PLoS ONE: Nye Snail1 Target Proteiner i human tyktarmskræft identificeret ved proteomanalyse

Abstrakt

Baggrund

transskription faktor Snail1 inducerer epitel-til-mesenkymale overgang (EMT), en proces ansvarlig for erhvervelsen af ​​invasiv under tumorigenese. Adskillige transkriptom studier har rapporteret Snail1-regulerede gener i forskellige celletyper, mange af dem involveret i celleadhæsion. Imidlertid har kun få studier anvendt proteomics som et værktøj til karakterisering af proteiner medierer EMT.

Metodologi /vigtigste resultater

Vi identificeret ved proteomisk analyse ved hjælp af 2D-DIGE elektroforese kombineret med MALDI- TOF-TOF og ESI-lineær ion trap massespektrometri en række proteiner med variable funktioner, hvis ekspression moduleres af Snail1 i SW480-ADH human colon cancerceller. Valideringen blev gennemført ved Western blot og immunofluorescens analyser. Snail1 undertrykt flere medlemmer af 14-3-3-familien af ​​phosphoserin- /phosphothreonin bindingsproteiner og også ekspressionen af ​​spredning-associeret protein 2G4 (PA2G4), som hovedsagelig blev lokaliseret på de nukleare Cajal organer. I modsætning hertil ekspression af to proteiner involveret i RNA-bearbejdning, spaltningen og polyadenylering specificitet faktor subunit 6 (CPSF6) og splejsning faktor prolin /glutamin-rig (SFPQ), var højere i Snail1-udtrykkende celler end i kontroller. Reguleringen af ​​14-3-3ε, 14-3-3τ, 14-3-3ζ og PA2G4 af Snail1 blev gengivet i HT29 kolon kræftceller. Desuden fandt vi en omvendt korrelation mellem 14-3-3σ og Snail1 udtryk i humane kolorektale tumorer.

Konklusioner /Betydning

Vi har identificeret et sæt af nye Snail1 target proteiner i tyktarmskræft at udvide de cellulære processer, der berøres af Snail1 og dermed dens relevans for celle funktion og fænotype

Henvisning:. Larriba MJ, Casado-Vela J, Pendás-Franco N, Peña R, García de Herreros A, Berciano MT, et al. (2010) Nye Snail1 Target Proteiner i human tyktarmskræft Identificeret af proteomanalyse. PLoS ONE 5 (4): e10221. doi: 10,1371 /journal.pone.0010221

Redaktør: Juan Valcarcel, Centre de Regulació Genòmica, Spanien

Modtaget: Marts 4, 2010; Accepteret: 26 Marts 2010; Udgivet: 20. april, 2010

Copyright: © 2010 Larriba et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Ministerio de Ciencia e Innovación Spanien (SAF2007-60341, BIO2006-07689, ISCIII-Retic RD06 /0020/0009 og RD06 /0020/0040), Comunidad de Madrid (S-GEN-0266/2006) og Europæiske Union (MRTN-CT-2005 til 019.496, NucSys). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

transskription faktor Snail1 regulerer biologi fibroblaster og dens opregulering i epitelceller forårsager en ændring til en mesenchymatic fænotype, en proces kendt som epitel-til-mesenkymale overgang (EMT). Dette er en transdifferentiering skift hvori epitelceller taber klæbeevne og polaritet og erhverve spindelen morfologi og vandrende kapacitet karakteristisk for fibroblaster som følge af en drastisk ændring i genekspressionsprofilen [1], [2]. EMT spiller vigtige fysiologiske roller under embryogenese og sårheling, og er også afgørende for erhvervelse af tumorale invasiv, det indledende trin af metastatisk kaskade i kræft [1], [2].

Snail1 synes at have en mester rolle i EMT, selv om flere andre faktorer, såsom Snail2 (Slug), Zeb1 (δEF1), Zeb2 (Sip1), Twist1, E47 og E2-2 også er kendt for at inducere eller bidrage til EMT i forskellige typer af celler [2 ], [3]. Disse faktorer fremmer delvis forskellige genekspressionsprofiler der har det til fælles undertrykkelsen af ​​gener, der koder adhæsionsproteiner (E-cadherin, Occludin og flere claudins) og induktion af mesenchymale markører, såsom vimentin, fibronectin og proteaser og faktorer, der fremmer celle bevægelighed [ ,,,0],3], [4]. Snail1 var den første karakteriseret repressor af invasionen suppressor genet

CDH1 Hoteller, som koder for den afgørende vedhæftning protein E-cadherin [5], [6]. Desuden har Snail1 nylig blevet vist at aktivere Wnt /β-Catenin signal- og nuklear faktor

kappa

B-aktivitet [7], [8], og det ophæver inhiberingen af ​​Wnt /β-Catenin pathway forårsaget af antitumormakrofagaktivatoren forbindelse 1α, 25-dihydroxyvitamin D

3 [9].

Snail1 opreguleres i flere humane cancere og er ofte forbundet med invasivitet, metastaser og dårlig prognose [3]. Snail1 RNA kan ikke påvises i normale colon mucosa men det bliver opreguleret i 60-70% af coloncancer [10] – [12]. En nylig undersøgelse har vist, at Snail1 protein udtrykkes i 79% af colontumorer, sædvanligvis i det tumor-stroma interfase. Snail1 findes i både epithel- tumorvæv og tilstødende stroma i 56% af colontumorer, mens der i 21% af tilfældene er det kun til stede i stromaceller med fibroblastisk fænotype [13].

En række undersøgelser har fokuseret på den transkriptomisk analyse af EMT fremmes af Snail1 og andre transkriptionsfaktorer, eller af gener eller midler, såsom onkogene Ras eller transformerende vækstfaktor β, der inducerede dem [4], [14] – [17]. Imidlertid har kun få studier anvendt proteomics som et værktøj til karakterisering af proteiner mægle EMT [18]. Størstedelen af ​​disse studier har beskæftiget 2D-PAGE efterfulgt af MALDI-TOF-massespektrometri til at identificere proteiner differentielt udtrykt i tumorvæv og /eller cellelinier [18] – [20]. Enkelte studier har anvendt iTRAQ teknologi efterfulgt af 2D-LC separation af peptider og massespektrometri [18], [21], [22]. Her har vi anvendt 2D-DIGE teknologi efterfulgt af MALDI-TOF-TOF og ESI-lineær ion trap massespektrometri. Kombinationen af ​​disse teknikker er en mere følsom og pålidelig metode til identifikation af mindre forskelle i proteinekspression mellem humane coloncancer-celler med lave eller høje niveauer af Snail1. Disse teknikker har givet os mulighed for at tage et dybere indblik i de proteom forandringer forbundet til Snail1 overekspression. I denne undersøgelse har vi identificeret en række proteiner hidtil ukendte som Snail1 mål i humane colon cancerceller. Nogle af dem er involveret i kontrollen af ​​cellulær genekspression og fænotype, og er sandsynlige mediatorer af den tumorigen virkning af Snail1.

Resultater

De fleste gener tidligere karakteriseret som reguleret af Snail1 indkode plasmamembranen proteiner involveret i celleadhæsion eller cytoskeletale komponenter. At udvide vores viden om Snail1 effekter i human coloncancer, anvendte vi en integrativ strategi til at identificere kerneproteiner reguleret af Snail1 i denne neoplasi (figur 1A). Vi anvendte 2D-DIGE elektroforese kombineret med MALDI-TOF-TOF og ESI-lineær ion trap massespektrometri til at sammenligne det mønster af proteiner, der findes i kerneekstrakter fra human coloncancer SW480-ADH-celler udtrykker et retroviralt transducerede Snail1 cDNA (Snail1 celler) med den for fingeret inficerede celler (mock celler). En undergruppe af de identificerede proteiner blev valideret ved Western blot og immunfluorescens analyser af humane coloncancer-celler, og ved immunhistokemi af humane coloncancer biopsier. Vi har tidligere karakteriseret den cellulære model, der anvendes i denne undersøgelse [7], [10], og fandt, at Snail1 overekspression fremmet erhvervelsen af ​​en mere stjerneformet cellemorfologi (figur 1B), undertrykkelsen af ​​de epiteliale markører E-cadherin, Occludin og claudin -7, og induktionen af ​​den mesenchymale protein Lef-1 (figur 1C).

(A) Ordning af arbejdsgangen fulgte i denne undersøgelse. (B) Repræsentative fase-kontrast mikrofotografier (øverste paneler) og konfokal laser immunofluorescens billeder, der viser F-actin farvning (lavere paneler) af SW480-ADH Mock og Snail1 celler. Scale bar, 20 um (øverste paneler) og 10 um (underpanel). (C) Western blot analyse af hel-celle ekstrakter fra SW480-ADH Mock og Snail1 celler viser Snail1 overekspression og dens effekt på ekspressionen af ​​epitelial (E-cadherin, Occludin og Claudin-7) og mesenkymale (Lef-1) markører. β-tubulin blev anvendt som en belastning kontrol.

Differential proteinekspression analyse af nukleare fraktioner fra humane colon cancerceller med høj eller lav Snail1 udtryk

Nuclear ekstrakter fra SW480-ADH Mock og Snail1 celler blev analyseret ved 2D-DIGE som beskrevet i Materialer og Metoder. ændringer protein mønster blev kvantitativt og statistisk analyseret ved hjælp af DeCyder software v.6.5 overvejer de 12 spot Kort inkluderet i undersøgelsen. Figur 2 viser et repræsentativt 2D-kort over de nukleare SW480-ADH-proteiner. Hver gel blev analyseret individuelt for at beregne volumen forholdet mellem de enkelte prøver og den interne pulje, som blev brugt som standard reference. Derefter blev alle billederne kombineret og analyseres sammen ved hjælp af BVA modulet. Få variationer i protein overflod blev observeret mellem Mock og Snail1 celler. En parret

t

-test blev anvendt til at vælge 22 spots, hvis udtryk variation mellem begge celletyper var statistisk signifikant (Students

t

-test,

s

0,05) . Disse pletter blev valgt som pletter af interesse og kommenteret på master gel (figur 2). proteinidentifikation blev udført ved to metoder: (1) peptidmassefingeraftryk under anvendelse MALDI-TOF-TOF og (2) ESI-lineær ionfælde og MS /MS peptidsekventering (påføring af en restriktiv falsk positiv opdagelse sats (FDR) cut-off, FDR≤1%). I begge tilfælde identifikation med mere end ét peptid var en forudsætning. Ved at bruge denne dobbelte fremgangsmåde blev 19-proteiner identificeret i 17 ud af 22 spots (tabel 1). Kun fem proteiner blev identificeret med MALDI-TOF-TOF grund af de lave niveauer af ekspression. Atten proteiner blev identificeret ved hjælp af ESI-lineær ion trap, med to spots, der indeholder mere end ét protein. I disse tilfælde blev proteiner listet efter antallet af identificerede peptider. Fire proteiner blev identificeret ved begge teknikker (tabel 1).

Nuclear ekstrakter fra SW480-ADH Mock og Snail1 celler blev forskelligt mærket med Cy3 og Cy5 farvestoffer. En intern standard kombinerer proteiner fra begge ekstrakter blev inkluderet i alle geler efter mærkning med Cy2 farvestof. 3-10 NL IPG strimler blev anvendt til IEF og standard SDS-PAGE for den anden dimension. Repræsentativ 2D billede viser stedet kort svarende til den interne standard, som er fælles for alle geler analyseret. Steder, der er angivet med pile blev informativ for protein identifikation ved massespektrometri (se tabel 1 for kode tildeling). Udvalgte pletter viste en statistisk varians af volumen nøgletal inden den 95. konfidensniveau (Students

t

-test,

s

0,05).

Protein ontologi analyse af identificerede proteiner

Blandt de proteiner ændret af Snail1 overekspression vi identificerede α-Catenin (CTNNA1), den PI3K regulatoriske subunit α (PIK3R1), Caldesmon (CALD1), den Spaltning og polyadenylering specificitet faktor subunit 6 (CPSF6), og vimentin (VIM) som opreguleres proteiner; og spredning-associeret protein 2G4 (PA2G4, også kendt som ErbB3 protein 1 eller EBP1), Ran-specifikke GTPase-aktiveret protein (RANBP1), og flere medlemmer af 14-3-3 protein familien (YWHAE, YWHAH og YWHAQ ) blandt de nedreguleret proteiner (tabel 1). Trods at arbejde med nukleare ekstrakter, kun 7 ud af 19 proteiner blev tildelt den nukleare rum (CPSF6, WTAP, ENO1, PA2G4, HNRNPH3, RANBP1 og PPIA), mens de resterende var fortrinsvis cytosoliske eller associeret til cytoskelettet. Men vi kan ikke kassere, at sidstnævnte proteiner var delvist eller midlertidigt til stede i den nukleare rum. Med hensyn til biologisk funktion blev flere proteiner involveret i celleadhæsion (CTNNA1) eller komponenter af cytoskelettet (CALD1, VIM og LASP1). Men de fleste af proteinerne var impliceret i signaltransduktion (PI3KR1, RANBP1 og 14-3-3 familiemedlemmer) og RNA-bearbejdning (CPSF6, WTAP og HNRNPH3) (tabel 1). Nogle af disse proteiner blev udvalgt til validering. I betragtning af den høje homologi eksisterende blandt 14-3-3 proteiner, og mellem nogle af de identificerede peptider (dvs. -VISSIEQK- for 14-3-3τ og -VLSSIEQK- for 14-3-3σ, hvilket gør dem næsten ikke skelnes), vi besluttede at medtage alle medlemmer af familien i valideringen analyser.

validering af kandidat målproteiner

for en kvantitativ estimering af ekspressionen af ​​de kandidat målproteiner i SW480-ADH Mock og Snail1 celler, vi analyseret af Western blot tre nukleare ekstrakter fremstillet uafhængigt (N1, N2, N3). Derudover blev cytosoliske ekstrakter fra en af ​​forsøgene (C1) inkluderet i analysen (figur 3A). Variabel nedregulering (20% til 70%) af 14-3-3 β, ε, σ, τ og f-proteiner blev fundet i kernen af ​​Snail1 celler. For alle dem undtagen 14-3-3σ nedreguleringen var svagere i cytosolen end i kernen (figur 3A). Vi har ikke været i stand til at opdage 14-3-3η udtryk hverken i kernen eller i cytosolen, mens den for 14-3-3γ var upåvirket af Snail1 overekspression (data ikke vist). PA2G4 ekspression var også lavere i både kernen og cytosol SW480-ADH Snail1 end i Mock celler (figur 3A).

(A) Western blot-analyse af ekspressionen af ​​udvalgte proteiner i cytosolisk (C) og nuklear ( N) ekstrakter af SW480-ADH Mock og Snail1 celler. HNRNPH3 isoformer (1-4) er vist. Tallene under gelerne indikerer kvantificering af ændringen i udtryk mellem Snail1 og Mock celler efter normalisering til p-tubulin eller Lamin B (cytosol og nuklear kontrol, henholdsvis). Den statistiske signifikans af de nukleare ændringer udtryk fremmes af Snail1 blev vurderet ved to-sidede uparrede Students

t

-test. Det var

s

0,001 for 14-3-3ε, 14-3-3σ, 14-3-3ζ, CPSF6 og isoformer 3 og 4 i HNRNPH3;

s

0,01 for 14-3-3τ; og

s

0,05 for 14-3-3β og PA2G4. Reguleringen af ​​SFPQ (

s

= 0,057), og at de isoformer 1 + 2 i HNRNPH3 (

s

= 0,058) ikke nået den statistiske signifikans, men en klar tendens blev observeret. (B) Western blot-analyse af ekspressionen af ​​udvalgte proteiner i cytosolisk (C) og nuklear (N) fraktioner af HT29 Mock og Snail1 celler. Tallene under gelerne indikerer kvantificering af ændringen i udtryk mellem Snail1 og Mock celler efter normalisering til p-tubulin eller Lamin B (cytosol og nuklear kontrol, henholdsvis). (C) Kvantitativ RT-PCR undersøgelse af PA2G4 ekspression i SW480-ADH og HT29 Mock og Snail1 celler. 18S rRNA udtryk blev anvendt til normalisering. Statistisk signifikans blev vurderet ved to-sidede uparrede Students

t

-test, enkelt stjerne angiver

s

. 0,05

Derimod niveauet CPSF6 var højere i Snail1 celler end i Mock celler (figur 3A). Vi har også analyseret ekspressionen af ​​Splejsning faktor prolin /glutamin-rig (SFPQ), et protein der findes 1,59-fold opreguleres i proteomanalyse, men fraværende fra tabel 1, fordi den kun blev identificeret med et peptid i stedet 609. Vi gjorde det fordi både SFPQ og CPSF6 er involveret i præ-mRNA-behandling og lokaliseret i nukleare paraspeckles [23], hvilket tyder på en mulig koordineret effekt af Snail1. fundet Faktisk vi, at Snail1 øget nuklear SFPQ udtryk og også det lave SFPQ opdaget i cytosolen (figur 3A).

Reguleringen af ​​Snail1 var kompleks i tilfældet med den Heterogen nukleare ribonukleoprotein H3 (HNRNPH3) , som præsenterer flere isoformer skyldes alternativ splejsning [24]. De anvendte peptider i proteomik undersøgelse for at identificere HNRNPH3 indikerer, at nedreguleret stedet kun kan svare til isoformer 1, 2 eller 3. Analysen ved Western blot viste, at ekspressionen af ​​isoformer 1 og 2 (forventet MW 36,9 og 35,2 kDa) blev opreguleret af Snail1, mens den for isoformer 3 og 4 (forudsagt MW 31,5 og 22,3 kDa) blev kraftigt nedreguleret i både kernen og cytosol Snail1 celler (figur 3A). Derfor skal det protein identificeret i proteomisk analyse være isoform 3 i HNRNPH3.

undertrykkelse af 14-3-3ε, 14-3-3τ, 14-3-3ζ og PA2G4 af Snail1 i kerneekstrakter var gengivet i to uafhængige forsøg i en anden human coloncancer cellelinie, HT29 (figur 3B). Desuden kvantitativ RT-PCR-analyse afslørede et nedsat niveau af PA2G4 RNA i både SW480-ADH og HT29-celler, der udtrykker Snail1 i forhold til deres respektive Mock celler (figur 3C).

Subcellulær fordeling af Snail1 målproteiner

ekspressionen af ​​nogle af de Snail1 målproteiner valideret ved Western blot blev yderligere undersøgt ved immunofluorescens og konfokal mikroskopi analyser. Som vist i figur 4, er niveauet for 14-3-3 β, ε og σ var meget lavere i både kernen og cytosol SW480-ADH Snail1 celler end i Mock celler. I alle tre tilfælde udtrykket var højere i cytosolen end i kernen med en variabel ratio: β σ ε. Immunofluorescens analyse viste også en reduktion af både nukleare og cytosolisk udtryk for PA2G4 i Snail1 celler i forhold til Mock celler (figur 5A). Ekspressionen af ​​PA2G4 havde et fint punktformet mønster i både kernen og cytosolen, og var især stærk i et par runde og skarpt defineret nukleare foci på ca. 0,5 um i diameter (figur 5). Dobbelt farvning hjælp af antistoffer mod Coilin (markør for Cajal organer), TMG-cap af spliceosomal snRNAs (markør for Cajal organer og nukleare prikker af splejsning faktorer), Fibrillarin (markør for nucleolus) og PML (markør for PML organer), viste, at PA2G4-positive nukleare foci svarer til Cajal organer (Figur 5B). Dette resultat blev bekræftet i neuroner (data ikke vist), celletypen hvor Cajal organer er mest fremtrædende [25]. Den bedste forstået funktion Cajal organer er biogenese af små nukleare og nucleolar RNP’er (snRNP’er, snoRNPs) involveret i præ-mRNA splejsning og præ-rRNA behandling henholdsvis [25], [26]. De dobbelte farvende eksperimenter viste også en svag farvning af PA2G4 i nucleolus (se figur 5B, PA2G4 og Fibrillarin co-farvning), som det er blevet beskrevet tidligere [27]. Salg

Repræsentative konfokal mikroskopi billeder viser ekspressionen og lokalisering af 14-3-3 β, ε og σ (rød) i SW480-ADH Mock og Snail1 celler. GFP-ekspression (grøn) var uændret ved Snail1 og blev anvendt som kontrol. Scale bar, 10 um.

(A) Repræsentative konfokal mikroskopi billeder viser udtryk og lokalisering af PA2G4 (rød) i SW480-ADH Mock og Snail1 celler. GFP-ekspression (grøn) var uændret ved Snail1 og blev anvendt som kontrol. Scale bar, 5 um. (B) Repræsentant konfokal mikroskopi billeder viser dobbelt immunolabeling for PA2G4 (rød) og for molekylære markører (blå) af Cajal organer (Coilin), Cajal organer og nukleare prikker af splejsning faktorer (TMG-cap), kernelegeme (Fibrillarin) og PML organer (PML) i SW480-ADH Mock celler. Den lyserøde farve i flettefelter billederne indikerer eksistensen af ​​co-lokalisering. Scale bar, 5 um.

Analyse af humane kolon tumorer

undertrykkelse af flere 14-3-3 familiemedlemmer med en tumor-associerede transkriptionsfaktor som Snail1 fik os til at studere ekspressionen af ​​disse proteiner i human coloncancer. Da 14-3-3σ var medlem, der ekspression stærkere undertrykt af Snail1 både i kernen og i cytosolen, valgte vi det for undersøgelsen af ​​humane prøver. Først, vi analyserede 14-3-3σ udtryk ved immunhistokemi i et væv array med parrede normale og tumor prøver fra 46 patienter kolorektal cancer, og fandt, at 14-3-3σ var stærkt udtrykt af både normale og tumorceller epitelceller, men ikke af stromale celler (figur 6A). Da dette udtryk mønster af 14-3-3σ var sammenhængende med sin undertrykkelse af en inducer af EMT sådan os Snail1, besluttede vi at udføre en mere detaljeret undersøgelse af 14-3-3σ og Snail1 udtryk i fortløbende skiver af fem colon tumor biopsier. Efter aftale med tidligere undersøgelser [13], vi primært fundet Snail1 immunoreaktivitet i kernen af ​​celler med mesenkymale fænotype inden tumoren (figur 6B). Disse celler kunne svare til tumor epitelceller, der har gennemgået EMT og /eller fibroblaster, der er blevet aktiveret af tumormikromiljøet [13]. Følgelig med dataene opnået fra vævet array, blev 14-3-3σ udtrykt i både kernen og cytosol tumor epitelceller, men det var fraværende i stromale celler (figur 6B). Derfor 14-3-3σ og Snail1 har modsatte ekspressionsmønstre (epitel og stromale henholdsvis) i tyktarmskræft. Desuden 14-3-3σ udtryk ligner, at den Snail1 målgen

CDH1

/E-cadherin og som foreslået for dette gen, er det muligt, at Snail1 undertrykker 14-3-3σ ekspression i mesenkymale celler.

(A) Immunhistokemi billeder, der viser 14-3-3σ udtryk i repræsentative normale og tumor kolon prøver af 46 analyserede i vævet matrix. Bjælker angiver forstørrelse. Snit blev modfarvet med hæmatoxylin. (B) Immunhistokemi billeder viser 14-3-3σ og Snail1 udtryk i to på hinanden følgende skiver af en repræsentativ tyktarmskræft tumor i fem analyseret. Bjælker angiver forstørrelse. Snit blev modfarvet med hæmatoxylin. Højre paneler er en 3X-forstørrelse af regionen er angivet i venstre paneler.

Diskussion

Identifikation proteiner reguleret af Snail1 udvider nuværende viden om biologi denne transskription faktor og kaster nyt lys over de mekanismer i EMT og kræft progression. Vi valgte tyktarmskræft som et arbejdende system, fordi Snail1 opreguleres både RNA og protein niveau i denne neoplasi og bidrager til dets malignisering [10] – [13]. Tidligere havde genekspressionsprofilerne induceret af Snail1 i forskellige systemer blevet undersøgt af transkriptomisk analyser, og de fleste af Snail1 målgener identificeret kodet for proteiner involveret i cellulær adhæsion, ekstracellulær matrix og cytoskelettet [4], [15], [28] . I denne undersøgelse, vi udførte en proteomisk analyse af nukleare ekstrakter havde til formål at identificere nye proteiner, der reguleres af Snail1 der kunne mediere sin brede effekt på celle fysiologi og fænotype.

Vores undersøgelse viser en bemærkelsesværdig bevarelse i den globale mønster af nukleare proteinekspression i humane celler tyktarmskræft, der udtrykker høje eller lave niveauer af Snail1. Alligevel har en række tidligere karakteriserede Snail1-regulerede proteiner impliceret i diverse cellefunktioner blevet identificeret. Tyve-to pletter blev fundet som betydeligt dereguleret mellem begge celletyper med en

s

0,05 (Students

t

-test). Nitten forskellige proteiner blev identificeret, de fleste af dem ved at bruge ESI-lineære ion trap instrument i kombination med en nano-HPLC. Kun fem proteiner blev identificeret med MALDI-TOF-TOF, sandsynligvis på grund af den lave ekspression af proteinerne til stede i pletter. To pletter (1419 og 1926), indeholdt mere end ét protein. Men i stedet 1419 vimentin var signifikant mere rigelig (baseret på antallet af identificerede peptider) end de andre proteiner, og vi tillagt det forskellene i ekspression. I stedet 1926 antallet af identificerede peptider var ganske ens mellem LASP1 og HNRNPH3, hvilket gør det vanskeligere at assignation af den differentielle ekspression.

Vores resultater enige med transskriptionsrepressor rolle Snail1, som i 12 ud af 17 spots med identificerede proteiner ekspressionen var lavere i Snail1-udtrykkende celler end i Mock celler, mens kun i fem af dem ekspressionen var højere i Snail1 celler. Undertrykkelsen af ​​de nedreguleret proteiner kunne være en direkte virkning af Snail1, især i tilfælde af PA2G4 hvis RNA-niveau blev også reduceret med Snail1. Derimod skal induktionen af ​​proteinekspression ved Snail1 være indirekte, medieret af andre transkriptionsfaktorer, som det er blevet rapporteret for Matrix metalloproteaser 2 og 9 [29], [30]. Desuden fandt vi, at Snail1 ændrer splejsningsmønster af HNRNPH3 i SW480-ADH-celler. Dette er i overensstemmelse med undersøgelser, der beskriver, at Snail1 ændrer mønstret for splejsning af p120-Catenin og

zonula occludens

-1 ved ukarakteriserede mekanismer [31], [32].

Efter aftale med tidligere transkriptomisk undersøgelser, viser vi her, at Snail1 ændrer ekspressionen af ​​proteiner involveret i celleadhæsion og cytoskelet (CTNNA1, CALD1, VIM og LASP1). Derudover og til vores viden for første gang, rapporterer vi, at Snail1 regulerer proteiner involveret i andre cellulære funktioner som RNA modning (CPSF6, HNRNPH3 og SFPQ) og intracellulær signalering (PI3KR1, RANBP1 og 14-3-3 protein familie). Den næsten generel undertrykkende effekt af Snail1 på ekspressionen af ​​14-3-3 familiemedlemmer er overraskende og er enig med den nyligt foreslåede kræft-beskyttende rolle af visse af disse proteiner [33], [34]. 14-3-3-proteinerne har længe været kendt som phosphoserin /phosphothreoninrester bindingsproteiner kan binde og modulere interaktionen mellem proteiner og involveret i celleprocesser som signalering, cellecykluskontrol, apoptose, intracellulær transport, cytoskelet struktur og transkription [34 ], [35]. Først i de senere år har flere 14-3-3 familiemedlemmer har været forbundet med en række forskellige kræft processer. Mens 14-3-3σ er blevet foreslået som et tumorsuppressorgen, der er bragt til tavshed eller inaktiveres under progression af melanom og bryst-, mave-, hepatocellulær, ovarie- og pladecellecarcinomer [33], [36] – [40]; har det vist sig overudtrykt i pancreascancer [41]. Desuden viste en proteomisk analyse, 14-3-3σ udtryk nedreguleres i invasive overgangsordning celle karcinomer i urinblæren undergår EMT [19]. Dette er i overensstemmelse med vores data fra humane coloncancer biopsier, der viser en modsat udtryk mønster af 14-3-3σ og Snail1. Især kan 14-3-3 ε, ζ og η danner et ternært kompleks med Chibby og β-Catenin lette nuklear eksport af β-catenin derved at modvirke dens transkriptionel aktivitet, der er en vigtig drivkraft i tyktarmskræft [42]. Modsat, 14-3-3ζ samvirker med ErbB2 at fremme EMT og progression af duktale brystcarcinomer til invasiv cancer [43], og dets overekspression associerer med brystkræft tilbagefald [44]. I denne undersøgelse har vi identificeret 14-3-3 β, ε, σ, τ og ζ som nedreguleres efter Snail1 ekspression i humane coloncancer-celler. Virkningen af ​​14-3-3-proteiner kan moduleres ved vekselvirkning med forskellige partnere i et rumligt og tidsligt mode og også underkastes regulering ved phosphorylering. Derfor kan den samme 14-3-3 familiemedlem har flere og endda modsatrettede roller gør analyse af effekten af ​​de enkelte 14-3-3 proteiner meget komplekse og afhængige på integration af yderligere signaler [45]. Derfor er det vanskeligt at forudsige, hvilken rolle af disse proteiner i Snail1 aktion i tyktarmskræft, som kan være relateret til mutationer typisk er til stede i denne neoplasi.

Vi fandt, at Snail1 undertrykker også PA2G4 udtryk i human tyktarmskræft celler. Dette protein interagerer med det cytoplasmatiske domæne af ErbB3 receptor nedregulering ErbB signaltransduktion og formildende heregulin-drevet væksten af ​​brystkræftceller [46], [47]. PA2G4 ligger ikke kun i cytosolen men også i kernen, hvor den opfører sig som en pleiotropisk protein, der interagerer med en række proteiner og RNA’er, der er involveret i transskriptionel regulering og translation kontrol [48], [49]. Således PA2G4 inhiberer E2F1- og androgen receptor-medieret transkription gennem dets interaktion med retinoblastoma-protein, androgen receptor, flere histoner deacetylaser og Sin3A [50] – [53]. Lokaliseringen af ​​PA2G4 i Cajal organer, som vi nu har rapporteret foreslår, at dette multifunktionelle protein også er involveret i modningen af ​​snRNA og snoRNA. Desuden PA2G4 overekspression inducerer differentiering af humane brystcancerceller [54], inhiberer proliferation af humane fibroblaster, og undertrykker vækst og metastase af spyt-adenoid cystiske carcinomaceller [55]. Fra alle disse undersøgelser er det tænkeligt, at PA2G4 undertrykkelse kan bidrage til tumorigen virkning af Snail1.

Interessant Snail1 opregulerer ekspressionen af ​​CPSF6 og SFPQ proteiner involveret i [56], [57 RNA polyadenylering og splejsning, henholdsvis ]. Begge proteiner har for nylig vist sig at være til stede i paraspeckles foreslog en subnuclear rum at være stedet for præ-mRNA behandling og lagring [23]. Notatet både CPSF6 og SFPQ er fusionspartnere for tyrosinkinaser i blodkræftsygdomme [58]. Snail1 ændrer også splejsningsmønster af HNRNPH3, andet protein involveret i splejsning processen [24]. Interessant nok de HNRNPH3 isoformer induceret af Snail1 indeholde to kopier af et RNA-bindende domæne (RNA genkendelsesmotiv) almindeligvis findes i proteiner, der binder enkeltstrenget RNA, mens disse isoformer undertrykkes af Snail1 kun indeholde én [24]. Men den funktionelle konsekvens af denne forskel er ukendt. Derfor er vores undersøgelse viser, at Snail1 kan modulere flere trin i RNA modning, såsom polyadenylering og splejsning, og så mRNA-stabilitet og translation. Tilsammen antyder disse data at ud over sin anerkendte transkription repressionsaktivitet kan Snail1 regulere genekspression post-transkriptionelt ved at modulere niveauet af proteiner involveret i præ-mRNA-processering og placering.

Afslutningsvis vores resultater implicerer Snail1 som en regulator af hidtil uforudsete cellulære funktioner ud over intercellulær adhæsion og cellemorfologi. Den tilbundsgående undersøgelse af virkningsmekanismer af de nyligt identificerede Snail1 målproteiner vil bidrage til at definere den præcise komplekse biologiske aktivitet af Snail1 og så indsigt af processen med EMT under embryogenese og tumorigenese.

Materialer og Metoder

Etik erklæring

Denne undersøgelse blev foretaget i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen. Undersøgelsen blev godkendt af Etisk Komité Instituto de Salud Carlos III (Madrid, Spanien) og Etisk Udvalg for Klinisk Forskning fra Institut Municipal d’assistência Sanitaria (Barcelona, ​​Spanien). Alle patienter forudsat skriftligt informeret samtykke til indsamling af prøver og efterfølgende analyse.

Cell kultur

SW480-ADH og HT29 humane colon cancerceller stabilt udtrykker Snail1 (Snail1 celler) eller en tom vektor ( mock celler) blev dannet ved retroviral transduktion under anvendelse PRV-Snail1-IRES-GFP (Snail1 celler) eller PRV-IRES-GFP (mock celler) vektorer, som vi tidligere har rapporteret [10].