den konklusion, at massivt parallel sekventering er den mest følsomme teknologi i øjeblikket tilgængelig i klinisk mutation diagnostik og foreslå, at pyrosekventering kunne være et alternativ til dideoxysekventering.

Mens mange teknikker er opstået i løbet af de sidste par år til at matche det stadigt stigende behov for at give præcise kliniske mutation analyser onkologer, ingen af ​​disse er blevet systematisk benchmarkes mod massivt parallel sekventering, metoden med den højeste følsomhed til klinisk mutation detektion til dato. Ekstrapolere forskelle såsom dem observeret i denne undersøgelse til det store antal kræftpatienter tyder på verdensplan, at mange patienter bliver fejldiagnosticeret hvert år. Således omhyggeligt udviklet diagnostiske metoder (herunder grundig validering mod massivt parallelle sekventering) vil hjælpe målretning effektiv behandling til højre patientpopulation.

mikrodissektion er blevet anvendt bredt til at øge den del af tumorceller i en given prøve med henblik at øge følsomheden af ​​dideoxysekventering. Identifikation af tumor-rige områder er en forudsætning for en sådan procedure. Vi fandt imidlertid kun en lav korrelation af tumor-celleindholdet og hyppigheden af ​​mutante alleler. Vi antager, at en rutinemæssig undersøgelse af histopatologiske sektioner ikke præcist kan vurdere graden af ​​”forurening” af den mutante allel af raske bystander celler (f.eks normal lungevæv), der tilslører frekvensen af ​​den mutante allel. Således kan mikrodissektion kun delvist redde begrænsede følsomhed dideoxysekventering og bør derfor også valideres omhyggeligt mod massivt parallel sekventering.

Et andet ofte diskuteret emne er spørgsmålet om, hvorvidt genotypebestemmelse eller sekventering kan være den optimale strategi for klinisk mutationspåvisning i cancer. Selvom vores resultater antyder, at pyrosekventering er en følsom, nøjagtig og omkostningseffektiv metode til at analysere det store flertal af prøver med en tumor indhold på 20-70%, kan andre metoder, herunder sådanne baseret på genotypebestemmelse, lige effektiv. Ved allerede kendte hot-spot-mutationer Locked Nucleic Acid (LNA) tilgange kan detektere mutante alleler, der forekommer ved frekvenser så lave som 0,1% [14], [16]. Andre teknikker, der kan have værdi i klinisk anvendelse omfatter immunhistokemi bruge

EGFR

mutationsspecifikke antistoffer [32] eller anvendelse af molekylære beacons koblet af fluorescerende billeddannelse [33]. Det er imidlertid vigtigt at huske på, at den iboende manglende evne genotypebestemmelsesmetoder at dække alle klinisk relevante mutationer, tilføjer til enhver analytisk ufølsomhed. Baseret på disse overvejelser, vi foretrækker sekventering-baserede mutation afsløring løbet genotypning. Selvom vores stikprøve størrelse også er begrænset til omfattende beregne sensitivitet og specificitet af mutation afsløring, mener vi, at den slående underlegenhed af konventionel Sanger sekventering til at opdage terapeutisk relevante onkogen mutationer er af stor interesse for molekylære patologer og kliniske onkologer.

sammenfattende har vi vist, hvordan sekventering teknologier med ringere følsomhed kan ikke opdager klinisk relevante onkogen mutationer hos kræftpatienter. Vi konkluderer derfor, at enhver ny metode til klinisk mutation diagnostik bør grundigt valideret mod massivt parallel sekventering for at give en korrekt genetisk analyse som grundlag for molekylært målrettet terapi.

Støtte oplysninger

figur S1.

følsomhed undersøgelse af dideoxysekventering og Pyrosekventering. Forskellige blandinger af PCR-produkter fra vildtype eller G12S mutant NSCLC cellelinier blev anvendt til at bestemme følsomheden grænse for dideoxysekventering (~20-30%) og pyrosekventering (~ 5%). Mutation specifikke signaler er markeret med en asterisk i dideoxy elektroferogrammer (venstre paneler) og røde pile i programmer (højre paneler). Mut, mutation; . WT, vildtype

doi: 10,1371 /journal.pone.0019601.s001

(TIF)

Figur S2.

Følsomhed og linearitet test af

EGFR

exon 19 pyrosekventering assay. Blandinger af E746_A750del (Del-1a) mutanten og vild-type PCR-produkter af NSCLC cellelinjer blev anvendt til at analysere grænse mutationen påvisning og analyse linearitet. Assayet er følsomt over for et minimum på 5 til 10% af muterede alleler. Mutation specifikke signaler er markeret med røde pile. del, sletning; Mut, mutation; . WT, vildtype

doi: 10,1371 /journal.pone.0019601.s002

(TIF)

Figur S3.

Pyrosequencing analyse af

EGFR

exon 19 i NSCLC tumorprøver. (A)

EGFR

exon 19 sletning identificeret i prøven med 50% af tumorceller indhold, der ikke tidligere er identificeret ved dideoxysekventering; (B) Ingen væsentlig mutationsdetektion i prøve 13a med et indhold tumorcelle 5%. Forventet position mutation specifikke signaler er markeret med rød pil. del, sletning; Mut, mutation; . WT, vildtype

doi: 10,1371 /journal.pone.0019601.s003

(TIF)

Figur S4.

Pyrograms af

EGFR

exon 19 mutant NSCLC cellelinje og tumorprøver. (A) Del-B mutation i cellelinie HCC827; (B-D) Tumor prøver med et højt tumor celle indhold muliggør præcis karakterisering af den enkelte mutation;