PLoS ONE: Validering af Novel Biomarkører for prostatakræft Progression ved kombination af bioinformatik, Klinisk og Functional Studies

Abstrakt

identifikation og validering af biomarkører for kliniske anvendelser stadig et vigtigt spørgsmål for at forbedre diagnostik og terapi i mange sygdomme, herunder prostatacancer. Genekspressionsprofiler rutinemæssigt anvendes til at identificere diagnostiske og prædiktive biomarkører eller nye mål for cancer. Men kun identificeret få prædiktive markører

i silico

er også blevet valideret for kliniske, funktionelle eller mekanistisk relevans i sygdomsprogression. I denne undersøgelse har vi anvendt en bred, bioinformatik tilgang til at identificere sådanne biomarkører på tværs af et spektrum af progression stadier, herunder normale og tumor-tilstødende, præmaligne, primære og sene stadie læsioner. Bioinformatik data mining kombineret med klinisk validering af biomarkører ved følsom, kvantitativ revers-transkription-PCR (QRT-PCR), efterfulgt af funktionel evaluering af kandidatgener i sygdomsspecifikke relevante processer, såsom cancercelleproliferation, motilitet og invasion. Fra 300 indledende kandidater blev otte gener udvalgt til validering af flere lag af data mining og filtrering. Til klinisk validering blev differentiel mRNA-ekspression af udvalgte gener målt ved QRT-PCR i 197 klinisk prostata vævsprøver, herunder normal prostata, sammenlignet med histologisk godartet og cancervæv. Baseret på QRT-PCR-resultater, blev signifikant forskellige mRNA-ekspression bekræftet ved normal prostata versus maligne PCA prøver (for alle otte gener), men også i cancer-tilstødende væv, selv i fravær af detekterbare cancerceller, hvilket således indikerer, at muligheden af udtalt felt effekter i prostata læsioner. Til validering af de funktionelle egenskaber af disse gener, og til at demonstrere deres formodede relevans for sygdomsfremkaldende relevante processer, siRNA knock-down blev udført i både 2D og 3D organotypisk cellekultur modeller. Silencing af tre gener (

DLX1

,

PLA2G7

og

RHOU)

i prostata cancer cellelinjer PC3 og VCAP af siRNA resulterede i markant vækst anholdelse og cytotoksicitet, især i 3D organotypiske celledyrkningsbetingelser. Hertil kommer, lyddæmpning af

PLA2G7

,

RHOU

,

ACSM1

,

LAMB1

CACNA1D

også resulteret i reduceret tumorceller invasion i PC3 organoide kulturer. For

PLA2G7

og

RHOU

, virkningerne af siRNA dæmpende på proliferation og celle-motilitet kan også bekræftes i 2D monolagskulturer. Afslutningsvis DLX1 og RHOU viste den stærkeste potentiale som nyttige kliniske biomarkører for PCa diagnose, yderligere valideret af deres funktionelle roller i PCa progression. Disse kandidater kan være nyttige for mere pålidelig identifikation af tilbagefald eller terapi fiaskoer forud for tilbagefald lokale eller fjernmetastaser

Henvisning:. Alinezhad S, Väänänen RM, Mattsson J, Li Y, Tallgrén T, Tong Ochoa N, et al. (2016) Validering af Novel Biomarkører for prostatakræft Progression ved kombination af bioinformatik, klinisk og funktionelle studier. PLoS ONE 11 (5): e0155901. doi: 10,1371 /journal.pone.0155901

Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: Oktober 14, 2015; Accepteret: 5 maj 2016; Udgivet: May 19, 2016

Copyright: © 2016 Alinezhad et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Marie Curie (FP-7) Prostate Research Organizations-Netværk af første trin Training (PRO-NEST, projektets referencenummer 238.278) og The Academy of Finland (Tumor mikromiljø Metastase i kastrationsresistent prostatakræft, projektnumre 267326 til Matthias Nees og 267326 til Malin Åkerfelt). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er fortsat et stort problem for folkesundheden i alle vestlige lande. PCa repræsenterer den mest almindeligt diagnosticeret tumor enhed efter hudkræft hos mænd, og er den næsthyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i USA. I USA blev der 233.000 nye tilfælde af PCa diagnosticeret, og 29,480 mænd døde af sygdommen i 2014 [1]. En ud af syv mænd kan udvikle invasiv prostatakræft løbet af deres levetid [1]. Målinger af serum prostata-specifikke antigen (PSA) niveauer, efterfulgt af digital rektal undersøgelse (DRE) og histologisk undersøgelse af prostata biopsier, er stadig de mest udbredte rutinemæssige diagnostiske metoder til PCA. I 1986 blev PSA godkendt som biomarkør for overvågning og opfølgning af PCA patienter af den amerikanske Food and Drug Administration [2]. Tidlige undersøgelser har rapporteret et signifikant fald i dødeligheden af ​​PCA patienter [3] efter bred introduktion af PSA test for storstilet befolkning screening. Imidlertid har nyere undersøgelser vist, at PSA-screening kan føre til udbredt over-diagnose og bekostelig over-behandling af patienter med indolent cancere [4]. Som PSA er en vævsspecifik, men ikke cancer-specifik markør for prostata, forhøjede niveauer af PSA under og efter kemoterapi eller radikal prostatektomi indikerer svigt af behandlingen, og tilsyneladende recidiv af sygdommen. Selv om en ubestridelig klinisk opfølgning markør, kun PSA niveauer stige efter PCa remission og når progression allerede har fundet sted. Følgelig PSA har ringe diagnostisk og praktisk taget ingen prædiktiv værdi for sygdomsprogression til lokalt fremskreden cancer ( 10% af patienterne), eller endda metastatisk PSA. For nylig imidlertid et panel af fire kallikreiner, i kombination med PSA-aided risiko lagdeling, blev vist at være nyttige til at identificere mænd i halvtredserne med en stærkt forøget risiko for sygdomsprogression og udvikling af fjerne metastaser. Dette tilvejebringer også et middel til at reducere over-diagnose af indolent sygdom [5]. Mere følsomme, informativ, sygdoms- og kræft-specifikke biomarkører ville være nødvendigt, for at skelne patienter med høj risiko fra dem med indolente kræftformer eller endda præmaligne precursor læsioner. Dette kan også omfatte markører der indikerer cancer-associerede “-feltet virkninger”, som blev først for nylig er beskrevet i prostatakræft [6], men som nu er blevet en tilbagevendende iagttagelse, der sandsynligvis vil blive vigtig til diagnostiske formål. Vævsbaserede markør paneler kan have potentiale til markant at forbedre diagnostik, hvilket resulterer i mere præcision og tidligere påvisning, eller de kan indikere hyppigt observeret multifokal karakter af [7] sygdom. Nye anvendelser af forskellige ‘omik teknologier som genomik, transcriptomics proteomics og metabolomics har fremmet inden for biomarkør opdagelse betydeligt. Markører, der er funktionelt involveret i forskellige stadier af sygdomsprogression eller metastatisk spredning kan have det største potentiale til succes forudsige fejl i stråling og anti-hormon behandlinger, der fører til meget aggressiv og metastatisk, kastrationsresistent prostatacancer (CRPC). Sådanne mekanistisk involverede markører kan ikke blot i væsentlig grad forbedre PCa ledelse i klinisk praksis; de kan også repræsentere nye targets for terapeutisk intervention. I klinisk praksis, kunne anvendelsen af ​​flere prædiktive, vævsbaserede markører meningsfuldt kombineres med andre parametre med høj risiko, såsom positiv extrakapsulær eller sædblæren invasion, avanceret tumor stadier ( T2C, T3 eller T4), høje Gleason kvaliteter ( 8), eller høj til meget høj PSA-niveau ( 20 ng /ml); og vil blive yderligere understøttet af avanceret billedbehandling teknologier såsom MRI.

I de senere år har molekylære teknikker såsom microarray genekspression profilering og næste-generations sekventering (NGS) i høj grad lettet genom-dækkende undersøgelser af tumor genekspression profiler. Derfor microarray og NGS-baserede genekspression profilering har været meget anvendt til at identificere paneler af prognostiske [8] og prædiktive biomarkører, herunder sådanne, som kan være vejledende for PCa recidiv [9,10], tidlige og sene stadier af kræft progression, eller field virkninger. Identifikation af nye, informative biomarkører for lunge- og tarmkræft ved systematisk udvinding af offentlige genekspression datasæt som The Cancer Genome Atlas (TCGA) er blevet rapporteret [11,12] andre steder. Den TCGA databasen indeholder mange store genekspressionsstudier baseret på kliniske PCA biopsier [13,14,15], der stammer fra offentligt finansieret forskning og åbent tilgængelige datasæt. Den cBio Cancer Genomics Portal [16] (https://www.cbioportal.org) er den vigtigste open-access ressource for minedrift de TCGA kræft genomforskning datasæt, og i øjeblikket er vært for mere end 21.000 tumorprøver fra 20 forskellige cancer enheder og 91 studier. Vi har valgt en af ​​de største og mest omfattende af disse microarray udtryk undersøgelser af PCa s, der hovedsageligt udføres på kliniske biopsier, foretaget af Taylor et al. på Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (MSKCC) [13] i 2010. Denne undersøgelse omfatter 181 primære PCA prøver, 37 metastatiske PCA prøver, 12 PCA cellelinjer og xenografter og 29 normale prostata væv som raske kontrolpersoner. Et stort antal patologiske og kliniske parametre såsom Gleason kvaliteter, TNM stadier, positive kirurgiske margener, status for lokal invasion af cancerceller i lymfeknuder, sædblærer eller extracapsular rum eller fjernmetastase er kommenteret. Disse parametre anses mest vigtigt at vurdere PCa aggressivitet, og pålidelige skøn dårligt resultat af sygdommen. Vores specifikke mål for data mining var at udnytte en åben, fordomsfri tilgang, adressering et bredt spektrum af normale væv, primære kræftformer og sene, avancerede læsioner. Da målet var ikke til at forudsige det kliniske resultat eller vurdere den individuelle risiko for patienter eller patientgrupper undergrupper baseret på mRNA udtryk data blev dataene ikke opdelt i uddannelse og test sæt til cross-validering. Vi også ikke sigte til evaluering af en “prædiktiv markør signatur” til at blive brugt på andre, uafhængige mRNA genekspression studier. Cross validering var derfor ikke afgørende for at bekræfte, hvordan statistisk præcis et sæt prædiktive biomarkører vil udføre i yderligere datasæt. I modsætning hertil vores mål var at identificere tidligere urapporteret biomarkører og validere dem på tværs af hele spektret af kliniske biopsier tilgængelig fra PSA. Vores tilgang var baseret på analyse af differentiel mRNA-ekspression for identifikation af biomarkør kandidater, efterfulgt af deres eksperimentelle korrelation med de mest kritiske kliniske parametre i uafhængige prøver samlinger, som ofte var af meget forskellig oprindelse sammenlignet med microarray data. Det primære fokus var på den funktionelle validering af biomarkører i relation til PCa initiering og progression, ideelt kombineret med en vurdering af deres potentielle diagnostiske værdi.

For uafhængig validering af de første resultater, vi minerede yderligere ressourcer, såsom

i silico

transcriptomics (IST) database [17] (https://ist.medisapiens.com). Denne database indeholder mRNA genekspression data fra mere end 20.000 Affymetrix microarrays, der dækker 60 raske væv, 104 ondartet og 64 andre sygdomsområder. For data mining, har vi udnyttet Ingenuity Pathway Analysis (IPA), som giver gen forening og ontologi information, og tillader filtrering af gener baseret på funktionelle aspekter. Sidst, men ikke mindst, vi brugte den Pubmed information litteratur system til at filtrere biomarkører, der gentagne gange er blevet beskrevet før som forbundet med PSA. En batch-mode tekst mining værktøj (https://pmid.us) blev anvendt, som tillod sca1nning gennem hele litteratur for masken overskriften “prostatakræft”, mod samtidig forekomst af hundredvis af kandidatgener opført som “gen-symboler”. Med denne strategi blev et sæt af 300 formodede biomarkør kandidater prioriteret trin for trin ved hjælp af en kombination af forskellige data og tekst mining eller filtrering tilgange, fremhæver markører, der var stærkest korreleret med generelle aspekter af PCa progression, svigt terapi, eller progression til metastatisk CRPC, men ikke tidligere var omfattet af en stor mængde videnskabelige rapporter. Otte gener blev udvalgt til klinisk og funktionel validering. Til dette formål, kvantitativt, internt standardiseret realtid revers-transkription-PCR (RT-PCR) blev anvendt under anvendelse fire uafhængige vævsprøve samlinger fra radikal prostatektomi og cystoprostatectomy. Disse indeholdt normale cystoprostatectomy prøver, histologisk godartet væv fra cystoprostatectomy prøver med tilfældig prostatakræft, i tillæg til histologisk benigne væv og ondartet kræft fra radikal prostatektomi prøver.

Nylige fremskridt i cellebiologi har lettet systematiske funktionelle valideringsundersøgelser ( funktionelle genetik) af biomarkør kandidater, baseret på effektive strategier såsom lille interferens RNA (siRNA eller RNAi), CRISPR /Cas9 og Talen teknologier. Af disse siRNA undersøgelser er fortsat de mest tilgængelige, økonomisk overkommelige og hurtigste teknologier i eksperimentel praksis, og repræsenterer den primære tilgang i funktionel target validering. For at udforske funktionelle effekter af udvalgte gener på vækst, spredning og invasive egenskaber af prostata kræftceller, blev siRNA knock-down undersøgelser for udvalgte gener udført i både 2D og organotypiske 3D-modeller (organotypiske cellekulturer) ved hjælp af dårligt invasive VCap og meget aggressive PC3 cellelinjer.

Materialer og metoder

Analyse af genekspression profilering for at identificere kandidat biomarkører

Et panel af forskellige bioinformatik analyse og filtrering metoder blev anvendt på mine store -skala genekspression profilering datasæt, og til at vælge de mest informative, formodede biomarkører for prognose og /eller overvågning af sygdommens progression (opsummeret i figur 1). Vi brugte BioConductor /R-baserede data normalisering og RMA (Robust Multi-chip Average) pakke til forarbejdning og normalisering af Affymetrix eksperiment sæt udvundet fra TCGA /cBio portal. Dernæst blev gener rangeret efter differential genekspression på tværs af de vigtigste prøve grupper (N, normalt; T, primær partnerskabs- og samarbejdsaftale; og M, metastatisk PCA). Til dette formål, vi brugte flere statistiske test for signifikans (ANOVA, T-test eller Z-score og Mann-Whitney U-test;. Og derefter filtreret kandidater ved flere test korrektioner (Bonferroni) Samtidig brugte vi SAM eller ” betydning analyser for Microarrays “program, der bruger Falsk Discovery Rate (FDR) kriterier for gen-udvælgelse. Denne tilgang resulterede i overlappende, lignende gen sæt (data ikke vist). Vi begrænset vores analyse til den store MSKCC datasæt (218 tumor profiler, herunder 37 metastaser, blev 12 PCA cellelinier, og 29 normale prostatavæv). Differentiel ekspression af hvert gen i banen 181 primære cancer prøver sammenlignet med de 29 normale prøver (

T versus N sammenligning

). Tilsvarende ekspression i 37 metastatiske prøver blev sammenlignet med de 181 primære PCA prøver (

M versus T

). Den gennemsnitlige fold ændring af mRNA-ekspression og statistisk signifikans på tværs af alle prøver blev beregnet, og gener blev klassificeret i henhold til de stærkeste forskelle i mRNA-gen udtryk (fold forandring, se S1 og S2 Files). De øverste 300 hits i hver gruppe (T vs N, og M vs. T) blev derefter underlagt yderligere filtrering data: Kun de gener blev udvalgt til at følge op, der viste de statistisk set signifikante, robuste og reproducerbare forskelle mellem normal, primær PCa og metastatiske PCA prøver (baseret på FDR skøn eller Bonferroni-filter). Vi brugte også den opfindsomhed Pathway Analysis (IPA) softwareværktøj til yderligere filtreringsmuligheder af de originale gen lister, baseret på både statistiske parametre samt funktionel “gen ontologi” og mekanistiske pathway anmærkninger. Vi udnyttede den rangeret liste over kandidater, der genereres af IPA for yderligere korrelation med kliniske parametre (Kaplan-Meier plots), vurdering af vævsspecifik udtryk og litteratur tekst mining (næste afsnit). For kræft-specifikke gener identificeret som udtrykkes forskelligt mellem N og T-grupper, var ranking højere, hvis forskellen mRNA genekspression også blev observeret mellem T og M underkategorier.

For hver valgt gen, box -plot ekspressionssystemer grafer blev genereret ved anvendelse af en in-house html-baserede data visualisering værktøj (R-eksekverbar (REX)). Dette giver en systematisk, brugerdreven data mining af datasæt i henhold til kliniske parametre (fx tumor undergrupper såsom primære vs. metastatiske kræftformer, lymfeknude og extracapsular invasion, infiltration af kirurgiske margener, og fjern metastase). Desuden differentiel ekspression mellem lav (4-6), mellemprodukt (7) og høj (8-10) Gleason scorer, eller mellem forskellige stadier af sygdommen ( T2, T3 eller T4), og sygdomstilstande kategorier såsom primær vs lymfeknude metastaser, blev systematisk vurderet (fig 2A). Dernæst vi prioriteret gener, der var specifikt fortrinsvis eller stærkt udtrykt i prostata i forhold til alle andre menneskelige væv, herunder andre tumor enheder. Til dette formål blev der vævsspecifikke udtryk scores leveres af IST online database bruges (figur 2C). Vævet-specifikke udtryk scores og box-plot udtryk grafer for andre udvalgte gener er opsummeret i S3-fil.

A) Dot plot illustrerer foreningen af ​​mRNA genekspression af CACNA1D i normale og cancer prøver med et panel af de mest informative klinisk-patologiske parametre. B) Kaplan Meier analyser, der viser korrelationen af ​​høje niveauer af mRNA-ekspression for CACNA1D med reduceret samlet overlevelse analyse for PCA patienter. C) Relativ ekspression af CACNA1D tværs et panel af 60 + normale og cancer-relaterede humane typer og sygdomme væv.

Dernæst vi rettet kliniske resultater, men anvendes andre datasæt ud over den MSKCC microarray data. For hver af de udvalgte gen, en Kaplan-Meier patient resultat plot baseret på en uafhængig, storstilet klinisk studie med offentligt tilgængelige oplysninger [15] blev genereret. Til dette formål har vi fokuseret på total overlevelse og sygdomsfrie intervaller, ved hjælp af ikke-parametrisk statistik, der diskriminerer patient overlevelse funktioner fra kliniske levetid data (figur 2B). Siden ca. 85-90% af patienterne selv med lokalt avanceret PCa vise langsigtet overlevelse ( 5 eller 10 år) og for det meste god klinisk resultat, og kun 10-15% af disse patienter videre til CRPC, har vi valgt tilsvarende tal også for Kaplan-Meier-analyser. Følgelig blev 85% af patienterne grupperet i “lav risiko /god klinisk udfald” kategori, sammenlignet med 15% af højrisiko-patienter, videre til avancerede PCa.

Endelig, for at prioritere nye kandidat biomarkører for efterfølgende funktionel og klinisk validering, blev vores liste over biomarkør kandidater filtreret mod hele PubMed litteratur database. Co-forekomst af kandidat gen navne og HUGO symboler med udtrykket “prostatakræft” i PubMed databasen poster blev screenet systematisk, ved hjælp af den Pubmed batch-søgeværktøjet (https://pmid.us). Gener, der blev nævnt mere end fem gange i indekserede videnskabelige publikationer blev automatisk ekskluderet som “tidligere beskrevet i detaljer” (Status for litteratursøgning: September 2012). Disse sidste filtrering trin førte til otte gener for eksperimentel validering. Genekspression plots fra IST database og dot plots fra sættet MSKCC data er sammenfattet i S3-fil. Vi havde til formål at identificere og bekræfte generelle PCA-specifikke biomarkører (diagnostiske markører), herunder biomarkører, der kan indikere tidligt og multifokale sygdom etaper eller “field virkninger”. Desuden ønskede vi at validere potentielle PCA progression markører (prognostiske markører), der kan tyde på udvikling af tilbagefald, CRPC og metastatiske læsioner efter svigt terapi.

Vævsprøver til klinisk biomarkør validering

etiske komité for Hospital District of Southwest Finland godkendte forsøgsprotokollen. Det var i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen af ​​1975, som revideret i 1996, med skriftligt informeret samtykke fra hver deltager. To uafhængige sæt af prostata-relateret vævsprøver blev anvendt til klinisk validering. Det første sæt bestod af 180 prostata vævsprøver opnået fra i alt 90 primære PCA patienter, der drives af radikal prostatektomi (RP) i Turku University Hospital (TYKS). Fra 90 patienter, havde kun 2 patienter fik HRH-analoger før operationen som præoperativ behandling. Fra hver prostata blev to vævsprøver taget. Den ene stammer fra den mistænkte kræft område, den anden fra det tilstødende område, der mistænkes for at være godartede. Den histo-patologi af halvdelen af ​​hver vævsprøve blev undersøgt ved TYKS patologer, mens den anden halvdel straks blev opbevaret i guanidinisothiocyanat (GITC) buffer til RNA-ekstraktion. Undersøgelsen viste, at i 30 af patienterne blev begge prøver taget fra godartede område; i 15 patienter, blev begge prøver taget fra den cancerøse område; og for 45 patienter, blev en prøve taget fra godartede og den anden fra den kræft område (som oprindeligt beregnet). Kun to prøver skulle udelukkes på grund af tekniske problemer med RNA ekstraktion. Endelig blev 178 prøver (104 godartede prøver og 74 kræft prøver) tilbage til genekspression analyse ved QRT-PCR. De kliniske og patologiske træk ved alle 90 PCA tilfælde er vist i tabel 1.

Den anden kohorte omfattede 19 prostata vævsprøver, opnået fra patienter med blærekræft uden kliniske symptomer på PSA. Disse blev drevet af cystoprostatectomy (KP) ved Skånes Universitetssygehus i Malmø, Sverige. Erfarne patologer, der bruger den samme protokol som tidligere beskrevet for RP prøver undersøgt alle prostata prøver. 12 af de 19 prostata prøver i denne samling havde tilfældig PCa (IPCA), mens syv var fri for påviselig karcinom foci. I tilfælde af IPCA blev vævsprøver til måling af geners taget fra godartede område.

Ekstraktion og revers transkription af RNA

Ekstraktion af RNA fra vævsprøver er blevet beskrevet tidligere [18] . Kort fortalt blev RNeasy Mini Kit (Qiagen, Tyskland) anvendt ifølge producentens anvisninger. Under RNA-ekstraktion, og efter den indledende cellelysis trin, en kendt mængde RNA af en kunstigt muteret

KLK3

gen, betegnet mmPSA, blev tilsat til prøven som en intern kontrol og for absolut kvantificering af ekspressionsniveauer. Kvaliteten af ​​mRNA opnået blev verificeret ved agarosegelelektroforese, og den endelige RNA-koncentrationen blev målt ved en NanoDrop N2000 spektrofotometer (NanoDrop Technology, LTD Lab). Revers transkriberet cDNA blev dannet ved anvendelse af høj kapacitet cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, USA), ifølge producentens instruktioner.

Kvantitativ real-time RT-PCR

Vores tidligere beskrevne protokol [19] til hydrolyse-forstærket luminescerende chelat kemi, baseret på tidsopløst fluorometri, blev også brugt her til kvantitativ real-time RT-PCR. For hvert gen, et par specifikke primere, og matching reporter og quencher prober blev udformet og købt hos Thermo Fisher (Tyskland) (S1 tabel). At mærke reporter prober effektivt med en nonadentate europiumchelat, blev en tidligere beskrevet procedure [20] anvendes. Real-time PCR blev udført i et totalt volumen på 25 pi indeholdende 2,5 pi af template cDNA med Hotmaster

™ Taq DNA-polymerase (5 Prime, Tyskland) eller AmpliTaq

® Gold DNA-polymerase (Applied Biosystems, USA) . Prøver blev kørt tredobbelt. For at korrigere for potentiel RNA-nedbrydning, og mængden af ​​RNA tabt under ekstraktion og revers transkription, til den opnåede udskrift niveau data brug normaliseres. Husholdning gener (fx

GAPDH

) forudsættes transskriberet på et konstant niveau i forskellige væv, og under alle forhold, og er almindeligt brugt til normalisering af RT-PCR-resultater i relative kvantificeringsmetoder [21]. Imidlertid har pålideligheden af ​​housekeeping-gener til normalisering ofte sat spørgsmålstegn på grund af deres ustabilitet under opbevaring og inkonsekvent ekspressionssystemer ændringer i forskellige sygdomstilstande [22,23]. Tilsætning af et fast beløb på en kunstig RNA, som ikke udtrykkes i prøverne i sagens natur som intern reference RNA til prøver (før ekstraktion) betragtes som mere pålideligt alternativ til normalisering [24,25]. I denne undersøgelse har vi taget fordelene ved at bruge kunstige RNA (mmPSA) for normalisering og fordelene ved at bruge prober mærket med lanthanidchelater stedet for Taqman sonder, der gør det muligt tidsopløst fluorometri for QRT-PCR-analyser.

Statistiske analyser

i QRT-PCR-analyser, prøverne blev betragtet som positive, hvis alle tre replikater lå over den laveste assay detektionsgrænsen (LDL). Den absolutte, numerisk værdi af genekspression for ethvert gen af ​​interesse blev beregnet ved hjælp af interne standardværdier, normaliseret for mængden af ​​total RNA, der anvendes i disse assays. For at teste forskellene i transkriptniveauer af kandidatgener mellem sag og kontrolprøver samt mellem forskellige sample kategorier, den ikke-parametriske Mann-Whitney

U

test blev anvendt. For at evaluere effektiviteten af ​​hver enkelt kandidat-gen i et diagnostisk indstilling, blev en modtager-operating characteristic (ROC) kurve analyse udført og arealet under kurven (AUC) anvendes til at vurdere følsomheden og specificiteten af ​​assays. At identificere sammenslutning af mRNA transkript niveauer af et bestemt kandidat-gen med tumorudvikling (målt som PSA tilbagefald i klinikkerne) blev RP prøver delt i to grupper, hvilket afspejler PSA tilbagefald og nr tilbagefald, henholdsvis; i henhold til kliniske opfølgende data. Enhver forbindelse mellem kandidat genekspression niveauer og kliniske eller patologiske parametre såsom Gleason kvalitet, Gleason score, procentdelen af ​​kræft versus stromale celler i væv biopsier, og klinisk T kategori (T-stadie) blev behandlet af den ikke-parametriske Mann-Whitney

U

test, for at identificere statistisk signifikante forskelle (p 0,05). Statistiske analyser blev udført med SPSS-software version 22 (IBM, USA).

Funktionel gen knock-down studier med siRNA’er

PC-3 androgen-uafhængige humane prostata kræftceller fra knogle- metastaseret prostataadenocarcinom blev indkøbt fra ATCC (USA) [18] og dyrket i RPMI-1640 medium ved 37 ° C i standard cellekultur betingelser (95% fugtighed og 5% CO2). For siRNA knock-down undersøgelser blev i alt 31 forskellige siRNAs bestilt fra Qiagen (Tyskland) (tre forskellige siRNAs for

ACSM1

og fire forskellige siRNAs for hver af de andre syv gener). Vi brugte flere PCA cellelinjer, herunder PC-3, VCAP og LNCaP celler, for disse funktionelle validering eksperimenter. For at opnå den mest effektive og knock-down for hvert gen blev adskillige siRNAs testet både individuelt og i poolede blandinger indeholder alle tre eller fire siRNAs ved ens koncentrationer. Allstars Hs celledød kontrol siRNA (Qiagen, Tyskland) blev anvendt som en positiv kontrol til at estimere effektiviteten af ​​transfektion i hvert forsøg. De siRNA’er blev præ-fyldt i brøndene, Hiperfect transfektion agent (Qiagen, Tyskland) i Opti-MEM-medium (Invitrogen, USA) blev tilsat og inkuberet i 15 minutter ved stuetemperatur. Endelig 2000 til 5000 PC-3, LNCaP eller VCap-celler blev tilsat til hver brønd. De endelige koncentrationer af siRNA og Hiperfect i hver reaktion var 4 nM og 8 nM. At vurdere effektiviteten af ​​RNA-interferens for hvert gen med de forskellige siRNA’er blev totalt RNA ekstraheret fra transficerede celler fem dage efter siRNA transfektion og specifik mRNA ekspression af målgener blev målt ved QRT-PCR. At udvælge de siRNA-molekyler, der resulterer i den mest effektive knock-down, blev normaliseret ekspressions-værdier for hver behandlet prøve divideret med ekspressionsniveauet af kandidat-gen i ubehandlede kontrolceller ( “scrambled kontrol”). For at udelukke eventuelle virkninger af denne procedure på target genekspression blev mocktransfekterede celler (kun bruger transfektion agent) indgår som en anden kontrol.

Fluorescerende assays til måling af apoptose og væksthæmning af VCAP organoids efter siRNA transfektion

VCAP celler undladt at vokse i 3D betingelser, hvis direkte indlejret i Matrigel eller kollagen kulturer. Derfor blev VCap-celler transficeret med siRNA’er som beskrevet for PC3. Derefter blev transficerede VCAP celler dyrket i rundbundede plader. Cellerne fik lov til at aggregere og formen sfæroider i syv dage efter transfektion. Et lille antal sfæroider (1-6) blev overført til 3D kultur brønde. Sådanne VCAP organoids viste nogle fænotypiske effekter, men de viste ændret organoide vækst og forskellige niveauer af apoptotiske, døde eller døende celler i 3D kultur som reaktion på siRNA’er, blev således betragtet informativ. Cellelevedygtighed blev bestemt med CellTiter-Glo assay ifølge producentens anvisninger (Promega, USA). Kort fortalt blev CellTiter-Glo puffer og lyofiliseret substrat kombineret, 100 pi nævnte opløsning sættes til hver prøve brønd, og pladen omrystes i 30 minutter. Luminescensen som resulterer fra cellelyse og som er proportionalt med mængden af ​​adenosintriphosphat (ATP), blev målt med en EnVision multilabel pladelæser (Wallac, Finland). Endvidere NucView caspase 3/7 assay er blevet anvendt, som detekterer celler aktivt undergår programmeret celledød (beskrevet detaljeret i [26,27,28].

2D cellemigration og invasion assay

Den invasive eller vandrende potentiale PCA celler blev undersøgt med en “scratch sår” eller sår-helende assay, udført i 96-brønds ImageLock plader (Essen Bioscience, USA). Både VCAP og LNCaP celler manglede invasive eller bevægelige egenskaber i 2D eller 3D betingelser. Disse cellelinjer viste ikke sår lukning egenskaber, og var ikke nyttige i bunden sår analyser. Derfor brugte vi PC3 celler, som også har givet udtryk for syv af de otte kandidatgener på væsentlige niveauer, var ligetil at transficere ved