PLoS ONE: Epigenetisk Faktorer i Cancer Risk: Effekt af kemiske kræftfremkaldende stoffer på Global DNA Methylering Mønster i Human TK6 Cells

Abstrakt

I den aktuelle undersøgelse, vurderede vi de globale DNA methylering ændringer i den menneskelige lymfoblastoide (TK6) celler

in vitro

som svar på 5 direkte og 10 indirekte virkende genotoksiske stoffer. TK6 celler blev udsat for de udvalgte agenter i 24 timer i nærvær og /eller fravær af S9 metabolisk mix. Væskekromatografi-massespektrometri blev anvendt til kvantitativ profilering af 5-methyl-2′-deoxycytidin. Virkningen af ​​eksponering på 5-methyl-2′-deoxycytidin mellem kontrol og eksponerede kulturer blev vurderet ved anvendelse af den marginale model med korrelerede residualer på global DNA-methylering data%. Vi rapporteret induktion af global DNA hypometylering i TK6 celler som reaktion på S9 metaboliske mix, under de nuværende eksperimentelle indstillinger. Benzen, hydroquinon, styren, carbontetrachlorid og trichlorethylen induceret global DNA hypometylering i TK6 celler. Desuden viste vi, at dosis ikke har en effekt på den globale DNA methylering i TK6 celler. Afslutningsvis rapporterer vi ændringer i den globale DNA methylering som en tidlig begivenhed som reaktion på agenter traditionelt betragtes som genotoksisk

Henvisning:. Tabish AM, Poels K, Hoet P, Godderis L (2012) Epigenetisk Faktorer i Cancer Risk: Effekt af kemiske kræftfremkaldende stoffer på Global DNA Methylering Mønster i Human TK6 Cells. PLoS ONE 7 (4): e34674. doi: 10,1371 /journal.pone.0034674

Redaktør: Lorenzo Chiariotti, Università di Napoli Federico II, Italien

Modtaget: November 29, 2011; Accepteret: 6 Marts 2012; Udgivet: 11 april, 2012 |

Copyright: © 2012 Tabish et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Katholieke Universiteit Research Fund Leuven. De finansieringskilder spillet nogen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Miljømæssige kræftfremkaldende stoffer er en kendt risikofaktor for human cancer [1]. I sin klassiske model, carcinogenese indviede og provenu gennem ændringer i genomet (dvs., genetiske effekter) [2]. Således måler kræftfremkaldende-induceret DNA-skader dvs. DNA addukter dannelse og krydsbinding, og DNA mutationer er blevet ansat i klassiske tilgange til vurdering kræft risiko, for eksempel Ames test, komet assay og mikronukleusanalysen [3] – [5]. Kræftfremkaldende-induceret DNA-skader er en vigtig tidlig begivenhed under indledningen fase af carcinogenese, hvilket afspejler en permanent og irreversibel ændring i de igangsatte celler [6], [7]. Imidlertid indledning

per se

i en klassisk carcinogenese model ikke er tilstrækkelig til tumorudvikling, som resulterer fra bredere ændringer i den cellulære homeostase, primært på grund af den manglende evne hos initierede celler til korrekt kontrollere og regulere genekspression [ ,,,0],8].

Udsættelse for genotoksiske carcinogener, ud over deres genetiske virkninger, kan indebære en række ikke-genotoksiske virkninger i celler [9]. Ikke-genotoksiske virkninger i celler kan spille en vigtig rolle i udviklingen af ​​kræft [10]. Beviser tyder på, at ikke-genotoksiske forandringer i celler, for eksempel ændringer i cellulær epigenome, kan resultere i fremkomsten af ​​epigenetisk omprogrammerede celler [11]. Disse epigenetisk omprogrammerede celler en epigenetisk profil svarende til den hyppigt observeret i cancerceller, såsom ændret histon modifikation mønstre, hypometylering af DNA repetitive elementer og proto-onkogener og hypermethylering af tumorsuppressorgener. Ændret epigenetisk status giver genom ustabilitet og tab af kontrollerede vækst signaler, typisk observeret i cancerceller [12]. Epigenetiske ændringer snarere end specifikke genetiske mutationer

per se

rapporteres til klonal ekspansion af ændret hepatisk præneoplastiske foci og tumor udvikling [13].

For nylig, en række undersøgelser rapporteret, at de kræftfremkaldende effekter induceret af 2-acetylaminofluoren, tamoxifen, trichlorethylen, aflatoksin B1, ochratoksin, nikkel og chrom følger ikke et klassisk carcinogenese model, men snarere involverer et spektrum af cellulære ændringer omfatter de epigenetik. [8], [14] – [16]. Epigenetiske faktorer spiller en vigtig rolle i kræft ætiologi; men der er utilstrækkelig viden i at knytte epigenetiske faktorer til miljømæssig carcinogenese i præmaligne væv [17]. Baseret på stigende dokumenterede epigenetiske ændringer i kræft ætiologi målet med denne undersøgelse er at vurdere, om ændringer i den globale DNA-methylering er en tidlig cellulær begivenhed som reaktion på genotoksiske kræftfremkaldende stoffer med en kendt virkemåde (addukter formgivning og tværbindingsmidler ). I denne undersøgelse, brugte vi 5 direkte og 10 indirect- handler genotoksiske kræftfremkaldende stoffer at eksponere humane lymfoblastoide celler (TK6) i 24 timer. TK6 celler blev udsat for kræftfremkaldende stoffer på 3 dosisniveauer (lav, middel og høj) i dubletter. S9 metabolisk blanding blev tilsat i kulturer i halvdelen af ​​forsøgene, fordi indirect- virkende kræftfremkaldende stoffer kræver S9 metabolisk mix at blive funktionelle carcinogener. Vi anvendte humane thymidin kinase heterozygote TK6 celler i denne undersøgelse, fordi de udtrykker vildtype p53, vokser hurtigt i suspension (population fordoblingstid på 12-14 timer), og anvendes rutinemæssigt i genetiske toksikologiske undersøgelser. Efter eksponering blev cellerne høstet, blev DNA ekstraheret, hydrolyseret, og den globale DNA methylering niveauer blev kvantificeret i TK6 celler.

Materialer og metoder

Cell Kultur

TK6 celler købt hos European Collection of Cell Cultures (ECACC, Wiltshire, UK). Celler blev inddelt i 15 behandlingsgrupper og 2 kontrolgrupper (kontrol S9-, kontrol S9 +), og dyrket i RPMI 1640 medium indeholdende 10% varmeinaktiveret hesteserum, 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 2 mM L -glutamine ved 5% CO2 og 37 ° C. Celler blev holdt ved en densitet på 10

6 celler /ml og udsat i 24 timer for kræftfremkaldende stoffer. Vi har oprettet to biologiske replikater pr kemisk dosis, 10 kontrol S9- gentagelser, og 5 kontrol S9 + replikater.

På grund af kravet om enzymatiske biotransformation af procarcinogens at blive aktive kræftfremkaldende stoffer, en blanding af S9 (1% v /v) af human lever blev tilsat til kulturen i halvdelen af ​​forsøgene [18], [19]. Lever S9 fraktioner opnået fra CELSIS (Neuss, Tyskland), og indeholdt lægemiddel-metaboliserende enzymer, herunder cytochrom P450, flavin monooxygenaser og UDP glukuronyltransferaser. En eksogen NADPH-regenererende system (1,3 mM NADP +, 3,3 mM glucose-6-phosphat, 0,4 U /ml glucose-6-phosphatdehydrogenase og 3,3 mM magnesiumchlorid, BD Biosciences, Erembodegem, Belgien) kræves i leveren S9 for fase I oxidation blev inkluderet i forsøgene. Celler blev udsat for kræftfremkaldende i dubletter med eller uden S9 metabolisk mix.

Kemikalier, levedygtighed Analyser og Dose Selection

Vi valgte kemikalier med velbeskrevne genotoksiske egenskaber [20]. En liste over de udvalgte agenter, er deres dosis klassificering og eksponering givet i tabel S1. Alle kemikalier blev indkøbt fra Sigma-Aldrich, og opløst og fortyndet i dimethylsulfoxid (DMSO). Levedygtighed assays blev anvendt til at vælge doser pr agent. Vi anvendte 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyl tetrazoliumbromid (MTT) levedygtighedsassay [21], og også tælles andelene af levende og døde celler ved anvendelse af en grevinde ™ Automated Cell Counter ( Invitrogen, Carlsbad, CA). Baseret på levedygtighed analyser, valgte vi tre doser pr kemiske, dvs. en dosis med 95% cellulær levedygtighed (høj dosis), 1/10 af høj dosis (middel dosis) og 1/100 af høj dosis (lav dosis).

DNA Extraction, Koncentration og Renhed

efter 24 timers behandling, celler blev straks behandlet til dna-ekstraktion. DNA blev ekstraheret under anvendelse Trizol® reagens med PureLinkTM Micro-til-Midi System® ifølge fabrikantens protokol (Invitrogen, Carlsbad, CA). DNA mængde og kvalitet blev målt ved NanoDrop Spektrofotometri og Agilent 2100 Bioanalyzer.

enzymatisk hydrolyse af DNA

ekstraherede DNA blev hydrolyseret til individuelle deoxyribonucleosider i en forenklet ettrinsprocedure [22]. Kort sagt blev DNA fordøje mix fremstillet ved tilsætning 250 U Benzonase (Sigma-Aldrich), 300 mU Phosphodiesterase I (Sigma-Aldrich), og 200 U alkalisk phosphatase (Sigma Aldrich) til 5 ml Tris-HCI-buffer (pH 7,9, 20 mM) indeholdende 100 mM NaCl og 20 mM MgCl

2. 1 ug ekstraheret DNA fra eksponerede og kontrolprøver blev hydrolyseret i 100 pi reaktionen ved tilsætning af 50 pi fordøje mix, og prøver blev inkuberet ved 37 ° C i 6 timer. Hydrolyserede prøver blev bragt til 1 ml ved tilsætning af HPLC-kvalitet H

2O.

Kalibrering Standards

Kalibreringsstandarder for 5’methyl- deoxycytidin ((5ME) dC) og deoxycytidin (dC ) blev indkøbt fra Sigma og opløst i LC-MS kvalitet vand (stamopløsninger). En kalibrering serien blev forberedt til 5 (Me) fm og dC i en række 0,1-10 ppb og 10-100 ppb henholdsvis fra stamopløsninger. De samme kalibreringsstandarder blev brugt i alle forsøgene.

LC-ESI-MS /MS Instrumental Analysis

Global DNA methylering blev opnået ved at kvantificere (5ME) dC og dC hjælp ultra-pres væskekromatografi (UPLC) for fraktion separation og tandem-massespektrometri (MS-MS) til kvantificering. Analyser blev udført på Waters Acquity UPLC udstyret med autosampler og Micromass MS Technologies Quattro Premier massespektrometer. En 10 pi prøve blev indført på et Acquity UPLC BEH C

18, 50 mm × 2,1 mm, 1,7 um søjle, holdt ved 40 ° C. Mobil fase, der anvendes til chromatografisk separation var en blanding af 0,1% myresyre i vand (A) og 0,1% myresyre i acetonitril (B) under anvendelse af følgende gradient: 0 min: 90% A og 10% B, 2-2,5 min: 100% B, 3,9-4,0 min: 90% a og 10% B ved en strømningshastighed på 0,35 ml /min. Alle mobile fase bestanddele var LC-MS kvalitet og blev købt fra Biosolve (Valkenswaard, Holland).

Først udførte vi full scan spektrum under elektrospray (ESI) betingelser. I fuld scanning spektrum, natrium addukter 5 (Me) DC /DC [M + Na] + og 5 (Me) DC-DC dimerer blev også observeret, hvilket er et almindeligt fænomen i en ESI-MS fuld scanning [23]. Analyser blev udført i ESI + modus og en multipel overvågning reaktion (MRM) blev anvendt med argon som kollisionen gas ved et tryk på 2,88 10

-3 mbar. Overgange overvågede var m /z 242,00 → 125,85 for 5 (Me) dC (kegle spænding 14 V, kollision energi 10 eV) og m /z 228,10 → 112,00 for dC (kegle spænding 14 V, kollision energi 17 eV). Dvæletid pr overgang var 100 ms.

Calibration Curve

Vi observerede lineær respons af standarder i en række koncentrationer (0,1-10 ppb og 10-100 ppb) for 5 (Me) dC og dC med korrelationskoefficienter på 0,9991 og 0,9970 hhv.

Statistik

Den procentdel af den globale DNA methylering blev beregnet pr kemisk dosis og udtrykkes som (5ME) dC /[(5ME) dC + DC] %. Vi brugte marginal model til at undersøge faktorer tegnede sig for i den observerede variation i den globale DNA methylering i TK6 celler, dvs. kemikalier, dosis og S9. Rester blev plottet til at kontrollere de antagelser normalitet i den marginale model. Shapiro-Wilk test for rester viste sig at være ikke-signifikante, hvilket indebar, at tilnærme en reaktion på en normalfordeling var passende. SAS 9.2 statistiske pakke blev anvendt til at passe den marginale model. Box plots blev genereret for kemikalier med en signifikant effekt på den globale DNA methylering i TK6 celler ved hjælp SPSS V.18.

Resultater

Global DNA methylering i kontrol og udsatte kulturer pr kemisk dosis uden og med S9 metabolisk blanding er angivet i tabel 1 og 2. Vores resultater viser induktion af global DNA hypometylering som reaktion på S9 metabolisk blanding som vist i figur 1.

Global DNA-methylering er udtrykt som en procentdel af 5-methylcytosin versus det samlede antal cytosiner til stede i genomet. Boksen plot beskriver medianen (linje på tværs af boksen), inter-kvartil rækkevidde og maksimum og minimum værdier (whiskers). Outliers er vist som åbne cirkler uden enderne af knurhår. Vejviser

Variation i den globale DNA methylering af kontrol og eksponerede kulturer viste normalfordeling (Figur S1). Antages global DNA methylering at være normalfordelt, og i betragtning af hver kemisk eksponering at være uafhængig, men replikation inden eksponering at være korreleret, en marginal model, som indfanger denne afhængighed, blev anvendt. Kovariansen mellem model residualer, hvilket svarer til en ensartet korrelation inden gentagne prøver, blev anslået til at være 0,54. Ignorerer sammenhængen inden replikerede eksponeringer kunne resultere i en i nøjagtigt skøn over betydningen af ​​den globale DNA methylering. I vores resultater, vi observerede kemikalier og S9 tegner sig for den observerede variation i den globale DNA-methylering i TK6 celler (tabel S2). Dosis viste sig at være ikke-signifikante selv i fravær af S9 i den marginale model. Modellen blev ombygget eksklusive dosis og resultaterne er angivet i tabel 3.

Endvidere viser vi, at benzen og dets metabolit hydroquinon og styren, carbontetrachlorid og trichlorethylen væsentligt påvirket den globale DNA-methylering i TK6 celler (tabel 3). Globale DNA-methylering profiler observeret med udsættelse for disse kemikalier i TK6 celler uden og med S9 er vist i figur 2 og 3 henholdsvis.

Global DNA-methylering er udtrykt som procentdel af 5-methylcytosin versus det samlede antal cytosiner stede i genomet. Boksen plot beskriver medianen (linje på tværs af boksen), inter-kvartil rækkevidde og maksimum og minimum værdier (whiskers). Outliers er vist som åbne cirkler uden enderne af whiskers.

Global DNA-methylering er udtrykt som procentdel af 5-methylcytosin versus det samlede antal cytosiner til stede i genomet. Boksen plot beskriver medianen (linje på tværs af boksen), inter-kvartil rækkevidde og maksimum og minimum værdier (whiskers). Outliers er vist som åbne cirkler uden enderne af knurhår.

Diskussion

Den klassiske teori om carcinogenese er drevet af genetiske mutationer og kromosomafvigelser der giver genom ustabilitet [24], [25 ]. Men den aktuelle undersøgelse understreger betydningen af ​​den globale DNA methylering som en tidlig epigenetisk faktor som reaktion på genotoksisk eksponering.

Indirect- handler kræftfremkaldende stoffer kræver metabolisk aktivering for at blive reaktive kræftfremkaldende stoffer. På grund af den krævede metabolisk aktivering, en blanding af S9 leverekstrakt (1% v /v) blev tilsat til halvdelen af ​​kulturerne. S9 blanding indeholder enzymer, der er nødvendige for fase-I metabolisk aktivering af fremmedstoffer. Ekspression af metaboliske enzymer er forbundet med reaktive oxidative stress pathways [26]. Oxidativ stress påvirker DNA-methylering ved at ændre S-adenosylmethionin (SAM) og S-adenosylhomocystein (SAH) forhold [27] – [29]. I denne undersøgelse tilsætning af S9 metabolisk mix i TK6 cellekulturer resulterede i global DNA hypometylering (β = -0,9082,

s Restaurant 0,0001) (tabel 3, figur 1). S9-induceret global DNA hypometylering i disse kulturer kunne mekanismemæssigt forbundet med induktion af oxidativ stress pathways. Oxidativ stress aktiverer cellulære og nukleare signalveje, som har iboende histonacetyltransferase (HAT) og histon deacetylase (HADC) aktiviteter. Til gengæld er disse proteiner knyttet til DNA methyltransferaser (DNMTs) i de nukleare veje, der fører til de konformationelle ændringer i histoner og kromatin struktur, og dermed de ændrer den cellulære transskription niveau [30], [31].

En række kemikalier, der anvendes i denne undersøgelse påvirkede globale DNA-methylering ændringer i TK6 celler (tabel 3, figur 2 og 3). Vi observerede interessante globale DNA methyleringsmønstre. Benzen (β = -1,5289,

s

0,0295), og det metabolit hydroquinon (β = -1,8029,

s

0,0108) eksponering induceret global DNA hypometylering i TK6 celler, mens styren eksponering (β = -1,7332,

s

0,0115) induceret global DNA hypometylering men dets metabolit styrenoxid eksponering påvirkede ikke den globale DNA methylering i TK6 celler (β = -0,2999,

p

0,6547). Benzen eksponering har vist sig at være forbundet med reducerede methylering niveauer af DNA repetitive elementer [32]. Benzen og hydroquinon eksponering aktiverer de oxidative stress omsætningsveje i celler, som påvirker det cellulære DNA methylering mønster [33]. Styren eksponeringen inducerer DNA-adduktdannelse og oxidativt stress i celler [34]. Ud over disse effekter, rapporterer vi induktion af global DNA hypometylering ved styren som et potentielt ikke-genotoksisk mekanisme, der kunne redegøre for sin giftighed. Vi udsættes også TK6 celler til tetrachlormethan og trichlorethylen. Disse kemikalier hovedsageligt virker gennem dannelsen af ​​reaktive mellemprodukter efter metabolisk aktivering. I den aktuelle undersøgelse, observerede vi global DNA hypometylering induceret af carbontetrachlorid (β = -1,3879,

s

0,0475) og trichlorethylen (β = -1,5302,

s

0,0294) eksponering i TK6 celler (tabel 3, figur 2 og 3). Tidligere undersøgelser også rapporteret lignende resultater om tetrachlormethan og trichlorethylen (TCE) induceret global DNA hypometylering. Tetrachlormethan induceret global DNA hypometylering blev reddet ved supplering med S-adenosylmethionin (SAM) i rottelever [35], [36]. Disse observationer foreslog, at tetrachlormethan induceret DNA hypometylering involverede methionin metaboliske veje. Desuden er disse kemikalier inducerer oxidativt stress, som kan påvirke den cellulære methylome.

I modsætning til andre undersøgelser, vi ikke observere globale DNA methylering ændringer i TK6 celler ved udsættelse for polyaromatiske kulbrinter (PAH). Kronisk eksponering af benzo [a] pyren til muse embryonale fibroblaster

in vitro

induceret global DNA hypermethylering [37]. Også, er rapporteret forskelle i DNA-methylering niveauer i perifere blodlymfocytter af arbejdere kronisk eksponeret for PAH i forhold til deres tilsvarende kontrolpersoner [38]. Forskellige eksperimentelle indstillinger, der bruges i disse undersøgelser sammenlignet med den aktuelle undersøgelse kunne forklare den heterogenitet observeret i PAH’er inducerede DNA methylering ændringer. Endvidere blev der ikke observeret globale DNA methylering ændringer i TK6 celler til mitomycin C, formalin, cyclophosphamid, ethylenedibromide, epichlorhydrin og acrylamid. Global DNA methylering ændringer i respons på disse kemikalier er ikke blevet rapporteret andetsteds. Subtile epigenetiske effekter, såsom histon ændringer og gen-specifikke DNA methylering, som svar på disse kemikalier ikke kunne ignoreres, og vil blive undersøgt yderligere.

Global DNA hypometylering i TK6 celler induceret af direkte og indirect- handler genotoksiske carcinogener undersøgt i dette studie kunne antyde, at cellerne er under præ-neoplastiske tilstande. Hvis vedvarende global DNA hypometylering fortsætter, kan det drive disse celler til neoplastisk fænotype. Imidlertid skal varigheden og omfanget af eksponering kræves for vedvarende global DNA hypometylering at give neoplastisk fænotype, at være fuldt forstået.

Konklusion

Som konklusion, rapporterer vi den ikke-genotoksisk effekt, dvs. ændring i global DNA-methylering, som svar på en række kræftfremkaldende stoffer, der traditionelt anses for at handle gennem genotoksiske mekanismer. Vi beskriver også, at S9 metabolisk mix ændrer den globale DNA-methylering mønster i TK6 celler. Det fremtidige arbejde vil tage fat på de dosisafhængige virkninger af S9 metaboliske mix

in vitro

og de involverede veje i kræftfremkaldende-induceret DNA methylering ændringer. Vores resultater tyder på brugen af ​​forskellige cellelinjer og mere varierede analyser at validere de ovenstående resultater og til at udforske de mekanistiske links.

Støtte Information

Figur S1.

Histogram og tæthed plot af residualer til at vurdere normalitet. Normalitet antagelse af respons (global DNA methylering) blev vurderet ved at plotte residualerne (x-akse). Plottet synes at fremgå, at denne antagelse er plausibelt. Shapiro-Wilk test blev også udført for at bekræfte normalitet og residualer viste sig at være ikke-signifikante

doi:. 10,1371 /journal.pone.0034674.s001

(TIF)

tabel S1.

Oversigt over agenter, deres klassificering og administrerede doser, der anvendes i behandlingen af ​​TK6 celler.

doi: 10,1371 /journal.pone.0034674.s002

(DOCX)

tabel S2.

Resultater af den marginale model, der beskriver effekten af ​​eksponeringen, dvs. kemikalier, dosis, og S9, på den globale DNA methylering i TK6 celler

in vitro

.

doi: 10,1371 /journal.pone.0034674.s003

(DOCX)

Tak

Vi vil gerne takke Peter Collaerts og Karine Vranckx for deres hjælp i kemisk eksponering til TK6 cellekulturer.