PLoS ONE: en kritisk rolle for FBXW8 og MAPK i cyclin D1 Nedbrydning og kræft Cell Proliferation

Abstrakte

cyclin D1 regulerer G1 progression. Dens transkriptionel regulering er godt forstået. Men mekanismen underliggende cyclin D1 ubiquitinering og den efterfølgende nedbrydning er endnu ikke klart. Vi rapporterer, at cyclin D1 undergår forøget nedbrydning i cytoplasmaet under S-fasen i en række forskellige cancerceller. Dette medieres af phosphorylering ved Thr286 gennem aktiviteten af ​​Ras /Raf /MEK /ERK kaskade og F-box-protein FBXW8, hvilket er en E3-ligase. Størstedelen af ​​FBXW8 udtrykkes i cytoplasmaet under G1 og S-fase. I modsætning hertil cyclin D1 akkumuleres i kernen under G1-fasen og forlader i cytoplasmaet i S-fase. Øget nedbrydning cyclin D1 er forbundet med tilknytning til FBXW8 i cytoplasmaet, og øget phosphorylering af cyclin D1 gennem vedvarende ERK1 /2 signalering. Udtømning af FBXW8 forårsagede en signifikant ophobning af cyclin D1, samt beslaglæggelse af CDK1 i cytoplasmaet. Dette resulterede i en alvorlig reduktion af celleproliferation. Disse virkninger kan blive reddet af konstitutiv nukleare udtryk for cyklin D1-T286A. , FBXW8 spiller således en væsentlig rolle i kræft celledeling gennem proteolyse af cyklin D1. Det kan præsentere nye muligheder for at udvikle behandlinger rettet mod ødelæggelse af cyklin D1 eller dens regulator E3 ligase selektivt

Henvisning:. Okabe H, Lee SH, Phuchareon J, GD Albertson, McCormick F, Tetsu O (2006) En kritisk rolle for FBXW8 og MAPK i cyclin D1 Nedbrydning og Cancer Cell Proliferation. PLoS ONE 1 (1): E128. doi: 10,1371 /journal.pone.0000128

Academic Redaktør: Dong-Yan Jin, Institut for Biokemi, Kina

Modtaget: November 7, 2006; Accepteret: November 23, 2006; Udgivet: December 27, 2006

Copyright: © 2006 Okabe et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra American Cancer Society, Concern Foundation, de Daiichi Pharmaceuticals, UCSF Forskningsbaseret Evaluation Allocation udvalg, og V Foundation til OT, National Institutes of Health (R01 CA101359) til DGA, og Wood Foundation til FM

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

cyclin D1 regulerer G1 progression i kræftceller, og er overudtrykt i forskellige maligne neoplasmer [1 ]. Som et resultat, er det et potentielt mål for kræftmedicin [2]. Transkriptionel regulering af cyclin D1 er blevet grundigt undersøgt og er velkendt [3] – [5]. Den stimuleres, når for eksempel forskellige mitogene signaler aktiverer Ras /Raf /MEK /ERK (MAPK) cascade. Efter syntese efter MAPK cascade aktivering, cyclin D1 forbinder med CDK4 /6, p21 Cip1 eller p27 Kip1 [6], [7].

I modsætning hertil mekanismen for cyclin D1 ubiquitinering og efterfølgende nedbrydning har ikke været fuldt karakteriseret. Det vides, at cyclin D1 polyubiquitinated og efterfølgende nedbrydes via 26S proteasom pathway. Denne proces kræver phosphorylering cyclin D1 på threonin (Thr) -286, som er beliggende nær dets C-terminale ende [8]. Cyclin D1 mutant T286A er resistent over for ubiquitinering

in vitro

in vivo

og er en meget stabil protein. Glycogensynthasekinase-3β (GSK3p) kan phosphorylere cyclin D1 på Thr286, fremme nuklear-til-cytoplasmatisk omfordeling af cyclin D1 [9], [10]. Imidlertid har den rolle GSK3p i cyclin D1 phosphorylering og dens stabilitet er blevet afhørt for nylig [11], [12], og p38 SAPK2 har været impliceret i proteasomalaktivitet nedbrydning af cyklin D1 efter osmotisk chok [13].

vi har forsøgt at identificere kinase ansvarlig for phosphorylering af cyclin D1 på Thr286. Vores arbejde viser, at cyclin D1 destabiliseres specifikt under S-fasen i cancerceller og at øget nedbrydning medieres ved phosphorylering på Thr286 gennem aktiviteten af ​​Ras /Raf /MEK /MAPK signaleringskaskade.

ubiquitin-protein ligase nødvendig til nedbrydning af cyclin D1 er endnu ikke blevet identificeret. En F-box-protein, SKP2, er blevet foreslået [14], [15]. SKP2-medieret regulering af cyclin D1 kan imidlertid være kontekst- eller cellelinie afhængige, og kan være indirekte [7]. Hertil kommer, at cyclin D1 ikke ophobes i SKP2 knockout mus embryonale fibroblast (MEF) celler [16], [17].

Dannelsen af ​​polyubiquitin-protein-konjugater er godt forstået [18]. Tre komponenter deltager i sekventielle ubiquitin transfer reaktioner:. E1, en aktiverende enzym, E2 /Ubc, et ubiquitin-konjugerende enzym og E3, et protein ligase, hvilket lægger ubiquitin til en lysinrest på et målprotein

den bedst karakteriserede af disse enzymer er de SCF E3 ubiquitin ligaser, som regulerer substrat ubiquitinering i en phosphorylering-afhængig måde [19] – [21]. Disse ligaser danner et meget varieret familie af komplekser opkaldt efter deres komponenter, S-fasen kinase-associeret protein 1 (SKP1), Cullin 1 (CUL1 /Cdc53), F-box proteiner, og RBX1 /ROC1. SKP1 er en afgørende adapter underenhed og selektivt vekselvirker med et stillads protein, enten CUL1 eller Cullin 7 (CUL7), for at fremme ubiquitinering af målrettede substrater [22], [23]. Foreningen af ​​CUL7 med SKP1 afhænger FBXW8 og danner en specifik SCF-lignende kompleks [22], [23]. Vores undersøgelse viser, at F-box-protein FBXW8 specifikt genkender cyclin D1 i en phosphorylering-afhængig måde og regulerer dets stabilitet gennem ubiquitinproteasomvejen.

Resultater

cyclin D1-proteinet destabiliseres specifikt i S fasen i kræftceller

for at undersøge mekanismen og betydningen af ​​cyklin D1 proteolyse, vi først vurderede udtrykket profil cyklin D1 under cellecyklusprogression fra hvile i tre normale cellelinier (NIH 3T3 WI -38 fibroblaster og CCD841 con kolon epitel celler) og i tre cancer cellelinier (HCT 116 og SW480 tyktarmskræft og T98G glioblastomer). Normale celler (fig. 1A og fig. S1 [A]) og cancerceller (fig. 1B og fig. S1 [B]) blev frigjort fra hvile ved G0 /G1-fasen og cellecyklus-profiler blev bestemt ved flow-cytometrisk cellecyklus analyser. I begge celletyper, cyklin D1 udtryk øges gradvist efter re-entry i cellen cyklus og nåede et maksimum på G1-S overgang. I alle tre normale cellelinier, cyclin D1-niveauer forblev konstant under S-fasen (fig. 1A og fig. S1 [A]), selvom vi observeret et lille fald i cyclin D1-ekspression efter indtræden i S-fase. Dette fund er i overensstemmelse med tidligere observationer [24], [25]. I modsætning hertil udviste alle tre cancercellelinier en dramatisk reduktion af cyclin D1-ekspression under S-fasen (fig. 1B og fig. S1 [B]). Disse observationer antyder, at cyclin D1 omsætning forøges under S-fasen i disse celler.

cyclin D1 destabiliseres under S-fasen gennem ubiquitinproteasomvejen i cancerceller. (A, B) Ekspression profil cyclin D1 under cellecyklusprogression i celler frigivet fra hviletilstand. Normale celler (A) og cancerceller (B) blev testet. (A) NIH 3T3 musefibroblaster og CCD841 Con normal colon epitel. (B) HCT 116 og SW480 celler. CCD841 Con celler blev synkroniseret ved G0 /G1 fasen ved behandling med ACL-4 medier uden EGF i 24 timer, og derefter stimuleret med komplet ACL-4 medier indeholdende EGF. Andre celler blev frigivet fra hvile ved serum stimulation. Prøver blev opsamlet ved angivne tidspunkter. Cellecyklus fordelinger blev bestemt ved flow-cytometri og procentsatser for hver fase er angivet. Western-blots blev udført med cyclin D1 og p-actin-antistoffer, henholdsvis. (C, D) Pulse-chase analyse af cyclin D1 i NIH 3T3-celler (C) og HCT 116 celler (D). Celler blev frigivet fra hvile og mærket med

35S-methionin i 1 time, når de fleste af de bestande var i G1 fasen (9 timer for NIH3T3 og 6 timer for HCT 116) eller i S-fasen (21 timer for NIH3T3 og 15 timer for HCT 116). Cellerne blev afdrevet med kold methionin i de angivne tidsrum og derefter lyseret. Cyclin D1 blev immunopræcipiteret og analyseret med SDS-PAGE. Autoradiografi blev udført. Niveauer af metabolisk mærket-cyclin D1 blev estimeret ved kvantitativ scanning med Mængde One software (Bio-Rad) og blottet på grafen for at bestemme halveringstiden af ​​cyclin D1. Cellecyklusfordeling er angivet nedenfor figurerne. (E) Omsætning af cyclin D1 medieres af ubiquitinproteasomvejen. NIH3T3 og HCT 116-celler blev frigjort fra hvile ved serumstimulering og behandlet i nærvær (+) eller fravær (-) af MG132 i 2 timer før høst ved hvert tidspunkt. Western blot udførtes med cyclin D1 og p-actin-antistoffer. (F-H) Polyubiquitination af cyclin D1. (F) HCT 116 colon cancerceller blev transficeret med HA-mærket ubiquitin-cDNA (bane 1-3) eller uden det (bane 4) og derefter synkroniseret til S fase gennem den sekventielle manipulation af serum sult og stimulering. Celler blev behandlet med 25 pM MG132 (bane 3 og 4) eller uden det (bane 1 og 2) i en time. Lysater blev immunfældet med antistoffer mod cyclin D1 antistof (bane 2-4) eller kontrollere IgG (bane 1) og immunblottet med en HA-antistof (øverste panel) eller en cyclin D1-antistof (nederste panel). Stjerner angiver baggrund non-specifikke bånd (F-G). (G) Nuclear (N) og cytoplasmatiske (C) proteiner blev fraktioneret (Fr.) fra cellelysater indsamlet i Panel F, bane 3. Nuklear og cytoplasmiske ekstrakter blev immunfældet med antistoffer til cyclin D1 (bane 1 og 2) eller IgG ( bane 3) og immunblottet med en HA-antistof (øverste panel) eller en cyclin D1-antistof (nederste panel). (H) cellecyklus distributioner.

For at bekræfte denne observation, NIH 3T3 mus fibroblast og HCT 116 tyktarmscancerceller blev synkroniseret ved G0 /G1 fasen og frigivet fra hvile og udsat for pulse-chase analyse . Fig. 1C og D show pulse-chase analyser på

35S metabolisk mærket cyclin D1 på 9 timer (NIH 3T3) eller 6 timer (HCT 116), hvor de fleste af cellerne var i G1-fasen, og med 21 timer (NIH 3T3) og 15 timer (HCT 116), hvor de fleste var i S-fase (fig. 1C og D, bund- tabeller). Mærkede cyclin D1 niveauer af blev estimeret ved kvantitativ scanning (fig. 1C og D). Der var ingen signifikant forskel i halveringstid cyclin D1 under G1 og S faser i NIH 3T3-celler. I modsætning hertil var der en signifikant forskel i HCT 116-celler (S fasen T

1/2 = 11,8 min, sammenlignet med T

1/2 = 27,5 min i G1-fasen). Således er cyclin D1 destabiliseret specifikt i S-fase i HCT 116-celler.

cyclin D1 nedbrydes i cytoplasmaet under S-fasen gennem ubiquitinproteasomvejen i cancerceller

Derefter bestemte vi, hvis cyclin D1 destabilisering under S-fase skyldes øget proteolyse gennem ubiquitinproteasomvejen. Vi behandlede HCT 116 og NIH 3T3-celler med MG132, en proteasominhibitor, i 2 timer før høst på hvert tidspunkt under cellecyklusprogression (fig. 1E). I behandlede HCT 116 celler, cyklin D1 akkumuleret betydeligt i S-fasen, med ingen signifikant akkumulering under G1 fasen. I modsætning hertil er forskellen i akkumuleret cyclin D1 mellem G1 og S-fase i NIH 3T3-celler syntes at være meget mindre. Disse resultater antyder, at cyclin D1 i disse cancerceller, destabiliseres under S fase gennem 26S proteasom pathway.

Figur 1F-H bekræfter, at destabilisering af cyclin D1 involverer polyubiquitination. I fig. 1F, HCT 116-celler blev transficeret med (bane 1-3) eller uden (bane 4) HA-mærket ubiquitin-cDNA og derefter synkroniseret til S-fase. Cellerne blev behandlet med MG132 (bane 3 og 4) eller uden det (bane 1 og 2) i en time. Lysater blev immunfældet med en cyclin D1-antistof (bane 2-4) eller kontrol IgG (bane 1) og immunblottet med et HA-antistof. En gruppe af langsommere migrerende bånd blev detekteret af HA-antistof udelukkende i de anti-cyclin D1-immunpræcipitater i nærvær af ubiquitin (bane 2 og 3) og den nedsatte mobilitet bånd blev yderligere forstærket efter udsættelse for MG132 (bane 3), hvilket indikerer, at disse bånd inkluderet polyubiquitinated cyclin D1. Disse observationer bekræftede, at cyclin D1 nedbrydes under S-fasen gennem ubiquitinproteasomvejen i HCT 116-celler. Fig. 1H viser, at mere end 70% af disse celler var i S-fasen.

For at identificere, hvor der er øget cyclin D1 nedbrydning under S-fasen, vi udvundet nukleare (N) og cytoplasmatisk (C) protein fra cellelysater indsamlet i fig. 1F bane 3 (fig. 1G). Histon H1 blev udelukkende påvist i den nukleare fraktion, mens MEK1 blev totalt udtryk i cytoplasmatiske ekstrakt, hvilket tyder på, at vi med succes fraktionerede cellelysater (fig. S1 [C]). Størstedelen af ​​cyclin D1 blev lokaliseret i cytoplasmaet (fig. S1 [C]). Nukleare og cytoplasmatiske ekstrakter blev immunfældet med antistoffer mod cyclin D1 (fig 1G, bane 1 og 2) eller IgG (bane 3) og immunblottet med et HA-antistof. Polyubiquitinated cyclin D1-bånd blev overvejende fundet i de cytoplasmatiske ekstrakter. Desuden har hæmning af nuklear-til-cytoplasmatisk lokalisering af cyclin D1 med Leptomycin B (LMB) ikke forbedre disse bånd markant i kernen (fig. S1 [D]). Vi konkluderer, at cyclin D1 nedbrydes i cytoplasmaet specifikt i S-fasen ved en proteasom-afhængig mekanisme i HCT 116-celler.

MAPK interagerer med cyclin D1 gennem en D-domæne og phosphorylerer Thr286

MAPK-aktivitet er forhøjet i alle undersøgte tre cancercellelinier (data ikke vist; [ref.4]). Vi undersøgte muligheden for, at Ras /Raf /MEK /ERK MAPK signaleringskaskade kan regulere phosphorylering af cyclin D1 rest Thr286, som efterfølges af prolin (figur 2A;. [Dommere 8.], [9])

.

MAPK phosphorylerer cyklin D1 på Thr286, som udløser efterfølgende ubiquitinering. (A) Identifikation af D-domænet i cyclin D1 (Cyc D1). Illustrationen af ​​fuld-længde human Cyc D1 viser området af D-domænet (A.A. 179-193) og MAPK phosphoryleringssite Thr (T) 286 efterfulgt af prolin (P) (udfyldt søjle og en pil, henholdsvis). Aminosyresekvensen af ​​D-domænet i Cyc D1 er afstemt med andre kendte MAPK-docking sites for forskellige ERK substrater. Dubletten af ​​basiske (+) og ikke-polære (φ) aminosyrer er konserverede rester i kernen D-domæne motiv L /I /V-X-L /I /V. Aminosyrepositioner af de mest 5’rester af D-domæner er angivet med numre i venstre for hver aminosyresekvens henholdsvis. (B, C) P42 ERK2

in vitro Salg kinase assays for cyclin D1 (øverste paneler). (B) vildtype eller T286A mutant rekombinant GST fuld længde Cyc D1-protein blev blandet med

32P-ATP i kinaseassay reaktionsbuffer i nærvær eller fravær af oprenset ERK2. Reaktioner blev udført ved 30 ° C i 30 minutter og stoppet ved tilsætning prøvepåsætningsbuffer. Prøver blev separeret med SDS-PAGE og

32P-optagelse blev detekteret ved autoradiografi. Immunblotting (IB) analyse ved anvendelse af antistoffer mod cyclin D1 er tilvejebragt som en reference for at vise substratmængder. (C) GST alene (bane 1), GST-C-terminale WT Cyc D1 fusionsprotein bevarer bindingssted MAPK (aminosyrerne 165-295, bane 2), T286A (bane 3) og en komplet deletion af D- domæne AD, bane 4) blev anvendt. IB-analyse under anvendelse af antistoffer til GST’er leveret som en reference for at vise substratmængder. (D) Immunopræcipitering (IP) og IB-analyse efter ektopisk udtryk for Flag-mærket ERK2 sammen med enten HA-mærket WT eller AD Cyc D1 i HCT 116 kolon kræftceller. En Western blot for input kontrol (10% totale lysater) er også vist. (E) Western blot-analyse med Thr286 phosphoryleret cyclin D1 (pCycD1 Thr286) og total Cyc D1 efter transfektion af forskellige former for HA-mærkede Cyc D1 ekspressionsvektorer i HCT 116 colon cancerceller. (F, G)

In vitro Salg Ubiquitineringsassays vha HeLa celleekstrakter Fraktion II som en kilde af enzymerne nødvendige for at konjugere ubiquitin til substrater og ATP. (F) GST-fuld længde Cyc D1 WT, T286A, eller AD blev anvendt til en reaktion enten med rekombinant ERK2 (bane 3-5) eller uden det (bane 1-2). Prøver blev separeret ved SDS-PAGE og immunblottet med en cyclin D1 antistof. ATP blev tilsat til alle baner, og ingen ubiquitin blev tilsat til bane 1. (G) GST-fuld længde Cyc D1 WT blev anvendt med eller uden ubiquitin. Efter SDS-PAGE separation blev immunobloting udført med antistoffer mod cyclin D1 (bane 1, 2) eller ubiquitin (bane 3, 4). (H, I) Pulse-chase analyse af cyclin D1 i HCT 116-celler efter udsættelse for U0126. Eksponentielt voksende HCT 116-celler blev behandlet med DMSO eller 10 pM U0126 i 30 min. (H) Celler blev puls-mærket med

35S-methionin og blev afdrevet til de angivne tidspunkter. Cyclin D1 blev immunopræcipiteret og derefter analyseret med SDS-PAGE. Autoradiografi blev udført. (I) Niveauer af metabolisk mærket-cyclin D1. (J) Western blot-analyse med pCycD1 Thr286, total cyklin D1, phosphorylering specifik ERK (pERK), og den samlede ERK antistoffer. (K) Cell cyklus distributioner er vist.

ERK /MAPK er en prolin (Pro) -dirigerede proteinkinase [26]. Det kræver en kinase docking websted (eller D-domæne) på dets substrat at øge phosphorylering effektivitet (figur 2A;. [Ref 27.]). D-domæner er blevet fundet i forskellige ERK substrater, såsom Elk-1, Sap-1, Sap-2, Ets-1 og c-myc (figur 2A;. [. Dommere 27], [28]). Vi søgte efter et D-domæne på cyclin D1 med Motif Scan software (https://scansite.mit.edu). Gennem en række strenge søgninger, vi identificeret en stærkt signifikant (inden 0,041 percentil) D-domænet på aminosyrer 179-193 (fig. 2A), hvilket tyder på, at Ras /Raf /MEK /ERK MAPK signaleringskaskade kan være ansvarlig for cyklin D1 fosforylering.

for at teste den mulighed, at renset ERK /MAPK kunne phosphorylere rekombinant cyclin D1, blev renset ERK2 sikkert bruges til at phosphorylere en glutathion

S

transferase (GST) -cyclin D1 fusionsprotein (fig. 2B og C). Oprenset ERK2 effektivt phosphoryleret GST-fuldlængde vildtype (WT) cyclin D1 (fig. 2B, bane 2). I modsætning hertil ERK2 undladt at phosphorylere T286A, en cyclin D1-mutant (fig. 2B, bane 4), hvilket antyder, at Thr286 er den største phosphoryleringssted af ERK /MAPK. Identiske resultater blev opnået i nærvær af oprenset CDK4 /6; ERK var i stand til at phosphorylere cyclin D1 ved Thr286, ikke kun i den monomere form, men også inden for cyclin D1-CDK4 /6-komplekser (data ikke vist).

For at bestemme om ERK /MAPK kræver D-domæne for effektiv cyclin D1 phosphorylering ved Thr286, udførte vi

in vitro

kinaseassays bruger fuldstændig deletion af D-domæne (AD) fra GST-C-terminale cyclin D1 fusionsprotein. Dette fusionsprotein bevarer MAPK bindingsstedet. Fig. 2C viser, at oprenset ERK2 effektivt phosphoryleret WT cyclin D1 (bane 2), men ikke den T286A og AD-mutanter (bane 3 og 4).

Disse resultater antyder kraftigt, at MAPK interagerer med cyclin D1 gennem sin D-domæne at phosphorylere Thr286. For at bekræfte denne mulighed, vi udførte en immunpræcipitation og immunblotting (IP-IB) analyse efter ektopisk udtryk for Flag-mærket ERK2 med enten HA-mærket WT eller AD cyklin D1 i HCT 116 tyktarmscancerceller (fig. 2D). ERK2 forbundet godt med WT cyclin D1 (bane 2) og dårligt med AD cyclin D1 (bane 3). At fastslå betydningen af ​​MAPK i phosphorylering af cyclin D1 på Thr286 i HCT 116-celler, transficerede vi cellerne med forskellige former for cyclin D1 ekspressionsvektorer (Fig. 2e). Ektopisk udtryk for cyklin D1 blev skelnes fra endogen udtryk ved reduceret mobilitet for HA-mærket cyclin D1. Vi analyserede fosforylering status eksogen cyklin D1 udtryk ved Thr286. Cyclin D1 phosphorylering var signifikant reduceret med udeladelsen af ​​D-domæne (bane 4). Disse observationer tydede på, at størstedelen af ​​Thr286 fosforylering i HCT 116 celler er gennem MAPK aktivitet.

Ras /MAPK-medieret ubiquitinering og nedbrydning af cyklin D1 er direkte knyttet til sammenslutningen af ​​MAPK /ERK med cyklin D1

Derefter undersøgte vi, hvorvidt MAPK-medieret phosphorylering af cyclin D1 kan føre ubiquitinering af cyclin D1

in vitro

(fig. 2F og G). Vi anvendte en ubiquitinering assay system, der bruger fraktion II HeLa celleekstrakter som en kilde af enzymerne nødvendige for at konjugere ubiquitin til substrater og ATP [29]. Polyubiquitination af cyclin D1 (fig 2F, bane 1 og 2) blev yderligere forstærket af ERK2 (fig. 2F, bane 3 og fig. 2G, bane 2 og 4). Langsommere migrerende bånd blev ikke påvist i fravær af ubiquitin (fig. 2G, bane 1 og 3), hvilket antyder, at de består af polyubiquitinated former af cyclin D1 (fig. 2G, bane 2 og 4). Vi mener, at polyubiquitination kræves direkte interaktion af ERK2 med cyclin D1 og phosphorylering af cyclin D1 på Thr286, fordi ubiquitinering i vidt omfang blev forhindret i D-domænet deletion mutant form (AD) og alanin for Thr286 substitution (T286A) af cyclin D1 ( Fig. 2F, bane 4 og 5).

stabiliteten af ​​cyklin D1 protein er reguleret af ERK /MAPK aktiviteter i HCT 116 kræftceller

Vi bestemt også bidraget fra ERK /MAPK til stabiliteten af ​​cyclin D1 i cancerceller. Vi udførte puls-chase analyse på metabolisk mærket-cyclin D1 efter at hæmme MAPK aktiviteter (fig 2H-K,. [Dommere 30.], [31]). Eksponentielt voksende HCT 116-celler blev behandlet med U0126 i 30 minutter, som i væsentlig grad udtømt den phosphorylerede form af ERK (pERK) og cyclin D1 på Thr286 (pCyc D1 Thr286) uden at påvirke cellecyklussen profil (fig. 2J og K). Niveauer af metabolisk mærket-cyclin D1 blev estimeret ved kvantitativ scanning som beskrevet ovenfor (fig. 2i). Reduktion MAPK-aktivitet forøget halveringstiden af ​​cyclin D1 fra 22,5 min til 54,6 min. Disse data indikerer, at stabiliteten af ​​cyklin D1 er reguleret af ERK /MAPK aktivitet i kræftceller.

cyclin D1 stabilitet reguleres via SCF eller SCF-lignende vej

På grund af den strenge specificitet E3 ligaser og deres substrater [18], cyklin D1 er tilbøjelige til at have sin egen E3 ligase. Vi antager, at cyclin D1 proteolyse medieres af SCF E3 ligaser eller en SCF-lignende kompleks af E3 ligaser, hvor en F-box-protein bestemmer specificitet for dets substrat. For at teste denne ide, udførte vi IP-IB-analyse (fig. 3A). Cyclin D1 fra eksponentielt voksende HCT 116 celler blev immunopræcipiteret og sekventielt blottet med antistoffer mod cyclin D1, CDK4, SKP1, CUL1 og CUL7. Cyclin D1 forbundet med SKP1, CUL1 eller CUL7, og CDK4, tyder på, at dens proteolyse medieres af SCF (SKP1-CUL1-F-box protein) eller SCF-lignende (SKP1-CUL7-FBXW8) kompleks af E3 ligaser.

FBXW8 ubiquitinerer cyclin D1 i en Thr286 fosforylering-afhængig måde. (A) IP-IB-analyse (til venstre). Protein fra eksponentielt voksende HCT 116-celler blev udfældet med antistoffer mod cyclin D1 eller IgG. Immunpræcipitater blev underkastet SDS-PAGE og sekventielt blottet med cyclin D1, CDK4, SKP1, CUL1 og CUL7 antistoffer. IB-analyse med 5% af totale cellelysater blev tilvejebragt som en kontrol (højre). (B) IB-analyse efter udtømning af SKP1 udtrykket for 48 timer efter behandling med SKP1 siRNA dobbelt-oligonukleotider i HCT 116 celler. Ikke-targeting siRNA (kontrol) og mock transfektion (-) tjente som kontroller. (C) IP-IB-analyse. Seksogtyve F-box fuld længde kodende cDNA’er blev klonet ind V5 eller Flag epitopmærke ekspressionsvektorer. Disse V5 eller FLAG-mærket F-box protein DNA-plasmider blev transficeret sammen med HA-mærkede cyclin D1 (HA-Cyc D1) og CDK4 ekspressionsvektorer i T98G-celler. Celler blev opsamlet 24 timer senere. Prøver blev præcipiteret med et HA-epitopmærke antistof. Immunpræcipitater blev underkastet SDS-PAGE og efterfølgende farvet med V5 eller Flag (F-box-proteiner), HA (Cyc D1) antistoffer. IB-analyse med 10% af totale cellelysater blev leveret (nederst). (D) IP-IB-analyse (øverst). V5-tagged F-box-protein DNA-plasmider blev transient transficeret sammen med enten HA-mærkede cyclin D1 (Cyc D1) vildtype (WT) eller T286A-mutant, og CDK4 ekspressionsvektorer i T98G-celler hhv. Prøver blev præcipiteret med et HA epitop-tag-antistof. Immunpræcipitater blev underkastet SDS-PAGE og efterfølgende blottet med V5 (F-box-proteiner), HA (Cyc D1), og Thr286 phosphoryleret cyclin D1 (pCyc D1 Thr286) antistoffer. IB-analyse med 10% af de samlede cellelysater blev givet til sammenligning (nederst). (E)

In vitro

ubiquitinering assay.

In vitro

oversat F-box proteiner med rekombinant GST-fuld-længde cyclin D1 (Cyc D1) vildtype, HeLa celle ekstrakter Fraktion II med ATP, Ubiquitin og ERK2, og

in vitro

-translated enten SKP1, RBX1 og CUL1, eller SKP1 blev RBX1 og CUL7 proteiner inkuberet ved 30 ° C i 2 timer. Prøver blev separeret ved SDS-PAGE og immunblottet med en cyclin D1 antistof. (F)

In vitro

polyubiquitination af cyklin D1 gennem SCF-lignende (SCFL) kompleks FBXW8 (SKP1-CUL7-FBXW8-RBX1 /SCFL

FBXW8). WT eller T286A GST Cyc D1 blev inkuberet i nærvær af oprenset ERK2 (bane 1 og 3) eller dens fravær (bane 2) ved 30 ° C i 2 timer. Prøver blev separeret ved SDS-PAGE og immunblottet med en cyclin D1 antistof. Asterisk angiver ikke-specifikke bånd. (G) Rekonstituering af polyubiquitination af cyklin D1 gennem SCFL

FBXW8

in vitro

hjælp renset E1 og E2. GST-WT Cyc D1 blev inkuberet med rekombinant SCFL

FBXW8 i nærvær eller fravær af E1 og E2 /Ubch5c. Prøver blev separeret ved SDS-PAGE og immunoblottet med en cyklin D1 antistof.

For at teste, om niveauet af cyclin D1 hovedsageligt er reguleret af SCF eller SCF-lignende vej, vi udførte en immunoblotanalyse 48 timer efter nedbrydende SKP1 udtryk med siRNA dobbelt-strengede oligonukleotider i HCT 116-celler (fig. 3b). siRNA for SKP1 signifikant reduceret SKP1 ekspression og resulterede i akkumulering af cyclin D1. Disse observationer kraftigt støtter tanken om, at cyclin D1 stabilitet reguleres via SCF eller SCF-lignende vej.

FBXW8, en F-box protein, specielt associerer med cyclin D1 i en Thr286 fosforylering afhængig måde

Vi identificerede næste proteinet er ansvarlig for cyclin D1 stabilitet. Vi testede kandidat humane F-box-gener til at identificere den unikke E3 ubiquitin-ligase for cyclin D1. Substratspecificitet af SCF komplekser sker gennem protein-protein interaktion domæner, som ofte tryptophan-asparaginsyre (WD) 40 motiver eller leucinrige gentagelser (LRR) inden F-box-proteiner [20], [21]. Vi søgte de NCBI databaser for human F-box proteiner med WD40 eller LRR motiver. Vi fandt cirka 70 potentielle gener. Blandt disse, 9 havde WD40 gentage motiver og 17 havde LRR motiver.

Vi opnåede disse gener ved først at udføre revers transkriptase-PCR (RT-PCR) ved hjælp af total RNA fra HEK 293, HCT 116 eller WI-38 celler . De cDNA’er i fuld længde vi hentet blev klonet ind V5 eller Flag epitop tag ekspressionsvektorer. For at løse hvorvidt nogen af ​​produkterne af disse gener kunne genkende cyclin D1, vi forbigående transficeret DNA plasmider til V5 eller FLAG-mærket F-box-proteiner i T98G-celler med eller uden N-terminale HA-mærkede cyclin D1 og CDK4 ekspressionsvektorer ( fig. 3C). Efter 24 timer blev cellerne opsamlet og udførte IP-IB-analyse. Prøverne blev udfældet med et HA-epitop-tag-antistof og farvet med Flag (FBXW7 og FBXL5) eller V5 (andre), og cyclin D1-antistoffer. Felt C viser cyclin D1 associere med to F-box-proteiner, FBXW8 (bane 7) og FBXL12 (bane 15). FBXW8 besad WD40 motiver og FBXL12 havde LRR motiver.

Fordi F-box proteinsubstrater skal phosphoryleres [19], vi testede, om FBXW8 og FBXL12 genkende cyklin D1 i en Thr286 fosforylering-afhængig måde. Vi transient transficeret T98G-celler med V5-mærkede F-box protein DNA-plasmider og cyclin D1 (vildtype eller T286A-mutant) og CDK4 ekspressionsvektorer. Prøver blev præcipiteret med et HA-epitopmærke antistof og blottet med V5, HA og Thr286 phosphoryleret cyclin D1-antistoffer (fig. 3D). FBXW8 var forbundet med både cyclin D1 vildtype og T286A mutanten, men de fleste var bundet til vildtype, som var hovedsagelig phosphoryleret i Thr286. I modsætning hertil ser vi ikke en signifikant forskel mellem vildtype cyclin D1 og mutanten i samarbejde med FBXL12. Disse resultater antyder, at FBXW8 genkender cyclin D1 i en Thr286-phosphorylering-afhængig måde, men FBXL12 ikke. I overensstemmelse med dette resultat, var FBXL12 ikke involveret i cyclin D1 polyubiquitination

in vitro

(fig. 3E, bane 9). Vi konkluderede, at FBXW8 kan spille en rolle i cyclin D1 stabilitet.

FBXW8 ubiquitinerer cyclin D1 i en Thr-286-phosphorylering afhængig måde

Vi undersøgte, om

in vitro

ubiquitinering af cyclin D1 kræver FBXW8 (fig. 3E). Vi inkuberet hver

in vitro

-translated F-box protein med rekombinante GST-cyclin D1 (Cyc D1), fraktion II HeLa celleekstrakter med ATP, ubiquitin og ERK2, og enten

in vitro

-translated SKP1, RBX1 og CUL1 eller SKP1, RBX1 og CUL7 proteiner. Dernæst vi blottet dem med en cyclin D1 antistof. Cyclin D1 ubiquitinering blev påvist i kombinationerne af FBXW8 med SKP1, CUL1, og RBX1 (bane 5), eller FBXW8 med SKP1, CUL7, og RBX1 (bane 6). Imidlertid blev polyubiquitinated bånd ikke øget i andre kombinationer. For at bekræfte, at SCF komplekser blev samlet ordentligt på

in vitro

translation, vi udførte immmunoprecipitation med hver F-box protein i

35S-mærket

in vitro

oversat prøver (ikke vist ) og testet, om de komplekser indeholdende β-TRCP var funktionelle for polyubiquitination af β-catenin (fig. S1 [E]). Vores resultater tyder på, at cyclin D1 ubiquitinering involverer FBXW8.

Vi næste undersøgt, om

in vitro

ubiquitinering af cyclin D1 gennem SCF-lignende (SCFL) kompleks FBXW8 (SKP1-CUL7-FBXW8-RBX1 /SCFL

FBXW8) kræver phosphorylering af cyklin D1 på Thr286 (fig. 3F). Polyubiquitination gennem SCFL

FBXW8 blev dramatisk reduceret med udtømning af ERK2 (bane 2). Endvidere blev cyklin D1 polyubiquitination høj grad forhindret af alanin-til-Thr286 substitution (T286A, bane 3), hvilket tyder på, at phosphorylering af cyklin D1 på Thr286 er nødvendig for ubiquitinering af SCFL

FBXW8. Disse data er i god overensstemmelse med vores observation, at FBXW8 specifikt associerer med cyclin D1 i en Thr286 fosforylering-afhængig måde.

Endelig har vi rekonstitueret cyklin D1 polyubiquitination

in vitro

hjælp renset E1 og E2 enzymer (fig. 3G). SCFL

FBXW8 fremmer Ubch5c-katalyseret polyubiquitin kæde samling [22]. Fig.