PLoS ONE: Insulin-lignende vækstfaktor 2 Silencing Gendanner Taxol Følsomhed i Drug Resistant Kræft i æggestokkene

Abstrakt

Lægemiddelresistens er en hindring for den effektive behandling af kræft i æggestokkene. Vi og andre har vist, at insulin-lignende vækstfaktor (IGF) signalvejen er en hidtil ukendt potentielt mål at overvinde medikamentresistens. Formålet med denne undersøgelse var at validere IGF2 som et potentielt terapeutisk mål i lægemiddelresistent ovariecancer og at fastlægge effekten af ​​målretning IGF2

in vivo

. En analyse af The Cancer Genome Atlas (TCGA) data i serøs kræft i æggestokkene kohorte viste, at høj IGF2 mRNA ekspression er signifikant associeret med forkortet interval til sygdomsprogression og død, kliniske indikatorer for resistens. I en genetisk afvigende panel af æggestokkene cancercellelinier blev IGF2 mRNA-niveauer målt i cellelinier resistente over for forskellige mikrotubulusstabiliserende midler, herunder Taxol sig at være signifikant forhøjet sammenlignet med lægemiddelpartiklerne følsomme cellelinier. Effekten af ​​IGF2 knockdown på Taxol modstand blev undersøgt

in vitro

in vivo

. Forbigående IGF2 knockdown signifikant sensibiliserede lægemiddelresistente celler til Taxol behandling. En Taxol-resistente æggestokkræft xenograft model, der er udviklet fra HEY-T30 celler, udviste ekstrem resistens, hvor den maksimalt tolererede dosis af Taxol ikke forsinke tumorvækst i mus. Blokering af IGF1R (et transmembrant receptor, som transmitterer signaler fra IGF1 og IGF2) anvendelse af et monoklonalt antistof ændrede ikke respons på Taxol. Imidlertid stabil IGF2 knockdown benytter kort hårnål RNA i HEY-T30 effektivt restaureret Taxol følsomhed. Disse resultater validere IGF2 som et potentielt terapeutisk mål i drug resistente ovariecancer og viser, at direkte rettet mod IGF2 kan være en foretrække strategi i forhold til at målrette IGF1R alene

Henvisning:. Brouwer-Visser J, Lee J, McCullagh K, Cossio MJ, Wang Y, Huang GS (2014) Insulin-lignende vækstfaktor 2 Silencing Gendanner Taxol Følsomhed i Drug Resistant kræft i æggestokkene. PLoS ONE 9 (6): e100165. doi: 10,1371 /journal.pone.0100165

Redaktør: Shannon M. Hawkins, Baylor College of Medicine, USA

Modtaget: Februar 28, 2014 Accepteret: 22 maj 2014; Udgivet 16. juni, 2014

Copyright: © 2014 Brouwer-Visser et al. . Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering: yde støtte blev leveret af National Cancer Institute-National Institute of Child Health and human Development (K12 HD00849) og den amerikanske Kongres Obstetrikere og Gynækologer gennem reproduktive Scientist Development Program pris til GSH. Forfatterne anerkender brugen af ​​Albert Einstein Cancer Center delte ressourcer (flowcytometri Core, histologi og sammenlignende Pathology Core), støttet af National Cancer Institute Cancer Center Support tilskud P30CA013330. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ovariecancer er den førende årsag til gynækologisk cancer dødsfald i USA. Siden midten af ​​1990’erne, den standard behandling for kræft i æggestokkene er kirurgisk cytoreduktion og systemisk kemoterapi, normalt Taxol og platin [1]. Men størstedelen af ​​patienterne i sidste ende bukke under for tilbagevendende, progressiv sygdom på grund af resistens mod kemoterapi

Ud over de veletablerede roller i udvikling og vækst, aldring, og carcinogenese [2] -. [6], insulin-lignende vækstfaktor (IGF) signalvejen er for nylig blevet impliceret i resistens [7] – [11]. Som vi tidligere rapporteret, opregulering af insulin-lignende vækstfaktor 2 (IGF2) er en akut cellulær respons på Taxol behandling, og dens ekspression modulerer responset på Taxol i lægemiddelresistente æggestokkene cancercellelinier. [7]. Da Taxol bruges i den første linje behandling af ovariecancer, vi hypotese, at høje IGF2 ville være forbundet med iboende klinisk resistens narkotika, manifesterer som faldt tid til sygdomsprogression /tilbagefald hos patienter. Støtte denne hypotese, vores forudgående undersøgelse ved hjælp af en væv microarray tilgang viste, at høj IGF2 udtryk i æggestokkene tumorvæv var faktisk prædiktiv for forkortet interval til progression /recidiv.

Baseret på disse laboratorie- og kliniske data, vi bestemt, at IGF2 er en potentiel terapeutisk mål at forbedre resistens i kræft i æggestokkene, men til vores viden, ingen forudgående

in vivo

valideringsundersøgelser er blevet gjort. Derfor, som beskrevet heri, vi udførte undersøgelser for at vurdere, om kunne overvindes Taxol modstand

in vivo

ved at målrette IGF2. Vi undersøgte virkningen af ​​IGF2 knockdown på ikke blot Taxol virkninger, men også svaret på ikke-taxan mikrotubulus interagerende lægemidler og andre lægemidler, som normalt anvendes i behandlingen af ​​ovariecancer. For at bekræfte den kliniske relevans af vores resultater, en analyse af den serøse ovariecancer kohorte af The Cancer Genome Atlas (TCGA) blev udført for at evaluere forholdet mellem IGF2 udtryk og kliniske resultater.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle eksperimenter dyr blev udført med godkendelse af Institutional Animal Care og brug Udvalg (protokol 20.130.604) i Albert Einstein College of Medicine i Yeshiva Universitet. Den institutionelle Animal Welfare Assurance (A3312-01) for denne anlægget er fuldt akkrediteret af Association for vurdering og akkreditering af Laboratory Animal Care (AAALAC) siden 22. februar blev 1983. Dyr plejet som pr dyreværnsloven og NIH “guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr”.

cellelinier og reagenser

ovariecancer cellelinier A2780 [12] og hey [13] (slags gaver fra Dr. Susan Band Horwitz), og ovariecarcinom cellelinie NIH: OVCAR8 [14] (en venlig gave fra Dr. David Goldman) blev dyrket i RPMI-1640 (Life Technologies) med 10% kalvefosterserum (Life Technologies) og 1% penicillin /streptomycin (Life Technologies) ved 37 ° C med 5% CO

2. Alle lægemiddelresistente cellelinier blev frembragt af forfatterne, undtagen HEY-Epo8 (en gave fra Dr. Susan Band Horwitz), som blev udviklet af Dr. C-P Huang Yang hjælp epothilon B [15]. Taxol-resistent HEY-T30 cellelinje blev genereret fra HEY-celler, som tidligere beskrevet [7]. Den A2780-T15 cellelinje blev genereret på lignende måde fra A2780 under anvendelse Taxol markering men i den kontinuerlige tilstedeværelse af 15 pM verapamil (Sigma). A2780-B20 og HEY-B20 blev udvalgt for resistens over for ixabepilon (Ixempra Bristol-Myers Squibb), og OVCAR8-D30 til discodermolid. Cellelinier blev godkendt ved hjælp af Genemarker 10 (Promega). Resistente cellelinier blev matchet til deres følsomme linjer og offentliggjorte data, når de foreligger. Cellelinier blev rutinemæssigt screenet for mycoplasma med MycoAlert (Lonza). Celler blev dyrket i stoffri medier i mindst 18 timer før forsøg undtagen A2780-T15, som blev dyrket i nærvær af 0,5 nM Taxol. Klinisk formuleret Taxol (Hospira) blev fortyndet 6-fold i 5% dextrose vand (Hospira) til en slutkoncentration på 1 mg /ml for xenograft eksperimenter. NVP-AEW541, en lille molekylvægt kinase inhibitor af IGF1R, blev leveret af Novartis Pharma AG [16]. Et monoklonalt antistof til IGF1R, IMC-A12 (Cixutumumab) blev leveret af Imclone, et fuldt ejet datterselskab af Eli Lilly and Company.

IGF2 Gene Expression Analysis i kliniske prøver af kræft i æggestokkene

cBioPortal for Cancer Genomics blev brugt til at få adgang til genekspression og kliniske data fra Cancer Genome Atlas Project (TGCA) [17]. Forespørgslen blev udført ved hjælp af alle Komplette Tumorer i æggestokkene serøs cystadenocarcinoma (TCGA, Nature 2011) datasæt, som omfatter 489 tilfælde af høj kvalitet serøs kræft i æggestokkene. For IGF2 mRNA Expression Z-scores, en tærskel på 1,6 standardafvigelser over middelværdien definerede IGF-high gruppe; alle andre tilfælde blev inkluderet i IGF2-normal gruppe.

Kvantitativ PCR

Cellelysater blev homogeniseret under anvendelse Qiashredder søjler (Qiagen Inc., Valencia, CA), og total RNA blev isoleret ved RNeasy Mini (Qiagen). RNA koncentration og renhed blev vurderet ved hjælp af en NanoDrop spektrofotometer (Fisher Thermo Scientific), viser OD 260/280 forholdet intervallet 2,03-2,11. RNA integritet blev udtaget under anvendelse af en Agilent Bioanalyzer (Agilent Technologies), der viser en RIN score interval på 9,8 til 10 Komplementær DNA blev foretaget ved at udføre revers transkription (RT) under anvendelse af SuperScript Vilo cDNA Synthesis Kit (Life Technologies) ifølge producentens instruktioner, anvendelse af 1 ug totalt RNA for alle cellelinjer med undtagelse af A2780, A2780-T15 og A2780-B20, for hvilke 2 ug total RNA blev anvendt. Kvantitativ realtids-PCR blev udført med en Eppendorf Mastercycler ep

realplex2

anvendelse af en 3-trins metode (95C 10 min; efterfulgt af 40 cykler af 95 ° C i 10 sek, 60 ° C i 20 sekunder, 72 ° C i 20 sekunder; derefter til smeltning kurve 95C 15 sek, 60 ° C til 95 ° C i løbet af 20 min). Hver reaktion anvendte 1 /20th af cDNA reaktionen frem og reverse primere i en slutkoncentration på 200 nM, og PowerSYBR (Applied Biosystems, Foster City, CA) fortyndet i ultrarent vand (Life Technologies) til 1X slutkoncentration i en endelig reaktion volumen på 10 pi. Exon junction-spænder primere (tabel S1) blev valideret ved analyse af smeltende kurver og forstærkning effektivitet. En mRNA udtryk score blev beregnet ved hjælp af formlen * 1000, hvor ΔC

t er forskellen i C

t (cyklus tærskel) mellem genet af interesse og den interne normalisering genet,

PPIB

( peptidylprolyl isomerase B; cyclophilin B).

PPIB

blev verificeret at have stabile mRNA ekspressionsniveauer i forældrenes, narkotika resistente, og transficeret ovarie cellelinjer herunder: HEY, HEY-T30, HEY-B20, HEY-T30 shIGF2-p, HEY-T30 shIGF2 -v, HEY-T30 shScrambled, A2780, A2780-T15, A2780-B20. Den gennemsnitlige forskel i C

t-værdier, når de evaluerer

PPIB

udtryk i parvise sammenligninger af disse cellelinjer var 0,2 (95% konfidensinterval på -0,1 til 0,5). Fold-ændring i relativ mRNA-ekspression blev beregnet ved anvendelse af fremgangsmåden [7]. Genomisk DNA blev isoleret med AllPrep mini kit (Qiagen). Primere blev designet til at spænde over en intron-exon junction og blev valideret ved smeltning og effektivitet kurve analyse. Albumin (

ALB

) blev anvendt til intern normalisering. Ved vifte komparativ genomisk hybridisering blev HEY celler sig at have to kopier af

IGF2

,

ABCB1

og

ALB

gener (data ikke vist). Kopital variation blev bestemt ud fra qPCR af genomisk DNA ved anvendelse af fremgangsmåden og indstilling HEY til 2 kopier [18].

Proliferation Kinetics og cytotoksicitetsassays

for proliferation kinetik, celler blev podet i 6- brønds plader. Hver 24 timer blev dobbelte brønde talt ved anvendelse af et Scepter Counter (Millipore). For cytotoksicitet assays blev celler podet i en 96 brønds plade. Efter 24 timer blev cellerne behandlet med serielle fortyndinger af den angivne lægemiddel, med en fast koncentration på 1 uM NVP-AEW541 eller 10 ug /ml IMC-A12 hvis indiceret. Efter 72 timers behandling blev det relative celleantal i hver brønd bestemt ved anvendelse af sulforhodamin B-assay [7]. IC

50 er den lægemiddelkoncentration svarende til et fald på 50% i celleantal beregnet under anvendelse af dosis-effekt-kurven.

ELISA for receptorfosforylering

Celler blev dyrket i komplette medier for 24 timer, derpå sultes for serum i 12 timer før stimulering i 10 minutter med rekombinant IGF2 (50 ng /ml; Abcam) eller insulin (50 nM; Sigma), med eller uden forbehandling af celler med NVP-AEW541 (1 uM) eller IMC-A12 (10 ug /ml) i 2 timer. Cellerne blev lyseret ved anvendelse af NP40-baserede lysepuffer med PhosSTOP (Roche) og protease-inhibitor cocktail (Sigma). Efter proteinkvantificering, den DuoSet IC Humant Phospho-IGF-1 R og Phospho-Insulin R (R validering af disse fund blev gjort for dette håndskrift ved hjælp af to nye unikke oligonucleotidsekvenser vilkårligt navngivne siIGF2-1 og siIGF2-2. For A2780-T15-celler blev to oligonukleotidsekvenser anvendes, svarende til den første siRNA anvendes i HEY-T30 (vilkårligt navngivet siIGF2-3) samt den nye oligonucleotid siIGF2-1. For stabil knockdown hjælp af BLOCK-iT Inducerbar H1 Lentiviral RNAi System (Life Technologies), blev vektorer designet til at udtrykke en shRNA målrettet IGF2, eller en ikke-targeting kontrol (shScrambled). HEY-T30-celler blev transficeret med direkte plasmidet eller med lentivirale partikler, udvælges derefter med Zeocin (Life Technologies). Kloner af plasmid-transficerede celler og lentivirale-transficerede celler blev screenet for IGF2 knockdown. Klonen med den laveste IGF2 mRNA-ekspression fra hver gruppe blev anvendt til efterfølgende eksperimenter.

Cell Cycle og Apoptose Analyse

Celler blev behandlet som beskrevet i figurteksterne. Efter 16 timer blev adhærente og flydende celler opsamlet. For cellecyklusanalyse blev celler fikseret med 70% kold ethanol i 1 time og derefter inkuberet med 20 pg /ml propidiumiodid (Sigma) og 100 pg /ml RNase (Fisher Thermo Scientific) i PBS. For apoptose analyse blev Violet Ratiometrisk Membrane Asymmetry Probe /Dead Cell Apoptose Kit (Life Technologies) anvendt ifølge producentens protokol. En violet overgearet farvestof 4′-N, N-diethylamino-6- (N, N, N-dodecyl-methylamino-sulfopropyl) blev anvendt til påvisning af membran asymmetri forandringer, der sker i den tidlige methyl-3-hydroxyflavone (F2N12S) apoptose, hvilket resulterer i en nedsat forhold på 585 nm til 530 nm emission. Samtidig blev SYTOX (R) AADvanced anvendes som døde celler pletten. Brug ufarvede celler og kontrol ubehandlede celler blev gating af kvadranter bestemmes; leve, apoptotisk, og døde celler blev kvantificeret ved hjælp FlowJo (Treestar).

Drug efflux Analyse

To hundrede tusinde HEY og HEY-T30 celler resuspenderes i 1 ml varm PBS + 5% FBS . Alle inkubationstrin blev udført ved 37 ° C i cellekultur inkubator. Verapamil (15 uM) eller NVP-AEW541 (1 uM) blev tilsat, og prøverne inkuberes i 1 time. Derefter 50 uM tubulin Tracker Green reagens (Oregon Green 488 Taxol, bis-acetat) (Life Technologies) blev tilsat, og prøverne inkuberes i 45 minutter. Cellerne blev pelleteret derefter resuspenderet i PBS + 5% FBS, med verapamil eller NVP-AEW541 hvis indiceret, og inkuberet i yderligere 20 minutter, vasket i PBS og farvet med TO-PRO-3 (Life Technologies). Celler blev straks analyseret ved anvendelse af et FACSCanto II (BD) og FlowJo; TO-PRO-3 positive celler (døde celler) blev gated ud, og de resterende celler blev afbildet at bestemme mærket Taxol fastholdelse [19].

Statistisk analyse

For hver analyse, data var fra mindst to uafhængige forsøg. Antallet af gentagelser per forsøg er beskrevet i figurteksterne. Forskelle mellem hjælp af to grupper blev analyseret ved anvendelse af t-test. For forskelle mellem tre eller flere grupper, en-vejs ANOVA med Bonferroni post-test blev anvendt. Til analyse af to uafhængige variable, blev to-vejs ANOVA med en Bonferroni post-test anvendes. For overlevelse analyse blev logrank test, der anvendes. Alle P-værdier er tosidede og P 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Supplemental Metoder Salg

Fil S2 indeholder de materialer og metoder anvendt til generering af p-tubulin mutationsdata (vist i fig. . S1 af File S1) og IGF2 Western Blot data (vist i fig. S2E af File S1).

Resultater Salg

Vores forudgående undersøgelse af IGF2-proteinekspression under anvendelse af en væv microarray af epitelial ovariecancer tumorer viste, at høje væv ekspressionsniveauer af IGF2 blev associeret med en forkortet interval til progression /fornyet [7]. Siden da blev genekspression data fra 489 klinisk kommenteret stadie II-IV high-grade serøse ovariecancer prøver af The Cancer Genome Atlas-projektet (TCGA) stillet til rådighed gennem cBioPortal for Cancer Genomics [17]. Brug af disse data portal, testede vi et forhold af IGF2-ekspression og iboende resistens, hvor høj IGF2 blev defineret som 1,6 SD over middelværdien, svarende til 94-95th percentil i en normalfordeling. Ved at bruge denne nedskæring score, størrelsen af ​​IGF2-høje gruppe tilnærmer den del af ovariecancerpatienter forventes at have intrinsisk tumorer narkotika, manifesteret ved progression under eller kort efter afslutning af kemoterapi. I vores analyse af TCGA data, vi faktisk konstateret, at høje IGF2 mRNA-ekspression i tumorvæv signifikant korreleret med en forkortet interval til progression /fornyet, dvs. progressionsfri overlevelse (fig. 1A). Median progressionsfri overlevelse i denne gruppe var 12 måneder, indikerer iboende modstand stof. Høj IGF2 mRNA-ekspression også korreleret med betydeligt forkortet samlet overlevelse (fig. 1B). Multivariat analyse blev ikke aktiveret som disse data portal, men i vores forudgående offentliggørelse vi bemærkede en sammenslutning af IGF2 udtryk med højere trin og kvalitet [7].

IGF2 udtryk og kræft i æggestokkene overlevelse. Brug af cBioPortal for Cancer Genomics at analysere data fra Cancer Genome Atlas undersøgelse af æggestokkene serøs cystadenocarcinoma, vi sammenlignede progressionsfri overlevelse og samlet overlevelse hos patienter med høj tumor niveauer af IGF2 mRNA (større end 1,6 standardafvigelser over gennemsnittet; grå linie) og dem med normale tumor niveauer af IGF2 mRNA (alle andre patienter, sort linie). Patienter med høje IGF2 mRNA niveauer var signifikant forkortet progressionsfri overlevelse (A) og samlet overlevelse (B). (C) IGF2-ekspression i følsomme og resistente cellelinier. Ved RT-qPCR, målte vi IGF2 mRNA niveau i seks lægemiddelresistente æggestokkene karcinom cellelinjer og deres tre cellelinier af oprindelse. Alle narkotika resistente cellelinier har signifikant højere IGF2 mRNA-ekspression i forhold til deres følsomme cellelinje oprindelsesland. Barer viser middelværdien ± SEM af IGF2 mRNA-ekspression score for mindst to uafhængige forsøg for hver cellelinie, hver udført i tre eksemplarer, og symbolet over baren viser den statistiske signifikans sammenligne at resistente cellelinje med sin forældrenes modstykke; * P 0,05, *** p 0,001, **** p 0,0001 af One-way ANOVA med Bonferroni posttest. (D) ABCB1 ekspression. ABCB1 mRNA ekspression blev målt ved RT-qPCR i HEY, HEY-T30, A2780 og A2780-T15. HEY-T30 har højere ABCB1 mRNA-ekspression sammenlignet med de andre cellelinier. Søjlerne viser middelværdien ± SEM af ABCB1 mRNA-ekspression score for mindst fire uafhængige forsøg for hver cellelinie, hver udført in triplo, (E) ABCB1 DNA kopital. Af qPCR udføres på genomisk DNA, HEY-T30 har en seks-dobling i ABCB1 DNA-kopi nummer angiver genamplifikation. Søjlerne viser middelværdien ± SEM af to uafhængige forsøg, hver udført in triplo.

Vi har tidligere vist, at IGF2 mRNA niveauer øges i løbet akut Taxol behandling, og vi den hypotese, at opregulering af IGF2 er forbundet med vedvarende overlevende celler giver anledning til lægemiddelresistente tilbagevendende sygdom. For at undersøge resistens i laboratoriet, Taxol, såvel som ikke-taxan mikrotubulusstabiliserende midler (MSAS), ixabepilon, discodermolid, og epothilon B, blev brugt til at udvikle seks distinkte resistente cellelinier. Som bestemt ved real-time PCR, havde alle MSA-resistente cellelinje modeller forhøjet IGF2 mRNA-ekspression i forhold til deres følsomme parental linie (fig. 1C). Eftersom Taxol er langt den mest klinisk anvendte blandt disse lægemidler, efterfølgende eksperimenter fokuserede på Taxol resistente cellelinier HEY-T30 og A2780-T15.

Vi vurderede det drug-resistente cellelinier for andre mekanismer Taxol resistens [ ,,,0],20], [21]. HEY-T30 har ABCB1 mRNA overekspression (fig. 1D) i forbindelse med genomisk opformering af

ABCB1

(fig. 1E), mens HEY har ingen kopi nummer ændring af

ABCB1

. Disse resultater blev bekræftet af arrayet komparativ genomisk hybridisering (data ikke vist). A2780-T15 blev udvalgt i nærvær af verapamil og ikke overudtrykker ABCB1 (fig. 1D), og hverken A2780-T15 eller A2780 har DNA kopital ændring af

ABCB1

(fig. 1E). Vi fandt ingen signifikant korrelation mellem IGF2 og ABCB1 udtryk i vores panel af cellelinier (fig. S3 af File S1). DNA-sekventering afslørede, at A2780-T15 har en mutation (Glycine i position 360 er ændret til en asparaginsyre) i Taxol-bindende lomme af β-tubulin (fig. S1A og S1B af File S1), mens HEY-T30 har ikke en mutation i β-tubulin.

HEY-T30 prolifererede ligeledes i Taxol-frie medier eller medier indeholdende lave koncentrationer af Taxol (≤30 nM) (fig. 2A). A2780-T15 prolifererede meget langsommere i Taxol-frie medier end i medier indeholdende Taxol (≤15 nM) (fig. 2B), hvilket tyder på mulig Taxol afhængige-vækst er forbundet med dens β-tubulin mutation. Når lavdosis Taxol var til stede, A2780-T15 tilvækst på et tilsvarende sats som A2780. De resistente cellelinier viste krydsresistens over for ixabepilon, en MSA som deler en fælles β-tubulin bindingssted med Taxol. Udvidet profilering af HEY-T30 (Fig. 2C, venstre panel) viste modstand mod mikrotubulus-destabiliserende lægemiddel vinblastin og modstandsdygtighed over for doxorubicin, men lignende følsomhed over for cisplatin, sammenlignet med parental HEY. A2780-T15 (Fig. 2C, højre panel) blev krydsresistente over for både doxorubicin og CDDP, men var mere følsom over for vinblastin. Overfølsomhed over for mikrotubuli-destabiliserende lægemidler er tidligere blevet observeret i en anden lægemiddelresistent cellelinie, der huser en β-tubulin mutation, der var forbundet med afhængighed af mikrotubulusstabiliserende lægemidler til proliferation [22].

Proliferation kinetik cellelinier. Celler blev dyrket i komplette medier med den angivne koncentration af Taxol i 6-brønds skåle, og cellerne fra dobbelte brønde tælles hver 24 timer. (A) HEY-T30-celler i nærvær eller fravær af 30 nM Taxol formere langsommere end HEY-celler (p 0,05, Repeated Measures To-ANOVA, Bonferroni posttest). (B) A2780-T15 i nærvær af 2 nM og 15 nM Taxol vokse på samme måde som A2780. Men i mangel af Taxol, A2780-T15 breder langsommere, hvilket tyder på Taxol afhængighed (p 0,01, Tovejs ANOVA, Bonferroni posttest). Hver vækstkurve repræsenterer gennemsnittet af mindst to uafhængige forsøg hver udført in duplo, er hvert punkt repræsenteret som gennemsnittet ± SEM. (C) IC

50 s af kemoterapeutiske lægemidler i følsomme og resistente cellelinier. I 96-brønds plader blev celler behandlet med serielle fortyndinger af de angivne stoffer og koncentrationen af ​​50% proliferation inhibition (IC

50) bestemt ved anvendelse af SRB cytotoksicitet assay. HEY-T30 er krydsresistente over for ixabepilon og vinblastin. Der er beskeden krydsresistens over for doxorubicin, men ikke til CDDP. A2780-T15 er krydsresistente over for ixabepilon, og beskedent krydsresistente over for doxorubicin og CDDP, men mere følsomme over for vinblastin. Data er præsenteret som gennemsnit ± SEM af mindst tre uafhængige forsøg udført med seks replikater. P-værdier beregnet ved uparret t-test. (D, E) Sammenligning af HEY-T30 og HEY xenograft reaktion på Taxol. Efter subkutan injektion af HEY-T30 eller HEY-celler blev musene inddelt i behandlingsgrupper med 6 dyr i hver. Når den gennemsnitlige xenograft volumen nåede 120 mm

3, Taxol behandling blev administreret i den maksimale tolererede dosis (MTD) på 20 mg /kg intraperitonealt hver tredje dag i fem behandlinger (behandlingsdage: 0, 3, 6, 9, 12 ), hvilket resulterer i en kumulativ dosis på 100 mg /kg. Kontroldyr modtog intraperitoneale injektioner af fortyndingsmidlet (5% dextrose i vand; D5W) ifølge den samme tidsplan. Tumorer blev målt hver tredje dag, og betyde tumorvolumener ± SEM for hver gruppe vist ved hvert tidspunkt. HEY xenotransplantater reagerede på Taxol behandling, som potent undertrykte tumorvækst (figur 2D;. Stiplet blå linje). HEY-T30 xenografter ikke reagerede på Taxol behandling (figur 2E;. Stiplet orange linje) og voksede med samme hastighed som bærerbehandlede HEY-T30 xenografter. HEY Taxol vs HEY D5W på dag 19, s 0,001; uparret t-test.

Et afgørende skridt i at oversætte laboratoriefund til potentielle behandlinger for patienter er at foretage

in vivo

test vha dyremodeller. Da A2780-T15 celler var afhængige af Taxol for deres vækst, men HEY-T30 var ikke, vi evalueret HEY-T30 som en xenograft model for

in vivo

afprøvning af terapeutiske strategier rettet mod resistens. Vi administreret Taxol ved hjælp af tidligere bestemte maksimal tolereret dosis (MTD, kumulativ dosis på 100 mg /kg) [23] for at evaluere resistens

in vivo

. Parental HEY xenograft vækst blev effektivt undertrykt af Taxol, hvilket indikerer følsomhed over for Taxol (fig. 2D). I modsætning hertil Taxol undladt at hæmme HEY-T30 xenograft vækst i forhold til køretøjet (5% dextrose i vand; D5W) behandling, hvilket indikerer resistens (figur 2E.)

For at strategize hvordan at målrette IGF2-medieret lægemiddel. modstand undersøgte vi receptorekspression og aktivering i lægemiddelresistente og følsomme cellelinier. Tidligere publicerede undersøgelser indikerede, at IGF2-bindende inducerer autophosphorylering af IGF1R og insulinreceptoren isoform A, IR-A [24], [25], hvilket resulterer i receptoraktivering og nedstrøms signalering til effektormolekyler såsom AKT. Desuden blev høj IR-A /IGF1R ekspression associeret med resistens mod anti-IGF1R terapier, som signalering via IR-A kan omgå afhængighed IGF1R [26]. Vi bestemt, at IGF1R mRNA-ekspression var højere i HEY og HEY-T30, sammenlignet med A2780 og A2780-T15, uden signifikante forskelle mellem de parrede følsomme og resistente linjer (fig. 3A). Som vist i fig. 3B, IR-A var lavere i HEY og HEY-T30 forhold til A2780 og A2780-T15. Real time PCR-data blev også analyseret med korrektion for forskelle i forstærkning effektivitet mellem primer sæt (Tabel S1 af File S1), med lignende resultater. Ved Western blot, IGF1R og IR-proteinekspression svarede til mRNA-niveauer (data ikke vist). Således HEY og HEY-T30 havde lavere IR-A /IGF1R forhold end A2780 og A2780-T15.

(A) IGF1R mRNA af følsomme og resistente cellelinier. Målt ved RT-qPCR (n = 5 uafhængige forsøg hver udført in triplo), IGF1R mRNA-niveauer er ens, når resistente cellelinier er i forhold til deres parentale cellelinier af oprindelse. Søjlerne viser middelværdien ± SEM. (B) IR-mRNA af følsomme og resistente cellelinier. Målt ved RT-qPCR (n = 5 uafhængige forsøg hver udført i tre eksemplarer) IR-A og IR-B mRNA-niveauer i HEY-T30 er signifikant faldet i forhold til HEY, mens lignende niveauer overholdes, når man sammenligner A2780-T15 til A2780. Søjlerne viser middelværdien ± SEM, **** p 0,0001; uparret t-test. (C) Phospho-IGF1R og phospho-IR ELISA i HEY-T30. Celler blev sultet natten over, inkuberet med 1 uM NVP-AEW541 eller 10 ug /ml IMC-A12 i 2 timer, stimuleret med 50 ng /ml IGF2 eller 50 nM insulin i 10 minutter, lyseret, og niveauer af phosphoryleret IGF1R og IR bestemt ved ELISA. Både IGF2 og insulin forårsagede 5- til 6-fold-change forøgede niveauer af phospho-IGF1R der kunne undertrykkes ved NVP-AEW541 eller IMC-A12. Ændringerne i phospho-IR efter stimulation med IGF2 eller insulin var meget mindre (fold-ændring 1,5). Bars skildrer gennemsnit ± SEM fold-change phosphoryleringsniveauerne af mindst to uafhængige forsøg, der hver udført in duplo. (D) Phospho-AKT og phospho-ERK Western blot. Cellelysater fremstillet som beskrevet i (C) blev anvendt til immunoblotting under anvendelse phosphorylering-specifikke AKT og ERK-antistoffer. IGF2-induceret AKT-phosphorylering på threonin 308 og serin 473 blev undertrykt af NVP-AEW541 og IMC-A12, mens den samlede AKT var uændret. Ingen effekt blev set på phospho-ERK-niveauer. Et repræsentativt eksperiment af to uafhængige forsøg er vist. Lige protein lastning blev bekræftet af Ponceau farvning og GAPDH immunblotting. (E) Phospho-IGF1R og phospho-IR ELISA i A2780-T15. Celler blev fremstillet på lignende måde (C). IGF2 og insulin forårsagede 7-fold og 10-fold forhøjede niveauer af phospho-IGF1R henholdsvis og dette kunne undertrykkes ved NVP-AEW541 eller IMC-A12. Niveauer af phospho-IR efter IGF2 eller insulin stimulation også steget, 4 gange og 9 gange, respektivt. Som vist i fig. ** P 0,01;