PLoS ONE: Den SIRT1 deacetylase blænder Intestinal tumorigenese og tyktarmskræft Vækst

​​

Abstrakt

Talrige levetiden gener er blevet opdaget i modelorganismer og ændre deres funktion resulterer i forlænget levetid. I pattedyr har nogle spekuleret på, at nogen sundhedsmæssige fordele fra at manipulere disse samme veje kan blive opvejet af øget kræftrisiko på grund af deres tilbøjelighed til at sætte skub i celle overlevelse. Den SIR2 /SIRT1 familie af NAD

+ – afhængige deacetylaser foreslås at ligge til grund for de sundhedsmæssige fordele af kalorieindhold begrænsning (CR), en kost, der i store træk undertrykker cancer i pattedyr. Her viser vi, at CR inducerer en fordobling SIRT1 ekspression i tarmen hos gnavere, og at ektopisk induktion af SIRT1 i en β-catenin-drevet musemodel for tyktarmskræft reducerer tumordannelse, proliferation og dyr sygelighed i fravær af signifikant CR. Vi viser, at SIRT1 deacetylerer β-catenin og undertrykker dens evne til at aktivere transkription og drev celleproliferation. Desuden SIRT1 fremmer cytoplasmatisk lokalisering af den ellers nuklear-lokaliserede oncogene form af β-catenin. I overensstemmelse hermed blev en signifikant omvendt korrelation fundet mellem tilstedeværelsen af ​​nuklear SIRT1 og den onkogene form af β-catenin i 81 humane colon tumorprøver analyseret. Tilsammen disse observationer viser, at SIRT1 undertrykker tarm tumordannelse

in vivo

og hæve udsigten til, at behandlinger rettet mod SIRT1 kan være af klinisk brug i β-catenin-drevne maligniteter

Henvisning:. Firestein R, Blander G, Michan S, Oberdoerffer P, Ogino S, Campbell, J., et al. (2008) Den SIRT1 deacetylase blænder Intestinal tumorigenese og tyktarmskræft vækst. PLoS ONE 3 (4): e2020. doi: 10,1371 /journal.pone.0002020

Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Ordway Research Institute, USA

Modtaget: Marts 5, 2008; Accepteret: 11. marts 2008; Udgivet 16. april, 2008

Copyright: © 2008 Firestein et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. RF var støttet af NIH T32 Grant. GB af en Estee Lauder postdoc stipendium. PO af en National Space Biomedical Research Institute Grant. DAS, SO, CSF og LG af tilskud fra NIH; RD delvist af den Intramural Research Program for NIH /NIA. DS understøttes også af en gave fra Paul F. Glenn Foundation

Konkurrerende interesser:. Leonard Guarente og David Sinclair er konsulenter til Sirtris Pharmaceuticals. William Hahn er en konsulent til Novartis Pharmaceuticals.

Introduktion

Kræft er den næststørste årsag til aldersrelateret dødelighed hos mennesker. Kalorie begrænsning udvider levetid i alle testede organismer og i pattedyr udøver stærke tumor undertrykkende virkninger [1]. I lavere eukaryoter,

SIR2

gen foreslås at mægle de sundhedsmæssige fordele ved CR [2], [3]. SIRT1, pattedyr ortolog af

SIR2

, induceres af CR i multiple væv af pattedyr, og har vist sig at mildne degenerative sygdomme forbundet med ældning, såsom neurodegeneration og metabolisk tilbagegang [4]. Mens CR er kendt for at inhibere både spontan og induceret tumordannelse, er fortsat en rolle for SIRT1 i denne proces, der skal påvises [5]. Der er modstridende data

in vitro

, om SIRT1 vil blive fundet til at fungere som et onkogen eller som en tumor suppressor men til dato har der ikke været nogen

in vivo

undersøgelser vedrørende dette spørgsmål. På den ene side er SIRT1 opreguleret i tumorer og cancerceller mangler tumorsuppressorgenet, HIC1 [6], kan inhibere apoptose [7], [8], [9], [10] og nedregulerer ekspressionen af ​​tumor suppressor gener [11], hvilket mange til at konkludere, at SIRT1 vil vise sig at være et onkogen

in vivo

. På den anden side kan SIRT1 være pro-apoptotiske [12] og antiproliferativ [13], [14], og derfor er blevet foreslået til at opføre sig som en tumorsuppressor

in vivo

. Endvidere har nogle argumenteret for, at pattedyr levetiden gener, som forsinker aldersrelaterede atrofiske sygdomme omvendt kan prædisponere mennesker til en højere forekomst af kræft på grund af deres anti-apoptotiske funktion [15]. Denne undersøgelse omhandler dette kontroversielle spørgsmål ved at teste virkningen af ​​SIRT1 på tumordannelse og vækst.

Vi valgte at teste virkningen af ​​SIRT1 i APC

min /+ model for tyktarmskræft for en række forskellige årsager : det fysiologisk rekapitulerer de tidlige begivenheder af tyktarmskræft hos mennesker, mekanismen for tumorigenese er velkarakteriseret, og CR har tidligere vist sig at reducere hastigheden af ​​tumorigenese i denne model [16]. APC

min /+ mus indeholder en kimlinie mutation i adenomatøs polypose coli (APC) tumorsuppressorgen [17]. Somatisk tab af den anden allel fører til konstitutiv kernelokalisering af β-catenin og adenom dannelse [18], [19].

β-catenin er den centrale effektor i den kanoniske Wnt signalvejen der styrer stamcelle vedligeholdelse , udvikling og carcinogenese [20]. Konstitutiv aktivering af β-catenin pathway er blevet fundet i 90% af colorektale cancere [21], [22]. Desuden er denne vej aberrerende aktiveret i mange andre cancerformer, herunder prostata, bryst, ovarie og melanomer. Interessant nok har to nylige undersøgelser vist, at øget Wnt signalering er forbundet med accelereret ældning, hvilket tyder på, at en dæmpning på Wnt signalering kan ligge til grund CR og være til gavn ikke kun til behandling af kræft, men for mere bredt formildende sygdomme aldring [23], [24] .

Vi rapporterer her, at SIRT1 undertrykker tarm tumorigenese i APC

min /+ mus model og hæmmer tyktarmskræft vækst. Vi leverer betydelige beviser for, at anti-tumorigene effekter af SIRT1 afhænge af dens deacetylase aktivitet og medieres gennem hæmning af β-catenin. Disse fund identificerer en tumor undertrykkende funktion for SIRT1, give mekanistisk indsigt, og foreslå en terapeutisk rolle for SIRT1 deacetylase aktivatorer i tyktarmskræft.

Resultater Salg

Tidligere undersøgelser har vist en dramatisk tumor undertrykkende virkning af CR men den molekylære mekanisme (e) er i øjeblikket ukendt. Vi observerede, at rotter på et CR diæt har ca. 2 gange højere niveauer af SIRT1 i tarmepitelet forhold til

ad lib

-fed kontroller (fig. 1A). For at teste virkningen af ​​stigende SIRT1 ekspression i intestinale epitelceller, genereret vi en floxet SIRT1 transgen mus (fig. 1B). SIRT1 transgene mus blev krydset til APC

min /+ mus efterfulgt af avl til villin-Cre stammen [25]. Genereret Således vi tredobbelt transgene mus (SIRT1

ΔSTOP; Vil-Cre, APC

min /+), der overudtrykker SIRT1 specifikt i tarmen villi (benævnt SIRT1

ΔSTOP). De SIRT1 niveauer i tarmen af ​​SIRT1

ΔSTOP mus ca. 7 gange (fig. 1 E) og morfologi af villi optrådte ellers normal (fig. 1 F).

(A) Western blot-analyse viser ekspressionsniveauerne i tarmen epitel SIRT1 i ad libitum-fodret (AL) eller kalorieindhold begrænset (CR) rotter. β-actin tjente som lastning kontrol i alle baner. (B) Skematisk fremstilling af den strategi, der anvendes til generering af floxed SIRT1 muse embryonale stamceller (MES) celler. SIRT1 blev klonet nedstrøms for en konstitutiv CAGGS promotor efterfulgt af en transkriptionel loxP-STOP-loxP-kassetten. Denne konstruktion blev specifikt rettet i 3’UTR af collagen A1 locus (ColA1) af muse embryonale stamceller (MES) celler ved FLP rekombination. De målrettede MES celler blev injiceret i blastocyster. Røde pile angiver placeringen af ​​SIRT1-Tg genotypebestemmelsesprimere. (C) Southern blot viser bekræftelsen af ​​SIRT1

STOP enkelt integration i Col1A locus af MES celler. (D) PCR bekræfter kønscelleoverførsel af SIRT1

STOP transgen til kimærer ‘afkom. (E) Western blot viser niveauerne af SIRT1 i de tredobbelte transgene mus overekspression SIRT1 (SIRT1

ΔSTOP) og kontroller (SIRT1

STOP). β-actin tjente som lastning kontrol i alle baner. (F) Mucin pletten og immunhistokemi af SIRT1 i tyndtarmen af ​​eksperimentel (SIRT1

ΔSTOP) og kontroller (SIRT1

STOP) dyr.

APC

min /+, SIRT1

STOP kontrol mus, der ikke overudtrykker SIRT1 (benævnt SIRT1

STOP) viste de typiske tegn på tumor sygelighed på 16 uger, som det fremgår af åbenlys anæmi og kakeksi, mens APC

min /+ mus overudtrykker SIRT1 (SIRT1

ΔSTOP) vises ingen åbenlyse tegn på tumorassocieret morbiditet (fig. S1a, B). Undersøgelse af tarmen foring ved fire måneders alderen viste, at SIRT1

ΔSTOP transgene mus havde signifikant mindre og færre tumorer langs tarmkanalen (Fig. 2A). Kvantificering af tumorbyrde afslørede en 3 til 4 gange reduktion i antallet og størrelsen af ​​adenomer i tyndtarmen og colon af SIRT1

ΔSTOP mus (fig. 2B). Ki-67 er en granulær bestanddel af nucleolus, der udelukkende udtrykkes i prolifererende celler og anvendes som en prognostisk markør i humane neoplasier. Adenomer af SIRT1

ΔSTOP mus havde en betydelig reduktion i antallet af mitose (per high-power field) og Ki-67 farvning, hvilket viser, at der var et fald i adenom proliferation (Fig. 2C). Disse data viser, at overekspression af SIRT1 i tarmen på samme niveau som dem, der induceres af CR er tilstrækkelig til at efterligne tumor undertrykkende virkning af CR i APC

min /+ mus.

(A) billeder af hele duodenal og ileum afsnit viser brutto intestinale tumorer i mus overekspression SIRT1 (SIRT1

ΔSTOP) og kontroller (SIRT1

STOP). Solide linje angiver gastro-duodenale junction. Pile viser adenomer. Hvide søjle betegner 1 mm skala. (B) Gennemsnitligt antal tumorer efter tarm placering i SIRT1

STOP kontrol (n = 8) og SIRT1

ΔSTOP eksperimentelle mus (n = 11). (C) Ki-67-farvning af adenomer og opformeringsrater. Billeder viser Ki-67 immunhistokemisk farvning af adenomer fra SIRT1

STOP og SIRT1

ΔSTOP. Proliferationsindeks er udtrykt som procent af Ki-67 farvede adenom-celler (gennemsnit i mindst 10 adenomer pr kohorte). Mitotisk beregnes som antallet af histologisk identificerbare mitotiske tal pr 10 high-power felter (400 ×). Værdier i B og C er middel ± standardafvigelse.

For at få indsigt i de mekanismer, hvormed SIRT1 reducerer celleproliferation undersøgte vi effekten af ​​SIRT1 på vækstraten for flere godt karakteriserede kræft cellelinjer. Spredningen af ​​LNCaP-prostatacancerceller blev stærkt reduceret med overekspression af SIRT1 og virkningen var ligner undertrykke β-catenin selv (fig. 3A). Denne iagttagelse antydede, at SIRT1 og β-catenin fungerer på samme cellulære kontekst. For yderligere at undersøge denne mulighed, vi overudtrykt SIRT1 og en katalytisk inaktiv SIRT1 mutant (SIRT1

ΔHY) i forskellige humane colon cancer cellelinjer, hvis vækst er drevet af grundlæggende aktiv β-catenin (HCT116 og DLD1). En human coloncancer cellelinie, i hvilken β-catenin er inaktiv (RKO) tjente som en negativ kontrol. Øget SIRT1 ekspression stærkt reduceret proliferation i begge kolon cancercellelinier med konstitutivt aktiv β-catenin, men ikke i β-catenin-inaktiv cellelinie (fig. 3A-D). Den SIRT1

ΔHY katalytisk mutant havde ingen signifikant virkning på cellulær proliferation i nogen af ​​cellelinierne (fig. 3B-D). , SIRT1 undertrykker således β-catenin-drevne proliferation og dens katalytiske aktivitet er tilsyneladende nødvendig for denne effekt.

(A-D) Stabil LN-CAP, DLD1, HCT116 og RKO cellelinier, der udtrykker den angivne produkt blev podet og celletal blev overvåget på forskellige tidspunkter. Western blot blev udført med SIRT1, actin eller β-catenin antistoffer. (E) DLD1 stabile cellelinjer, der udtrykker Topflash-LuciferasePEST blev inficeret med de angivne konstruktioner. Celler blev analyseret ved Western blot med antistoffer mod SIRT1 og β-catenin. Luciferaseaktivitet blev normaliseret til total prøve protein og repræsenterer tre uafhængige forsøg udført i fire eksemplarer.

For yderligere at forstå den mekanisme, hvormed SIRT1 undertrykker β-catenin-drevne proliferation, vi manipuleret DLD1 cellelinje til at indeholde en stabilt integreret reporter med β-catenin responselementer (Super8XTopflash-Luciferase

PEST). Knockdown af β-catenin drastisk reduceret reporter aktivitet, hvilket viser afhængigheden af ​​reporter på endogene β-catenin-aktivitet (fig. 3E). Overekspression af SIRT1 reduceret reporter aktivitet med ~ 2-fold, hvorimod SIRT1

ΔHY katalytisk mutant havde nogen virkning (fig. 3E), hvilket antyder, at anti-proliferative virkninger af SIRT1 medieres af dets evne til at undertrykke den transkriptionelle aktivitet af endogen β-catenin og at dette kræver SIRT1 deacetylase-aktivitet.

Acetylering af β-catenin med p300 /CBP potenserer dens onkogenicitetsstudie ved at forøge β-catenin /TCF aviditet på target genpromotorer [26]. For at teste om SIRT1 modificerer β-catenin blev HEK293T celler transficeret med en mutant form af β-catenin, som konstitutivt lokaliseres til cellekernen (S33Y-β-catenin) [27]. I disse celler SIRT1 co-immunpræcipiteret med β-catenin (fig. 4A) og omvendt (fig. 4B). En interaktion mellem endogen SIRT1 og β-catenin var også tydelig (fig. 4C).

(A) Human 293T-celler blev transient transficeret med HA-S33Y-β-catenin i kombination med enten FLAG-mærket SIRT1 eller vektor kontrol. Portioner af totalt protein blev underkastet immunpræcipitation med anti-FLAG-antistof (IP FLAG). Immunopræcipiterede proteiner blev immunoblottet med anti-HA (øverste felt) og anti-FLAG (nederste panel). Venstre baner, uforarbejdede ekstrakter (input). (B) Human 293T-celler blev transficeret som i panel A. Proteiner immunpræcipiteret med anti-HA-antistof og immunblottet med anti-FLAG (øvre panel), og anti-HA (nederste panel). Venstre baner, uforarbejdede ekstrakter (input). (C) Immunopræcipitering af SIRT1 fra LN-CAP celleekstrakter bruger anti-SIRT1 antistof eller normal kanin IgG som kontrol (IgG). 10% af det immunopræcipiterede protein blev derefter blottet med anti-SIRT1 (øverste panel), mens de resterende 90% blev blottet med anti-β-catenin antistoffer. (D) 293T-celler blev transficeret som angivet og lyseret 48 timer senere. Sammenlignelige niveauer af β-catenin blev immunpræcipiteret og blottet for acetylerede-lysin rester (IP: HA IB: Ac-K, øverste panel). Blottet blev testet igen for HA at påvise omtrent lige store niveauer af HA-β-catenin (IP: HA IB: HA; nedre panel). (E-F) 293T-celler blev transficeret som angivet sammen med TOP-FLASH luciferase og PRL-TK Renilla luciferase konstruktion. Nicotinamid (NAM) eller retroviral SIRT1 shRNA (RNAi) blev tilsat som indikeret. Data er normaliseret i forhold til Renilla luciferaseaktivitet. Dataene er middelværdier ± standardafvigelse. fra prøver udført tredobbelt. (G) Indirekte immunofluorescens farvning af DLD-1 tyktarmskræft celler inficeret med tomme retrovirus eller virus indeholdende SIRT1 shRNA (RNAi) eller SIRT1 cDNA (overekspression, O /E). Procent af celler med høj, middel eller lave niveauer af nukleare β-catenin farvning for ubehandlet: 6,5, 80,6, 12,9; SIRT1 O /E: 0, 29,4, 70,5; SIRT1 RNAi: 60,0, 32,0, 0,8. Billeder blev taget ved 100 × forstørrelse.

For at teste, om SIRT1 hæmmer β-catenin ved at modulere sin acetylering, vi transficeret 293T-celler med S33Y-β-catenin, acetyltransferasen p300, og stigende mængder af SIRT1 . Vi fandt, at p300 acetyleret β-catenin (fig. 4D) og forstærkes dens transkriptionelle aktivitet, som tidligere rapporteret [27] (fig. 4E). Tilsætningen af ​​SIRT1 imidlertid afskaffet acetylerede form af β-catenin og signifikant formindsket β-catenin-aktivitet, når det blev co-transficeret med p300 (fig. 4D, E). Omvendt behandling celler med SIRT1 inhibitoren nicotinamid (NAM) [28] eller undertrykkelse SIRT1 med en retroviral shRNA vektor (fig. 4F) øgede luciferasereporteren aktivitet. Disse data viser, at SIRT1 fremmer deacetylering af β-catenin, hvilket reducerer dens evne til at fungere som en trans-aktivator.

Den konstitutive tilstedeværelse af β-catenin i kernen er forbundet med dets onkogene funktion og klinisk med en dårlig patient prognose [29]. For at teste om SIRT1 kan undertrykke β-catenin ved at ændre dens lokalisering, blev immunofluorescens udført på celler transfekteret med shRNA eller overekspression konstruktioner til SIRT1. Undertrykkelse af SIRT1 i DLD1 kolon kræftceller øget mængden af ​​nukleare β-catenin mens overekspression af SIRT1 i samme cellelinje ført til en dramatisk reduktion i den nukleare β-catenin pool (fig. 4G).

for at analysere den kliniske relevans af vores resultater, vi analyserede SIRT1 og β-catenin subcellulære udtryk i et væv microarray indeholdende 81 humane coloncancer prøver. Vi fandt, at en delmængde af coloncancere udtrykke SIRT1 i kernen (47/81 tilfælde; 58%). Når β-catenin udtryk blev scoret i de samme kolon kræft, en yderst signifikant omvendt korrelation mellem niveauet af SIRT1 udtryk og lokalisering nukleare β-catenin blev klart (p≤0.003, odds ratio 0,24 med 95% konfidensinterval 0,093-0,63) ( fig. 5A, B). Kollektivt, disse observationer tyder på, at modulering af β-catenin subcellulære lokalisering er en vigtig del af de anti-tumorigene effekter af SIRT1 med potentiel diagnostisk og terapeutisk klinisk relevans.

(A) Repræsentative billeder, der illustrerer SIRT1 og β-catenin subcellulære ekspression i humane colontumorer. For hvert tilfælde tyktarmskræft vist en tekstboks insert angiver den registrerede protein (Billede forstørrelse 200 ×). (B) Korrelation af SIRT1 og β-catenin ekspression i humane colontumorer. Søjlediagrammet viser kumulative Immunofarvning data fra et væv microarray af 81 tyktarmskræft tilfælde. Nuklear ekspression blev bedømt som enten ingen ekspression, svag ekspression, eller moderat /stærkt udtryk. Positivitet i kernen blev defineret som moderat /stærkt udtryk. Alle objektglas blev fortolket af to bord certificeret patolog blændet fra andre kliniske og laboratoriedata.

Diskussion

Her beskriver vi en fysiologisk relevant tumor undertrykkende rolle for SIRT1 i formation tyktarmskræft og vækst. Vi observerede, SIRT1 ekspression i den normale tarm forekommer specifikt i enterocytterne, precursor celler, der undergår neoplastisk transformation i coloncancerformer og at SIRT1 er opreguleret i gnavere tarmene som reaktion på CR. Vi viser, at overekspression af SIRT1 reducerer spredning i colon cancer cellelinjer, og at overekspression SIRT1 i enterocytterne af APC

min /+ dyr efterligner tumor undertrykkende virkninger af CR på denne tyktarmskræft model. Disse observationer er i overensstemmelse med en nylig

in vitro

undersøgelse, implicerer SIRT1 som næringsstof følsomt vækst suppressor [30]. Mens SIRT1 udtrykkes i vores transgene mus på højere niveauer end set i tarmene af CR behandlede gnavere (7 fold (SIRT1) versus 2 fold (CR)), dette niveau af overekspression er ikke desto mindre i overensstemmelse med resultater, at SIRT1 kan være fysiologisk opreguleres 5-10 fold

in vivo

[31]. Da tumor undertrykkende effekter medieret af SIRT1 formørkelse dem, der ses af CR (70% reduktion (SIRT1) versus 40% reduktion (CR)) [16] vi kan ikke udelukke, at SIRT1 hæmmer også tumorvækst ved en CR-uafhængig mekanisme. Ikke desto mindre er vores data giver

in vivo

beviser for, at overekspression af SIRT1 på fysiologisk relevante niveauer, kan undertrykke tumor dannelse og vækst.

I denne undersøgelse har vi også til stede beviser for, at SIRT1 interagerer med og undertrykker β-catenin, transkriptionsfaktoren der driver tumorer i APC

min /+ model og en række humane tumorer. Vi finder, at SIRT1 overekspression hæmmer væksten af ​​colon cancerceller afhængige af β-catenin-aktivitet, undertrykker lokaliseringen af ​​β-catenin til kernen, og væsentligt dæmper dens evne til at aktivere transkription. Disse effekter blev ikke observeret i SIRT1-HY mutant viser, at SIRT1 deacetylase aktivitet er påkrævet, og hæve den mulighed, at SIRT1 direkte målrettet β-catenin til deacetylering.

Tidligere undersøgelser har vist, at β-catenin er acetyleret ved p300 /CBP og acetylerede form af proteinet har øget transkriptionel aktivitet. Dette fund antyder, at den formodede deacetylase at modvirke p300 /CBP ville være nyttig som en kræft terapeutisk mål [32]. I denne undersøgelse, vi identificerer SIRT1 som deacetylase der antagoniserer p300 /CBP og deacetylerer β-catenin, og dermed bremse cellulær proliferation og tumorvækst

in vivo

.

Sammen vores data belyser evne SIRT1 til at inhibere β-catenin-aktivitet og tilvejebringer mekanistisk indsigt i de anti-tumorigene effekter af SIRT1 i en velkarakteriseret tyktarmskræft model. Da SIRT1 blev opdaget som en homolog af en lang levetid gen, er det interessant at bemærke den voksende beviser for en forbindelse mellem Wnt /β-catenin signalering og alder-associerede sygdomme. β-catenin er blevet forbundet med andre aldersrelaterede associeret maligniteter såsom melanom, multipelt myelom, og prostatakræft. Der er også den nylige opdagelse, at opregulering af Wnt /β-catenin signalering accelererer aldring i mus [23], [24]. Således vil det være værd at undersøge, om SIRT1 kan yde beskyttelse imod andre aldersrelaterede associerede sygdomme på grund af dets evne til at undertrykke Wnt /β-catenin signalering.

Sammenfattende hjælp biokemi, mus genetik og klinisk tumor eksemplarer vi har fundet, at SIRT1, en kost-responsive gen, er en regulator af β-catenin og har en tumor undertrykkende funktion. Vi konkluderer, at pattedyr levetiden gener med anti-apoptotiske funktioner, overraskende ikke nødvendigvis føre til øget tumorigenese. Faktisk finder vi det modsatte sandsynligvis tilfældet for SIRT1. Disse undersøgelser begynder at besvare en vigtig biologisk spørgsmål om funktionen af ​​en central levetid gen i cancer udvikling og vækst og foreslå en hidtil uidentificeret terapeutisk potentiale for SIRT1 aktivatorer i kræft.

Materialer og metoder

Gnavere

-inducerbart Cre SIRT1 udtryk konstruktion blev genereret a, hvor en

loxP

flankeret transkriptionel STOP element blev indsat mellem et CAGGS promotoren og SIRT1 cDNA. Denne konstruktion blev målrettet i musen Kollagen A1 locus ved anvendelse flp rekombinase-medieret genomisk integration som tidligere beskrevet (1). MES celler, der bærer en enkelt kopi af SIRT1

STOP konstruktion blev identificeret ved resistens over for antibiotikummet markør hygromycin og Southern blotting. PCR primere og konstruere kort er tilgængelige efter anmodning. To kloner blev injiceret i blastocyster og begge frembragte unger, -90% hvoraf viste bakterielinietransmission. Tumorbærende mus, der blev analyseret var blevet tilbagekrydset mindst fire generationer i C57 /BL6. APC

min /+ og villin-Cre transgene mus stammer blev opnået i C57 /BL6 baggrund fra Jackson Labs (Bar Harbor, ME). SIRT1

STOP dyr blev tilbagekrydses to generationer i C57BL /6 mus før passage til APC

min /+ til at generere SIRT1

STOP; APC

min /+ dobbelt transgene. Disse dyr blev avlet til at villin-Cre transgene mus til at generere en kohorte af SIRT1

ΔSTOP; Vil-Cre; APC

min /+ dyr. Dyr blev opretholdt ved Harvard Medical School og eksperimenter blev godkendt af Animal Care udvalg Harvard Medical School.

Male Fischer-344 (F344) rotter blev avlet og opdrættet i et vivarium på Gerontologi Research Center (GRC, Baltimore, MD). Fra fravænning (2 wks), blev rotterne opstaldet individuelt i standard plast bure med beta chip træ strøelse. Kontroldyr blev fodret med en NIH-31 standard diæt ad libitum (AL). Ved 1 måned gamle kalorieindhold begrænset (CR) dyr blev leveret et vitamin og mineral befæstede version af den samme kost på et niveau på 40% mindre mad (efter vægt) end AL rotter forbruges i den foregående uge. Filtreret og syrnet vand var tilgængeligt ad libitum i begge grupper. Vivarium blev holdt ved en temperatur på 25 ° C med en relativ luftfugtighed på 50% på en 12/12-timers lys /mørke-cyklus (lys tændt kl 6:00) Alle dyr var 6 måneder gamle og aflivet mellem 9:00 og 11.00 tarmen blev hurtigt fjernet og skyllet grundigt med iskold PBS og anbragt i flydende nitrogen og derefter opbevaret ved -80 ° C indtil forarbejdet til Western blotting under anvendelse af standardprocedurer.

dyrepatologi, histopatologi og immunhistokemisk analyse

for grov tumor analyse blev hele tarmen fjernet umiddelbart efter aflivning, åbnede på langs og vasket med koldt phosphatpufret saltvand (PBS), mens holdt nede et fast underlag. Adenomer større end 0,5 mm fra den proximale (10 cm distalt for pylorus), distale (10 cm proksimalt for coecum), og midten (-50% af den samlede intestinal længde) tyndtarmen samt colon blev bedømt. Tarme blev fremstillet under anvendelse af Swiss roll-metoden ved at dreje dem omkring en glas pipettespids. Væv blev fikseret og indlejret i paraffin under anvendelse af standard histologi protokollen. Præcis tumorstørrelse blev scoret mikroskopisk på hæmatoxylin /eosin farves af mus tarmene ved hjælp af et mikroskop med et okular mikrometer. Immunohistokemisk analyse af gnaver væv blev udført med kanin-anti-SIRT1 antistof (Upstate Biotechnology, kat # 07-131), kanin-anti-β catenin (Abcam # 2982), muse-anti-β-catenin (klon 14, BD transduktion labs) og rotte anti-mus Ki-67 (Dako).

immunhistokemisk og statistiske analyser

Tissue microarrays (TMAS) blev konstrueret som tidligere beskrevet [33] ved hjælp af automatiserede arrayer (Beecher Instruments, Sun Prairie , WI USA). For β-catenin og SIRT1 immunhistokemi, blev antigen hentning udført; afparaffinerede vævssnit blev behandlet ved en mikrobølgeovn i 15 minutter i citratpuffer (Biogenex, San Ramon, CA) i en trykkoger. Vævssnit blev inkuberet med 3% H

2O

2 (15 min) for at blokere endogen peroxidase og derefter inkuberet med 10% normalt gedeserum (Vector Laboratories, Burlingame, CA) i PBS (10 min), efterfulgt af 10 min inkubation i serum frit protein blok (DAKO, Carpinteria, CA). Primært antistof mod β-catenin (klon 14, BD Transduction Laboratories, Franklin Lakes, NJ) (fortynding 1:400) eller SIRT1 (# 1104; Epitomics) (fortynding 1:100) blev påført i 1 time ved stuetemperatur. Sekundært antistof (Biogenex) (20 min), og derefter streptavidin-peroxidasekonjugat (Biogenex) blev påført (20 min). Snit blev visualiseret ved diaminobenzidin (DAB) (2 min) og methyl-grøn kontrastfarve. Nuklear udtryk blev registreret som enten ingen udtryk, svag udtryk, eller moderat /stærkt udtryk. Positivitet i kernen blev defineret som moderat /stærkt udtryk. Alle β-catenin-farvet TMA lysbilleder blev fortolket af en patolog (S. O.) blændet fra andre kliniske og laboratoriedata. Alle SIRT1-farvet TMA lysbilleder blev fortolket af en patolog (R.F.) blændet fra andre kliniske og laboratoriedata. Til statistisk analyse blev chi-square test for kategoriske data ved hjælp af SAS-software program (Version 9.1, SAS Institute, Cary, NC). P-værdien var tosidet, og statistisk signifikans blev sat til p ≤ 0,05.

plasmider

pcDNA3-FLAG-SIRT1, pBABE-Puro-hSir2 (SIRT1), pBABE-Puro -SIRT1

ΔHY, pcDNA-HA-S33Y-β-catenin og pBABE-Puro-S33Y- β-catenin er blevet beskrevet før. SIRT1 RNAi plasmider blev konstrueret ved kloning af de sekvenser i pSUPER.retro plasmidet (oligoEngine, Seattle, WA). Én TOPFLASH plasmid blev indkøbt fra Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY), mens den anden blev genereret ved kloning tandem TCF bindende sites og TA-promotor fra SUPER8xTOPFLASH (slags gave fra Randall Moon) ind i Luciferase-PEST-plasmidet pGL4.15 (Promega , Madison, WI).

Cell Transfektioner, infektioner og Immuncytokemi

293T, LN-CAP, DLD1, HCT116 og RKO-celler blev holdt i den anbefalede vævskulturmedium (American Type Culture Collection ( ATCC), Manassas, VA) og dyrket i en fugtig inkubator indeholdende CO

2 (5% v /v) ved 37 ° C. I over-ekspression eksperimenter blev plasmider transficeret ved Fugene 6 metode (Roche). For stabil cellelinie generation blev DLD1 celler udvalgt i hygromycin i to uger og enkelte kolonier blev plukket og udvidet. For retroviral produktion blev 293T-celler transficeret med overekspression eller RNAi plasmider samtidigt med emballering plasmider gag-pol og VSV-G eller PCL-ampho. Medierne indeholdende virusafkommet frigives for de 293T-celler blev opsamlet og anvendt til infektion af cellerne i 3-6 timer i nærvær af 8 ug /ml polybren (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Mediet blev ændret, og cellerne blev inkuberet i yderligere 24-48 timers inkubering. De blev udvalgt med puromycin (Sigma Aldrich) i 24-48 timer og derefter trypsineret og podet til eksperimenter.

I immuncytokemi blev celler udpladet på 8 mm seks godt Teflon trykte objektglas (Electron Microscopy Sciences). Fireogtyve timer efter udpladning blev cellerne fikseret ved inkubering med 4% paraformaldehyd i 30 minutter. Fikserede celler blev derefter inkuberet med primære antistoffer til SIRT1 (# 1104; Epitomics (fortynding 1:100) og aktiv β-catenin (05-665; Chemicon) (fortynding 1:100) i 2 timer efterfulgt af inkubering med sekundære antistoffer (Alexa Fluor 488 gede-anti-kanin IgG og Alexa Fluor 568 gede-anti-muse-IgG;. Molecular Probes) (fortynding 1:400) celler blev inkuberet med 10 pg /ml Hoechst, vasket og monteret med et dækglas mindst 20 celler blev scoret. per eksperiment og billedoptagelse blev udført ved hjælp af et Olympus BX50 mikroskop.

Protein Extraction og Immunopræcipitering

Celleekstrakter analyseret direkte ved Western blotting, blev fremstillet ved cellelysis i 1 × SDS loading buffer efterfulgt af kogning og Western-analyse. Celleekstrakter til immunpræcipitering blev fremstillet ved resuspendering phosphatpufret saltvand-vasket cellepellets i 1 ml Nonidet P-40 (NP-40) ekstraktionsbuffer (50 mM Tris-HCI [pH 8,0], 150 mM NaCl, og 1% Nonidet P-40) suppleret med EDTA-fri proteaseinhibitor cocktail tabletter (Roche) med 10 mM nicotinamid (NAA) og 5 uM Trichostatin-A (TSA). Efter inkubation på is i 30 minutter blev ikke-ekstraherbare materiale fjernet ved centrifugering ved 17.000

g

i 10 minutter ved 4 ° C, og de clearede supernatanter blev anvendt til immunfældning. Lysater blev immunudfældet (2 timer), vasket 4 gange med NP-40-puffer og blev forarbejdet ved Western blotting.

proliferationsassays Salg

DLD1, HCT116 og RKO cellelinier inficeret med den passende konstrukt var podet i 24-brønds plader ved en densitet på 10.000 celler.