PLoS ONE: Primær Cilia går tabt i Preinvasive og invasiv Prostata Cancer

Abstrakt

Prostatakræft er den anden mest almindeligt diagnosticeret kræft hos mænd verden over. Der vides kun lidt om den rolle af primær cilier i preinvasive og invasiv prostatakræft. Imidlertid har reduceret cilier ekspression observeret i humane cancere herunder pancreascancer, renalcellecarcinom, brystcancer, cholangiocarcinom, og melanom. Formålet med dette studie var at karakterisere primære cilier ekspression i preinvasive og invasiv human prostatacancer, og til at undersøge sammenhængen mellem primære cilier og Wnt signalvejen. Humant prostatavæv repræsenterer stadier af dannelse prostatacancer (normal prostata, prostata intraepitelialneoplasi (PIN), og invasiv prostatacancer (herunder perineural invasion)) blev farvet for ciliære proteiner. Hyppigheden af ​​primære cilier blev bestemt. Et fald i andelen af ​​cilierede celler i PIN, invasiv cancer og perineurale invasion læsioner blev observeret i forhold til det normale. Cilia længder blev også målt til indirekte teste funktionaliteten. Cilia var kortere i PIN, cancer og perineurale invasion læsioner, hvilket tyder dysfunktion. Primære cilier er blevet vist at undertrykke Wnt-vejen. Øget Wnt signalering er blevet impliceret i prostatacancer. Derfor undersøgte vi en korrelation mellem tab af primær cilier og øget Wnt signalering i normal prostata og i preinvasive og invasiv prostatacancer. For at undersøge Wnt signalering i vores kohorte blev vævssnit serielle farvet for β-catenin som et mål for Wnt-signalering. Nuklear β-catenin blev analyseret og Wnt-signalering viste sig at være højere i un-cilierede celler i den normale prostata, PIN, en delmængde af invasive cancere, og perineurale invasion. Vores resultater antyder, at cilier normalt fungerer til at undertrykke Wnt signalvejen i epitelceller og at cilier tab kan spille en rolle i øget Wnt signalering i nogle prostatakræft. Disse resultater tyder på, at cilier er dysfunktionel i human prostatacancer, og øge Wnt signalering sker i en delmængde af kræft

Henvisning:. Hassounah NB, Nagle R, Saboda K, Roe DJ, Dalkin BL, McDermott KM (2013 ) Primær Cilia går tabt i Preinvasive og invasiv prostatakræft. PLoS ONE 8 (7): e68521. doi: 10,1371 /journal.pone.0068521

Redaktør: Vladislav V. Glinskii, University of Missouri-Columbia, USA

Modtaget: Marts 01, 2013; Accepteret: 30. maj 2013; Udgivet: 2 juli 2013

Copyright: © 2013 Hassounah et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Science Foundation of Arizona (https://www.sfaz.org), Kræftens Biology Training Grant (NIH, T32CA009213), University of Arizona Cancer center Support Grant (NIH, P30CA023074), en R00 (NIH- NICHD, R00HD056965); og bedre end nogensinde Foundation (https://azcc.arizona.edu/outreach/bte). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

den primære cilium er en mikrotubulus-baseret organel der rager ud fra plasmamembranen og virker meget som en “antenne” for at afføle ekstracellulære signaler. Primære cilier er normalt kun er ubevægelige sædceller, men kan mærke fysiske og kemiske signaler. Celler med primær cilier har kun en enkelt cilium der strækker sig fra celleoverfladen. Ved foden af ​​den primære cilium er den basale legeme (også kendt som moderen centriole), som er forankret til plasmamembranen. Den basale krop nukleerer de mikrotubuli bundter, som strækker sig op cilium (figur 1A). Hundreder af proteiner er blevet identificeret, som udgør den primære cilium [1]. Mange af disse proteiner lokalisere til den cilium at regulere de sensoriske eller signalfunktion af den primære cilium. Cilia handle som antenner gennem sensing ekstracellulære signaler og hjælpe med at regulere cellesignalering; for eksempel primære cilier er negative regulatorer af Wnt-vejen [2,3]. Specifikt primære cilier dæmpe Wnt signalering respons ved afskaerme Wnt signaling proteiner, såsom den positive regulator Jouberin [3]. Cilia har en dokumenteret rolle i udviklingsmæssige biologi og menneskelige sygdomme kendt som ciliopathies (f.eks Joubert syndrom (JBTS), polycystisk nyresygdom (PKD), Bardet-Biedl syndrom (BBS), og nephronophthisis (NPHP)) [4].

Billeder af (A) normal prostata og (B) invasiv prostatacancer. Serielt tilstødende objektglas blev farvet med H større end 75

percentil for normalt væv) og blå linie og pil svarer til Q1 (kvartil 1, mindre end eller lig med 25

percentil for normal væv). Statistik blev udført under anvendelse af lineær regression (*** = p 0,001) (C, nederst). Procenten af ​​patienter med et unormalt højt procent cilier (Q4, orange) eller et unormalt lavt procent cilier (Q1, blå). (D) Procent af Ki67-positive invasive cancerceller og perineurale invasion cancerceller per patient (x-aksen) som funktion af procentuel cilierede cancerceller for den samme patient (y-aksen). Statistisk analyse var en ikke-parametrisk spearman korrelation.

Cilia også spille en kausal rolle i tumorigenese [5,6]. Musemodeller viser, at i nogle sammenhænge cilier er forpligtet til at fremme kræft, mens i andre miljøer tab af cilier øger tumorincidens. Reduceret cilia ekspression er blevet observeret i humane cancere herunder pancreascancer, renalcellecarcinom, brystcancer, cholangiocarcinom, og melanom [7-11]. Disse undersøgelser understøtter den hypotese, at primære cilier kan fungere som en tumorsuppressor organel i visse væv. Tab af primær cilier blev yderligere demonstreret i præmaligne pancreas intraepitelialneoplasi, hvilket antyder, at cilier tab kan være nødvendigt at forekomme tidligt at give mulighed for bugspytkirtelkræft dannelse [10].

Hyppigheden og funktionaliteten af ​​primær cilier i preinvasive og invasiv human prostatakræft er ikke blevet grundigt karakteriseret. Prostatakræft er den anden mest almindeligt diagnosticeret kræft og den sjette hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald blandt mænd i hele verden. Den kanoniske Wnt signalvejen er blevet impliceret i human prostatacancer, men den rolle, denne vej i prostatacancer, er ikke fuldt forstået. Den aktuelle undersøgelse er rettet mod at karakterisere primære cilier frekvens og funktion i human prostatacancer og undersøge sammenhængen mellem primære cilier udtryk og Wnt signalering. Vi viser, at den primære cilier frekvens er faldet i alle stadier af prostatakræft, fra tidlig preinvasive læsioner til invasive stadier. Primære cilia længder er også faldet i preinvasive og invasiv prostatakræft, hvilket tyder på tab af funktion. Vi demonstrerer endvidere, at cilier fravær korrelerer med øget nuklear β-catenin lokalisering i normalt prostatavæv, og nuklear β-catenin opreguleres i PIN, en delmængde af prostatakræft, og perineurale invasion områder.

Materialer og metoder

Menneskelige vævsprøver

Alle formalin-fikseret paraffinindstøbte vævsprøver blev opnået fra Tissue Køb og Cellular /Molekylær Analyse Shared service (TACMASS) ved University of Arizona Cancer center. Prostatektomi vævsprøver blev erhvervet fra patienter, der gennemgår åbne radikale prostatektomi fra 2006 til 2009. Væv fra én patient blev erhvervet gennem transuretral resektion af prostata. Til prostata væv, blev i alt 32 blokke fra 25 tilfælde valgt ud fra tilstedeværelsen af ​​områder af interesse, der blev identificeret ved en patolog ser på arkiverede hematoxylin og eosin (H 0,1 ng /ml for to på hinanden følgende målinger. Rækken af ​​længden af ​​tid mellem kirurgi og sidste opfølgning er 10 måneder til 16 år. Patologisk normale, kræft-fri prostatavæv fra 10 patienter blev anvendt som kontroller og blev opnået fra patienter med blærecancer som gennemgik cystoprostatectomies.

Serielle vævssnit blev skåret for hver patientprøve. Den første serielle snit blev farvet for H n = 8), prostata intraepitelialneoplasi (PIN, n = 24), lav kvalitet PIN (LG PIN, n = 13) og high-grade PIN (HG PIN, n = 18), lav kvalitet (LG, Gleason sum score = 6; n = 35) og ædelstål kræftformer (HG; Gleason sum score 6; n = 40), og perineural invasion læsioner (n = 18). Alle de vævstyper blev taget fra de radikale prostatektomi, bortset fra den patologisk normale prostatavæv fra blærecancerpatienter (disse var fra cystoprostatectomies). Syv patienter havde både LG (øget nuklear-til-cytoplasmatisk forhold, og øget nuklear størrelse) og HG (tilstedeværelse af prominente nucleoli, øget nuklear-til-cytoplasmatisk forhold, og øget nuklear størrelse) PIN-kode. Gleason sum score er en klassificering metode til at vurdere graden af ​​differentiering [12]

Immunofluorescens

Vævet slide seriel til H . E-farvede objektglas blev anvendt til co-farvning af cilia, centrosomer og cytokeratin 5 (CK5). Paraffinindlejrede væv objektglas blev deparaffineret i en tør inkubator ved 65 ° C i 15 minutter og hydreret ved vask med xylen (2 x 10 min), 100% isopropanol (2 x 10 min), 70% isopropanol (2 x 10 min) , 50% isopropanol (2 x 10 min), og ultrarent vand (2 x 10 min). Alle vaske var ved stuetemperatur. Antigen-genvinding med en 1 mM EDTA demaskerende opløsning blev udført under anvendelse af en 2100 Retriever (Electron Microscopy Sciences) ifølge producentens instruktioner. Tissue slides blev placeret i Shandon Coverplates (Thermo Scientific, Cat # 72-110-017) og derefter ind i Sequenza Slide Racks (Thermo Scientific, Cat # NC0263065). Væv objektglas blev blokeret med ChemMate Antibody Dilution Buffer (Ventana Medical Systems, Inc., Cat # ADB250) med gedeserum (5%) (Invitrogen Corporation, Cat # 16.210-064) i 45 minutter ved stuetemperatur. Primære og sekundære antistoffer blev fortyndet i ChemMate Antibody Dilution Buffer på 1: 1000. Primære antistoffer blev anvendt mod acetyleret tubulin (muse monocloncal IgG

2B, Sigma, Cat # T7451, klon 6-11B-1), γ-tubulin (muse monoklonalt IgG1, Sigma, Cat # T5326, klone GTU-88), og CK5 (kanin polyklonalt, Abcam, Cat # ab24647) og inkuberet på vævet natten over ved 4 ° C. Fem objektglas blev farvet med et andet primært antistof mod CK5 (klar til brug monoklonalt muse-IgG1, Leica Microsystems, Cat # CK5-R-7-CE) at kontrollere specificiteten af ​​CK5 anvendte antistof. En prostata væv slide med normale og ondartede områder blev også farvet med et primært antistof mod Arl13b (monoklonalt muse-IgG

2a, UC Davis /NIH NeuroMab Facility, klon N295B /66) for at kontrollere mærkning af cilier med antistof mod acetyleret tubulin. Objektglassene blev derefter vasket med PBS i 10 minutter (3 x 10 min). De sekundære antistoffer blev anvendt, var tetramethylrhodamin-isothiocyanat (TRITC) -mærket gede-anti-muse-IgG

2B (Southern Biotech, Cat # 1090-1003), Alexa 633-mærket gede-anti-muse-lgG1 (Invitrogen, Cat # A21126) , Alexa 546-mærket gede-anti-muse-IgG

2a (Invitrogen, Cat # A21133) og fluoresceinisothiocyanat (FITC) -mærket gede-anti-kanin-IgG (Southern Biotech, Cat # 4052-02). Sekundære antistoffer blev inkuberet på vævet i 45 minutter ved stuetemperatur. Objektglas blev vasket med PBS i 10 minutter (3 x 10 min). Hoechst 33342 (Cat # H3570, Invitrogen) blev anvendt som en modfarve ved 1: 1000 og inkuberet på objektglas i 10 minutter, efterfulgt af vask med PBS i 5 minutter (2 x 10 min). Slides blev monteret med 1,5 dækglas (0,16-0,19 mm tykkelse) (Fisher Scientific, Cat # 12-544B) ved hjælp Prolong Gold antifade montering medier (Cat # P36934, Invitrogen).

Konfokal imaging

vævet dias, der var serielt tilstødende til digitalt scannet H 25

percentil -1.5X interkvartile område, eller 75

percentil + 1,5x interkvartile område (åbne cirkler). Ekstreme outliers blev defineret som enten 25

percentil -3X interkvartile område, eller 75

percentil + 3X interkvartile range (sælges cirkler). Vi udnyttede data opnået om procent cilier og cilier længde findes i normal prostata til at etablere en cutoff at give en relativ sammenligning punkt at cilier findes i PIN og kræft prøver. De øvre og nedre 25

percentil blev valgt som vores relative normale cutoffs og dette blev holdt konsekvent i hele vores analyse. Fra boxplots, blev procentdelen af ​​patienter med en unormal procent af cilierede celler eller unormal median cilier længde beregnes. Disse unormale målinger blev defineret af 75

th og 25

th percentiler af normal. Værdier blev anset for unormalt høj, hvis de faldt over 75

percentil af normal og unormalt lave, hvis de faldt på eller under 25

percentil af det normale. Intet er kendt om præcise længder af cilier er nødvendige for normal funktion. Derfor er vores øverste og nederste 25

percentil cutoff kun give en referenceramme for sammenligning til normal.

Immunhistokemi

formalinfikseret paraffinindlejrede væv slides blev farvet med en lignende protokol, der anvendes til immunofluorescently farvede objektglas beskrevet ovenfor. Antigen genfinding blev udført som beskrevet, men med vektoren antigen demaskering Solution (1: 106) (Vector Laboratories, Cat # H-3300), efterfulgt af quenching af endogen peroxidaseaktivitet ved stuetemperatur i 20 minutter under anvendelse af hydrogenperoxid i methanol (0,3% ). Objektglas blev derefter vasket med PBS (4 x 10 min), som er tilføjet i Shandon Coverplates (Thermo Scientific, Cat # 72-110-017) og derefter ind Sequenza objektglasstativer (Thermo Scientific, Cat # NC0263065). Objektglas blev derefter blokeret med 2,5% normalt hesteserum blokeringsbuffer (Vector Laboratories, Cat # S-2012) i 20 minutter, og derefter med ChemMate Antibody Dilution Buffer (Ventana Medical Systems, Inc., Cat # ADB250) med gedeserum (5 %) (Invitrogen Corporation, Cat # 16.210-064) i 45 minutter. Alle vaske og blokerende trin var ved stuetemperatur. Primære antistoffer blev fortyndet i ChemMate Antibody Dilution Buffer. De følgende primære antistoffer blev anvendt: p-catenin primært antistof (1: 400, monoklonalt muse IgG1, BD Transduction Laboratories, Cat # 610.154) og Ki67 (1: 100, monoklonalt muse IgG1, Dako, Cat # M7240, klon MIB-1 ). Colonadenocarcinom væv objektglas blev anvendt som en positiv kontrol for β-catenin og Ki67-farvning. Væv objektglassene med sekundært antistof kun blev anvendt som en negativ kontrol. Primære antistoffer blev inkuberet på væv natten over ved 4 ° C. Objektglas blev derefter vasket i PBS (3 x 10 min). En universal anti-kanin, anti-muse-sekundært antistof konjugeret til peroxidase (ImmPress Universal Reagent, Vector Laboratories, Cat # MP-7500) blev inkuberet på vævet i 30 minutter, efterfulgt af en vask i PBS i 5 minutter. 3-amino-9-ethylcarbazol (AEC) med høj følsomhed substrat chromogen (Dako, Cat # K3461) blev anvendt som den peroxidase substrat for β-catenin og Ki67-farvning. AEC blev inkuberet på slides i 3 minutter for β-catenin farvning og 7 minutter for Ki67 farvning. Væv objektglas blev skyllet med destilleret vand i 5 minutter. Hematoxylin 1 (Thermo Scientific, Cat # 7221) blev anvendt til kontrastfarve væv slides. Hematoxylin 1 blev fortyndet 1: 3 og inkuberet på væv objektglas i 15 sekunder og derefter skyllet i ledningsvand indtil vandet løb klart. Faramount Vandig Montering Media (Dako, Cat # S3025) blev anvendt til montering dias ved hjælp af 1,5 dækglas (0,16 til 0,19 mm tykkelse) (Fisher Scientific, Cat # 12-544B).

Immunhistokemi analyse

Hele objektglas farvet for β-catenin blev scannet under anvendelse af en automatiseret Dmetrix scanneren 20x forstørrelse (DMetrix Inc.). Slides farvet for Ki67 blev scannet ved hjælp af en 20x objektiv med BioImagene scanner (Ventana Medical Systems). De samme steder, der anvendes til primær cilier analyse blev fundet ved at referere den kommenterede H 6020 (26,3) 60-6411 (14,5) 65-6926 (34,2) 70-7416 (21,1) 743 (3,9) Median = 65 Mean = 64 ± 7 Range = 46-77Gleason sum scoren = 75635 (46,7) 7-1040 (53,3) PIN kvalitet * n = 24Low grade13 (54,2) høj grade18 (75) Patologisk stagen = 77pT1-pT225 (32,5) pT352 (67,5) Volumen af ​​største tumor (cc) n = 25 3,08 (32) 3.0-6.09 (36) 6.1-9.04 (16) 9.1-122 (8) 122 (8) Median = 4 Mean = 6,3 ± 8,3 Range = 0.13-42Pre-operative fri serum PSA (ng /ml)n=58 3.03 (5,2) 3.0-6.024 (41,4) 6.1-9.015 (25,9) 9.1-124 (6,9) 1212 (20,7) Median = 6,4 Mean = 11,2 ± 20,4 Range = 1.8-154Biochemical gentagelse * * n = 78Yes44 (56,4) No34 (43,6) tabel 1. Oversigt over patient og kliniske data.

* Syv patientprøver har både lav kvalitet og høj kvalitet PIN (prostata intraepithelial neoplasi). ** Biokemisk tilbagefald defineret som fri serum PSA 0,1 ng /ml for to på hinanden følgende målinger. Tid fra operation til sidste optagede PSA målinger for patienter uden biokemiske gentagelse varierer fra 12,5 måneder til 15,2 år, og for patienter med recidiv tiden fra kirurgi til biokemiske gentagelse varierer fra 1,3 måneder til 13 1 år. CSV Hent CSV

Tab af primær cilier blev set i prostata preinvasive prøver (PIN, lav kvalitet (LG) og high-grade (HG) kombineret). Den mediane procentdel af cilierede epitelceller i PIN (median = 5,7%) faldt 36% i forhold til normale epitelceller (median = 8,9%; p = 0,24, figur 1C, top og tabel S1A i tabel S1). Selvom dette ikke er en statistisk signifikant forskel, 70,8% af PIN prøverne havde en usædvanlig lav (faldende på eller under 25

percentil af normale, Q1) procentdel af cilierede epitelceller (figur 1C, bund og tabel S1B i tabel S1). Der var også en overordnet signifikant lineær tendens til faldende procent cilia med stigende sværhedsgrad af prostatacancer (p 0,0001; tabel S1A i tabel S1). Selv om denne model forudsætter stigende sværhedsgrad fra normal, PIN, invasiv cancer, og derefter til perineural invasion, anerkender vi, at ikke alle kræfttilfælde udvikle sig i denne sekvens. Det skal bemærkes, at adskille de PIN prøver til LG og HG grupper ikke afslørede en statistisk signifikant forskel i procentdelen af ​​cilierede celler i hele undersøgelsen, så LG og HG PIN ikke blev adskilt til yderligere procent cilier analyser.