PLoS ONE: Integrativ Analyse af somatiske mutationer Ændre MicroRNA Målretning i Cancer Genomes

Abstrakt

Bestemmelse af funktionelle konsekvenser af somatiske mutationer er afgørende for at forstå tumorgenese og metastase. Nylige sekvenser af flere kræftformer har tilvejebragt omfattende lister over somatiske mutationer tværs af hele genomer, muliggør undersøgelse af den funktionelle virkning af somatiske mutationer i ikke-kodende regioner. Her studerer vi somatiske mutationer i 3’UTRs af gener, der er blevet identificeret i fire kræftformer og beregningsmæssigt forudsige, hvordan de kan ændre miRNA målretning potentielt resulterer i dysregulering af ekspressionen af ​​de gener, huser disse mutationer. Vi finder, at somatiske mutationer skaber eller forstyrre formodede miRNA target sites i 3’UTRs af mange gener, herunder flere gener, såsom

MITF

,

EPHA3

,

TAL1

,

SCG3

, og

GSDMA

, som tidligere har været forbundet med kræft. Vi integrerer også de somatiske mutationer med germline mutationer og resultaterne af associationsstudier. Konkret identificerer vi formodede miRNA target sites i 3’UTRs af

BMPR1B

,

KLK3

, og

SPRY4 Hoteller, som bliver afbrudt af både somatiske og germline mutationer og, også , er i koblingsuligevægt blokke med høj scoring markører fra kræft associationsstudier. Den somatisk mutation i

BMPR1B

ligger i et målsted af MIR-125b; germline mutationer i dette målområdet har tidligere været både vist at forstyrre reguleringen af ​​

BMPR1B

af miR-125b og forbundet med kræft

Henvisning:. ZIEBARTH JD, Bhattacharya A, Cui Y (2012) Integrativ Analyse af somatiske mutationer Ændre MicroRNA Målretning i Cancer genomer. PLoS ONE 7 (10): e47137. doi: 10,1371 /journal.pone.0047137

Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA

Modtaget: May 10, 2012; Accepteret: September 11, 2012; Udgivet: 16 oktober, 2012 |

Copyright: © ZIEBARTH et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist støttet af The University of Tennessee center for Integrativ og Translational Genomics. Ingen yderligere ekstern finansiering blev modtaget til denne undersøgelse. Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

De genomer fleste voksne mennesker kræftformer indeholder tusindvis af somatiske mutationer [1], og et kritisk aspekt af kræftforskningen er at afgøre, hvilke af disse somatiske mutationer har afgørende funktionel indvirkning på biologiske processer relateret til tumorgenese og metastase [2 ], [3], [4]. Indtil for nylig har bestræbelser på sekvens kræft genomer fokuseret på effekten af ​​mutationer i kodende regioner og identificere ikke-synonyme punktmutationer, små rammeskift sletninger eller store genomiske rearrangementer, der kan for eksempel skabe fusioner gener [5], [6] . Med de hurtige sekventering teknologier, er det blevet muligt at sekventere og sammenligne hele genomer af normale og cancer væv fra det samme individ for at identificere somatiske mutationer [7]. For nylig hele genomer af normale og cancer væv hos patienter med lungecancer [8], melanom [9], har småcellet lungecancer (SCLC) [10], og prostatacancer [11] blevet sekventeret, hvilket giver somatiske mutationer i disse cancere i både kodende og ikke-kodende regioner. Men der er, til dette punkt, været begrænset undersøgelse af effekten af ​​ikke-kodende somatiske mutationer på kræft patogenese.

En af følgerne af somatiske mutationer i ikke-kodende regioner, der har potentiale til at få væsentlig indvirkning cellulære funktioner forbundet med kræft er den ændring af microRNA (miRNA) målretning. MikroRNA’er er små, ikke-kodende RNA’er, der fungerer som posttranskriptionel regulatorer af mRNA-ekspression, typisk ved at inhibere translation eller forårsager nedbrydningen af ​​deres mRNA-mål. Mange miRNA er op- eller nedreguleret i kræft, hvilket indikerer, at de fungerer som onkogener eller tumor undertrykkere henholdsvis; og miRNA udtryk profiler er blevet anvendt til præcist klassificere kræft undertyper [12]. MikroRNA’er er blevet vist at styre mange vigtige cellulære processer, der er ændret i cancere, herunder differentiering, proliferation og apoptose [13]. Funktionen af ​​miRNA er særligt følsomme over for genetiske varianter, fordi komplementaritet mellem frøet region af miRNA og en mRNA-sekvens ofte er påkrævet for miRNA målretning [14]. Det er derfor ikke overraskende, at germlinie-mutationer, som afbryder miRNA målretning har vist sig at spille en vigtig rolle i mange sygdomme [15], [16], [17], [18], herunder flere typer af kræft [19], såsom melanom [20], leukæmi [21], [22] og brystcancer [23], [24], samt i oncogen transformation [25]. Kønscellelinie mutationer, der ændrer miRNA target sites er også blevet undersøgt som værende de funktionelle sygdomsfremkaldende varianter, ligger til grund for resultaterne af genom-dækkende forening undersøgelser (GWAS) [26], [27]. For nylig, en somatisk mutation i 3’UTR af

TNFAIP2

, en kendt mål af

PRAM1

onkogen, skaber en ny miRNA target site, der resulterer i en reduktion af

TNFAIP2

udtryk i en patient med akut myeloid leukæmi [28]. Dette eksempel illustrerer potentialet for somatiske mutationer til at ændre miRNA målretning og bidrage til patogenese, men der har, til dette punkt, været begrænset undersøgelse af somatiske mutationer beliggende i miRNA target sites.

Her har vi systematisk undersøge, hvordan somatiske mutationer kan ændre miRNA målretning (figur 1). Først, vi indsamler somatiske mutationer i 3’UTRs, de genomiske regioner, der typisk anses for at være de mest almindelige bindingssteder af miRNA, opnået fra hele genom sekvenser af fire kræft og analysere mønstre i disse 3’UTR mutationer. Dernæst vi beregningsmæssigt forudsige, hvor 3’UTR somatiske mutationer ændrer miRNA target sites og identificere, hvilke af disse somatiske mutationer kan være særligt relevant for kræft patogenese. Vi afgør somatiske mutationer, der begge ligger inden for gener, der er blevet knyttet til kræft og ændrer formodede målområder af kræft-relaterede miRNA. Vi forsøger også at knytte ændring af miRNA målrettet med kræft gennem integration af disse somatisk mutation med resultaterne af associationsstudier. Vi identificerer tre miRNA target sites, der er ændret af både somatiske og germline mutationer i koblingsuligevægt blokke med høj scoring markører identificeret i GWAS af kræft.

Somatiske mutationer i formodede miRNA target sites er forbundet med cancer-relaterede gener og miRNA samt resultaterne af kræft associationsstudier.

resultater

Mønstre af somatiske mutationer i 3’UTRs

Vi indsamlede i alt 610 somatiske mutationer i 3’UTRs fra fire cancere (SCLC, melanom, lunge- og prostata). Med undtagelse af prostatacancer, blev somatiske mutationer bestemt ud fra hele genomet sekventering af de enkelte prøver; syv prøver blev sekventeret for prostatakræft. Ingen af ​​de somatiske mutationer i 3’UTRs blev identificeret i flere typer cancer. Kun 1 (et T C substitution ved 30.693.148 i 3’UTR af

Tubb Hoteller, som blev fundet i to prostatakræft prøver) af 152 (0,66%) somatiske mutationer i 3’UTRs identificeret i prostatakræft var findes i flere prøver. Forekomsten af ​​somatiske mutationer i multiple prøver prostatakræft tværs af hele genomet var ligeledes sjældne, da kun 116 af 28626 (0,41%) af de somatiske mutationer i prostatacancer blev fundet i multiple prøver hele genomet. For at sammenligne de typer af substitutioner, der fandt sted i hver kræft type, beregnede vi hyppigheden af ​​hver klasse af enkelt base substitution (figur 2). Fordelingerne af substitutioner i 3’UTRs varierede tværs typer af kræft. For eksempel er størstedelen af ​​melanom substitutioner var G A /C T, mens de mest udbredte mutationer i både lunge- og SCLC-prøver var G T /C A substitutioner. Disse tendenser er aftalt med af de mutationer findes i alle regioner af genomet for hver type kræft, og generelt, hvor stor en procentdel af mutationer for hver type substitution var ens for 3’UTRs og for hele genomet. Tilsammen indikerer disse resultater, at mutationer i 3’UTRs har lignende årsager (f.eks ultraviolet eksponering for melanom, rygning for lungekræft) som mutationerne i hele genomet.

Den procentdel af hver klasse af substitution blandt somatiske mutationer i 3’UTRs (sort søjle) eller på tværs af hele genomet (hvid bjælke) er vist for (A) lungecancer, (B) SCLC, (C) melanom, og (D) prostatacancer.

Vi undersøgte også, hvis somatiske mutationer i 3’UTRs var mere tilbøjelige til at være placeret ved 5 ‘enden eller 3’-enden af ​​3’UTR. For hver somatisk mutation, sammenlignede vi afstand fra starten af ​​3’UTR (dvs. enden af ​​den endelige exon) til mutation til den samlede længde af 3’UTR. Vi tælles derefter antallet af somatiske mutationer i forskellige sektioner af 3’UTRs under anvendelse af en rullende vindue med en bredde på 5% og fandt, at antallet af somatiske mutationer varierede betydeligt langs 3’UTR (figur 3). Det overordnede mønster af fordelingen af ​​alle de somatiske mutationer (figur 3a) svarer nærmest det, der opnås fra lungecancer (figur 3b), den undersøgelse, der producerede den største antal mutationer. I lungekræft (figur 3b), der er mange mutationer umiddelbart nedstrøms for udløbet af den endelige kodning exon, med antallet af mutationer stærkt faldende som afstanden nærmede 10% af 3’UTR længde.

I hver somatisk mutation, den procentdel af afstanden fra starten af ​​3’UTR til somatisk mutation sammenlignet med den samlede længde af 3’UTR blev beregnet. Figuren viser antallet af mutationer i rullende vinduer af 5% af 3’UTR længde for somatiske mutationer i (A) alle kræftformer, (B) lungecancer, (C) SCLC, (D) melanom, og (E) prostatakræft.

Somatiske mutationer i 3’UTRs ændre miRNA målretning

Mens en komplet forståelse af, hvordan mRNA mål for en miRNA vælges er endnu ikke belyst, sekvens komplementaritet mellem nucleotider ved 5′-enden, eller frø region, af den modne miRNA sekvens og en mRNA target site, som er typisk i 3’UTR, er fælles for mange miRNA-mRNA pairs. Snesevis af beregningsmetoder til forudsigelse af målene i miRNA er blevet udviklet, baseret på komplementaritet, samt andre kriterier, herunder bevarelse af målstedet på tværs af arter, target site tilgængelighed i den sekundære struktur af mRNA’et, sekvensen rammerne af målområdet og termodynamik bindende [29], [30]. Vi brugte to metoder til at identificere somatiske mutationer med potentiale til at påvirke miRNA målretning (tabel S1). Først, vi beregnede kontekst + scores ved hjælp af den nyeste version af Targetscan [31], en af ​​de mest udbredte og mest effektive miRNA forudsigelsesværktøjer [32], [33], for to sæt 3’UTR sekvenser, det ene indeholder allelen fundet i det normale væv og en med allelen findes i kræftvæv. Vi derefter identificeret somatiske mutationer, der var placeret inden for målsteder forudsagt af Targetscan og påvirket kontekst + scoringer. For det andet, vi forsøgt at skabe et mere rummeligt liste over 3’UTR somatiske mutationer, der påvirker miRNA målretning ved at bestemme de mutationer, der ændrer 6mer, 7mer eller 8mer sites komplementære til miRNA frø. Denne anden tilgang var motiveret af seneste analyse af mRNA sekvenser er omfattet af miRNA i CLIP-Seq eksperimenter i humane [34] og hits-CLIP eksperimenter i mus [35], der fandt, at mens længere (fx 7 nt og 8 nt) matcher mellem mRNA-sekvensen og miRNA frø havde højere specificiteter, de fleste funktionelle målsteder indeholdt kun 6 nt matcher [36].

betragtning af det store antal unikke miRNA frø, forventede vi at finde, at de fleste somatiske mutationer enten sprængte eller oprettet mindst en 6mer match til en miRNA frø (tabel S1). 608 af de 610 somatiske mutationer i 3’UTRs ændret mindst 6mer lang potentiale miRNA-bindingssted og 525 mutationer ændret kontekst + scores beregnet ved Targetscan 6,0 i mindst én miRNA. Vi har forsøgt derefter at identificere somatiske mutationer, der havde en høj prioritet for at have en rolle i kræft patogenese. Først valgte vi kun miRNA-mRNA-par for hvilke somatisk mutation resulterede i en størrelsesorden ændret med mere end 0,2 for forbindelse + score på en miRNA målretning mRNA’et, tilvejebringe de somatiske mutationer i målsteder, der var i top 15% af dem, mest sandsynligvis være funktionel baseret på kontekst + score. Dernæst vi begrænset de påvirkede formodede mål sites baseret på miRNA og fjernet miRNA, der enten havde lav udtryk (færre end 100 i alt læser) i RNA-Seq eksperimenter indsamlet i miRBase [37] eller ikke er blevet tidligere var forbundet med kræft i PhenomiR database [38]. Endelig har vi brugt Cancer Gene Census [39] og andre litteratur kilder til at identificere gener, der er kendt tumorsuppressorer, onkogener, eller har andre funktionelle foreninger med kræft. Tabel 1 indeholder et udvalg af de somatiske mutationer, der ændrede miRNA målretning og mødte disse kriterier. Vi undersøgte også vævs- og kræft-specifikke miRNA udtryk for at identificere miRNA, der har vist sig at være stærkt til udtryk i den særlige væv eller kræft, hvor somatiske mutationer blev identificeret (tabel S1). Flere af de somatiske mutationer i tabel 1, herunder i

TAL1

,

BMPR1B

,

KDM5A

,

SCG3

, og

BCAS3

påvirket målsteder af miRNA, der har vist sig at blive udtrykt i det samme væv, hvor miRNA blev identificeret.

af særlig interesse er onkogener med somatiske mutationer, der forstyrrer undertrykkere miRNA målretning og tumor med somatiske mutationer, der skaber nye miRNA-mål, da disse mutationer potentielt kunne forklare de respektive op- og nedregulering af disse gener i kræft (mutationer opfylder dette kriterium, er vist med fed skrift i tabel 1). For eksempel forøget ekspression af

TAL1

[40],

SCG3

[41] og

GSDMA

[42], [43] er blevet observeret i kræft, og somatisk mutationer i 3’UTRs af disse gener forstyrre formodede mål for miRNA, der er blevet forbundet med kræft. Afbrydelsen af ​​disse målstederne kan forhindre regulering af indholdet af disse gener ved miRNA, hvilket fører til højere udtryk. I modsætning hertil

EPHA3

[44] og

MITF

[45] er under-udtrykt i kræft eller har vist sig at virke som tumorsuppressorer; de somatiske mutationer kan skabe nye målsteder, der fører til øget inhibering af translation eller nedbrydning af mRNA’erne. Især en af ​​de somatiske mutationer udvalgt af denne metode påvirket en eksperimentelt valideret target site af miR-125b i

BMPR1B

[46], som vil blive undersøgt nærmere i næste afsnit.

GWAS- og CGAS-orienteret funktionel analyse af somatiske mutationer, der ændrer miRNA målretning

genom-bred og kandidat gen associationsstudier har identificeret et stort og voksende, antal genomiske steder huser germline mutationer forbundet med øget risiko for kræft. I mange tilfælde er de specifikke germlinie mutationer, der ligger til grund disse foreninger og deres funktionelle virkninger forbliver ukendte; imidlertid kimcellelinje mutationer, der ændrer miRNA målretning er blevet identificeret som lovende kandidater til potentielt forklare den øgede risiko for flere af cancere [19]. Derfor forsøgte vi at integrere de somatiske mutationer der ændrer miRNA målretning med kimcellelinje mutationer og resultaterne af associationsstudier. Vi søgte at identificere miRNA target sites i koblingsuligevægt med høje scoring markører fra associationsstudier, der er ændret af både kimlinie mutationer og somatiske mutationer identificeret i kræft. Konkret har vi identificeret både eksperimentelt understøttet og beregningsmæssigt forudsagte miRNA målsteder ændret af somatiske mutationer, der også ændres ved kimcellelinje mutationer, og derefter, bestemt hvis målet var i samme haplotype blok så høje scoring markører fra kræft associationsstudier. Tre gener,

BMPR1B

,

KLK3

, og

SPRY4

, indeholdt miRNA target sites ændret af både somatiske og germline mutationer, der var i sammenkædning disequilbrium blokke med høj scoring forening undersøgelse markører (tabel 2 og figur 4).

(a) Forstyrrelse af et målområde for miR-125b i 3’UTR af

BMPR1B

. (B) Forstyrrelse af et målområde for miR-210 i 3’UTR af

KLK3

. (C) Forstyrrelse af et målområde for miR-608 i 3’UTR af

SPRY4

.

3’UTR af

BMPR1B

indeholder et bindingssted for mIR-125b, der afbrydes af både en somatisk mutation, der blev identificeret i lungekræft (CHR4: g.96075969G T) og en kimcellelinje SNP (rs1434536). Denne målområdet er også i en haplotype blok med rs11097457, en af ​​de 100 højest scorende markører i Cancer genetiske markører af følsomhed (CGEMS) undersøgelse, som er forbundet med risikoen for brystkræft [46] (figur 4a). R

2 værdi for korrelation mellem rs11097457 og rs1434536 i 1000 genomer Project [47] er 0.82. Målretning af

BMPR1B

af miR-125b og muligheden for, at genetiske varianter forstyrre dette målområdet og spille en rolle i cancer er tidligere blevet undersøgt [46]. Saetrom et al. fandt, at rs1434536 var i stærk bindingsuligevægt med to høje scoring markører i en brystkræft forening undersøgelse, bekræftede foreningen i en uafhængig brystkræft kohorte, og viste, at SNP forstyrret regulering af

BMPR1B

af miR-125b.

Både en somatisk mutation (CHR19: g.51363764A C) og en kimcellelinje mutation (rs1803136) i 3’UTR af

KLK3

, et gen, hvis ekspression er almindeligt anvendt som et diagnostisk markør i prostatakræft [48], forstyrret forudsagt målområder for miR-675, miR-138, og miR-210. Disse målsteder var i samme bindingsuligevægt blok, og kun ~850 basepar væk fra rs2735839 (figur 4b), som var stærkt forbundet med øget risiko i et GWAS af prostatacancer [49]. Desuden somatisk mutation (CHR19: g.51363764A C) blev også identificeret i en patient med prostatacancer [11]. Der har også været tidligere dokumentation for, at MIR-675 [50], MIR-210 [51] og MIR-138 [52] regulere cancercelleproliferation. Vi fandt også en somatisk mutation (CHR5:. G 141691500G T) og en kimlinie mutation rs72117814 inden en forudsagt bindingssted for MIR-608 i 3’UTR af

SPRY4

som var placeret i samme bindingsuligevægt blok som rs4624820, en højtstående markør i en testikelkræft GWAS [53], [54] (figur 4c).

SPRY4

inhiberer mitogen-aktiveret protein kinase pathway (MAPK), som aktiveres af KITLG-KIT pathway, som har været forbundet med testikelkræft [53]. Fordi kimlinie mutationer, der forstyrrer målområder i

SPRY4

KLK3

er ikke inkluderet i 1000 genomer Project eller HapMap data, vi var ikke i stand til at beregne sammenhængen mellem kimlinie SNPs og højtstående GWAS markører.

diskussion

Nyt sekventering af hele genomer af normale og cancer væv fra den samme person har givet omfattende lister over somatiske mutationer. Mens der har været flere bestræbelser på at identificere den funktionelle betydning af somatiske mutationer i kodende regioner [5], [55], ikke-kodende somatiske mutationer har modtaget relativt lidt opmærksomhed, på trods af betydningen af ​​disse regioner til genregulering. En rapport undersøgte satserne for ikke-kodende somatiske mutationer i myelomatose og observeret, at mange ikke-kodende mutationer var nær kodende regioner med kendt somatisk hypermutation og at mutationen frekvens i nogle-ikke-kodende områder var større end forventet tilfældigt [ ,,,0],56], men den funktionelle virkning af disse ikke-kodende mutationer blev ikke undersøgt. Her har vi gjort en indledende indsats for at identificere ikke-kodende somatiske mutationer, der har potentiale til at forårsage dysregulering af genekspression og bidrage til kræft patogenese. Konkret har vi fokuseret på somatiske mutationer beliggende i 3’UTRs og undersøgt, hvordan disse mutationer kan ændre miRNA målretning. Vi fandt, at fordelingen af ​​de forskellige typer af enkelt basesubstitutioner blandt somatiske mutationer i 3’UTRs varierede for forskellige typer af kræft, men aftalt med fordelingerne på tværs af hele genomet i hver kræft type (figur 2). Vi undersøgte også fordelingen af ​​miRNA tværs af 3’UTRs og fundet, at, for lungekræft, der var et stort antal somatisk mutation placeret i 3’UTR meget nær den endelige kodning exon. Fordelingen af ​​mutationer tværs gener er blevet anvendt til at bestemme den selektive anvendelse af DNA-reparation, og det har vist sig, at DNA-reparation er mere udbredt blandt transskriberede strenge sammenlignet med ikke-transkriberede strenge og til 5′-enden af ​​gener i forhold til 3 ‘ende [9]. Mens det store antal somatiske mutationer i 3’UTR nær den endelige kodning exon i lungekræft er kun en indledende resultat baseret på en relativt lille antal somatiske mutationer, observation af lignende opførsel som flere somatiske mutationer identificeres kan muliggøre øget forståelse af DNA-reparation i 3’UTR.

en måde, hvorpå somatiske mutationer i 3’UTRs kan have en funktionel effekt er, hvis de konsekvenser miRNA målretning ved at forstyrre eller skabe miRNA target sites. Vi specifikt identificeret somatiske mutationer, der er forudsagt til at forstyrre miRNA target sites i gener, herunder

TAL1

,

SCG3

, og

GSDMA

, som er over-udtrykt i kræft og mutationer, der forventes at skabe nye miRNA target sites i gener, herunder

MITF

og

EPHA3

, som er underexpressed i kræft. Selv om det er ligetil at identificere, hvor somatiske mutationer kan påvirke miRNA funktion gennem disse to tilstande (onkogener med forstyrret sites og tumorundertrykkere med skabt sites), er det sandsynligt, at dysregulering af miRNA funktion i kræft opstår gennem mere komplekse forhold, der kan ikke være i overensstemmelse for alle typer af kræft. For eksempel adskillige miRNA, herunder MIR-17-19b klynge [12], [57], [58], og gener, herunder

CDH1

[59], har vist sig at have oncogene egenskaber i nogle kræftformer virker samtidig som tumorsuppressorer i andre. Derudover miRNA øge ekspressionen af ​​deres mål i visse tilfælde [60].

Greenberg et al. [61] undersøgte den globale effekt af somatiske mutationer i melanom, lungekræft og leukæmi. De fandt, at mutationerne i modermærkekræft faldt bindingen af ​​miRNA til 3’UTRs, men ikke observere så signifikant af et fald i bindende for somatiske mutationer i andre kræftformer. De tilskrives dette resultat til UV-inducerede mutationer findes i melanom er primært Strong-til-Svage mutationer (dvs. de mutationer, der reducerer termodynamisk hybridisering stabilitet). Mens vi fokuseret på, hvordan de somatiske mutationer påvirkede komplementaritet mellem miRNA frø og target sites, og ikke virkningen af ​​mutationerne på bindingsenergi, flere af vores resultater er aftalt med konklusionerne fra Greenberg et al. Vi fandt, at frekvenserne for de enkelte basesubstitutioner lige stærk i alle cancertyper (figur 2), hvilket resulterer i mere stærk-til-Svag mutationer i melanom end andre kræftformer. Vi kan også bruge vores resultater (tabel S1) til at sammenligne med Greenberg et al. ved at beregne forholdet mellem antallet af formodede miRNA målsteder der afbrydes af somatiske mutationer til antallet af formodede miRNA målsteder skabt af somatiske mutationer. Det sprængte til skabt målsted forholdet er 1,18 for melanom mutationer, som kan sidestilles med forholdet fundet i SCLC (1,19) og højere end den, der findes i prostata (1,12) og lungecancer (1,08), hvilket antyder, at det er muligt, at somatiske mutationer i melanom resultat i et samlet fald i miRNA bindende i sammenligning med normale væv og andre kræftformer.

Vi har forsøgt at finde frem til vigtige funktionelle somatiske mutationer ved at udnytte resultaterne af associationsstudier. Vi identificerede target websteder, der indeholder både somatiske og germline mutationer og er i koblingsuligevægt blokke med høj scoring markører fra associationsstudier af kræft. Denne procedure integrerer to informationskilder indikerer muligheden for, at ændring af målområdet spiller en rolle i cancer; kimcellelinjen mutation i målområdet er en mulig årsag til den øgede risiko forbundet med den sammenkædede markør i foreningen undersøgelsen, mens den somatiske mutation i målet kan spille en rolle i tumorigenese i andre individer. Vi identificerede tre målsteder placeret i

BMPR1B

,

KLK3

, og

SRPY4 Hoteller, som indeholder både somatiske og germline mutationer og er forbundet med associationsstudier. Både de gener, der indeholder disse somatiske mutationer og de miRNA, der er målrettet disse steder har været tidligere var forbundet med kræft. En 3’UTR somatisk mutation i

BMPR1B

identificeret i en lungecancerpatient forstyrrer det specifikke mål-stedet i MIR-125b, som tidligere er undersøgt for sin rolle ved cancer [46]. Målet websted indeholder en SNP, rs1434536, der er i koblingsuligevægt med to høje scoring markører i en brystkræft forening undersøgelse og resultater i afbrydelse af reguleringen af ​​

BMPR1B

af miR-125b. Den somatiske mutation viser en anden vej, hvorigennem regulering af genet ved miRNA kunne blive forstyrret, potentielt bidrage til tumorigenese. Mens der ikke har været så stærk eksperimentel støtte for mutationer forstyrre reguleringen af ​​

KLK3

[49] og

SPRY4

[53], [54] af miRNA i kræft, begge af disse gener har stærke associationer med kræft. Niveauer af

KLK3

er almindeligt anvendt til diagnosticering af prostatacancer [48], og det somatiske mutation ændrer miRNA målretning af

KLK3

blev identificeret i prostatakræft.

SPRY4

er involveret i KITLG-KIT vej, der har været forbundet med kræft [53]. Derudover to somatiske mutationer (chr12: g.88889449G A og chr12: g.88887136G A), i formodede bindingssteder for miR-203 og miR-183, henholdsvis var placeret i 3’UTR af

KITLG

. Ekspression af MIR-183 har vist sig at være korreleret med ekspression af MIR-203 [62], og begge miRNA er involveret i suppression af ekspression af stamcelle faktorer i cancerceller [62] og i proliferation af cancer [62], [ ,,,0],63].

KITLG

somatiske mutationer er i en bindingsuligevægt blok med rs995030, en markør SNP rs995030 som er stærkt forbundet med testikelkræft risiko [53]. Derfor er disse somatiske mutationer i 3’UTRs af

SPRY4

KITLG

er lovende kandidater til bidrag til tumorigenese ved dysregulering af KITLG-KIT vej.

Mens den aktuelle undersøgelse var i stand til at identificere somatiske mutationer, der kan påvirke miRNA målretning og spiller en rolle i kræft patogenese, er det begrænset af flere faktorer. Først, alle undtagen en af ​​de somatiske mutationer undersøgt her blev identificeret i en enkelt patient, og derfor mutationerne kan ikke almindeligvis findes i andre patienter eller kan ikke være generaliseres til andre populationer og kræft ætiologier. For det andet, på grund af det relativt lille antal eksperimentelt kendte miRNA bindingssteder og en manglende forståelse af detaljerne i miRNA målretning denne undersøgelse var, i de fleste tilfælde, kun i stand til at identificere somatiske mutationer, der ændrer forudsagte miRNA target sites. Konkret har vi fokus på, hvordan somatiske mutationer indvirkning sekvenser inden 3’UTRs komplementære til miRNA frø, da disse funktioner har været i fokus for de fleste miRNA rettet forudsigelse algoritmer; Men denne tilgang forsømmer hvordan somatiske mutationer i andre steder i et målområde, såsom 3 ‘kompenserende sites, kan påvirke binding. Og mens 3’UTRs traditionelt har været menes at huse de fleste af miRNA target sites, har flere nylige eksperimenter vist, at 5’UTRs [64] og kodende områder [65] også indeholde funktionelle miRNA targets. I de kommende år forventer vi, at forbedringer i sekventering teknologier kan være i stand til at løse disse begrænsninger, stigende forståelse af, hvordan ændring af miRNA målretning af kimcellelinje og somatiske mutationer spiller en rolle i kræft og andre sygdomme i de kommende år. Nye eksperimentelle teknikker, såsom CLIP-Seq [34], [35], har løftet om at give både omfattende lister over eksperimentelt understøttede miRNA target sites og grundlag for en mere fuldstændig forståelse af miRNA målretning potentielt forbedres beregningsmæssige mål forudsigelser. Desuden vil antallet af somatiske mutationer og kræft-associerede markører fra GWAS sandsynligvis fortsætte med at vokse hurtigt, og metoder, der integrerer disse ressourcer vil derfor blive mere og mere frugtbar. Især vil øge antallet af kendte somatiske mutationer muliggøre identifikation af mutationer der er almindeligt forekommende i cancer. Mens vi var at bestemme et målsted (target site af miR-125b i

BMPR1B

), der tilbød at kombinationen af ​​eksperimentel støtte, afbrydelse af både kimlinje og somatiske mutationer, og links med associationsstudier, disse udviklingslande ressourcer kan snart gøre det muligt at identificere mange lignende høj prioritet miRNA mål.

materialer og metoder

Kilder til somatiske mutationer i 3’UTRs

somatiske mutationer blev indsamlet fra det supplerende materiale af de oprindelige papirer for lunge [8] og prostata [11] cancer og fra de ikke-kodende varianter af COSMIC database [66] for SCLC [10] og melanom [9]. Somatiske mutationer blev bestemt ved hjælp af SOLID, for SCLC [10], og Illumina GAII platforme melanom [10] og prostatakræft [11]. De lungekræft mutationer [8] blev bestemt ved hjælp af 31- til 35-basen mate-parret læser fra DNA nanoarrays fremstillet af adsorbere sekvens substrat til silicium substrater med gitter-patterened arrays. For at bestemme somatiske mutationer, der er placeret i 3’UTRs, vi sammenlignet placeringen af ​​mutationen med start- og slutpositionen for 3’UTRs af RefSeq gener fra UCSC genom browser [67], [68]. Når det er nødvendigt, brugte vi liftover værktøj i Galaxy web-server [69] for at konvertere genomiske placeringer til GRCh37 /hg19 samling af det humane genom.