PLoS ONE: Discovery og validering af nye potentielle Biomarkører for tidlig påvisning af Colon Cancer

Abstrakt

Baggrund

Præcis detektering af karakteristiske proteiner udskilles af tyktarmskræft tumorceller i biologiske væsker kunne tjene som en biomarkør for sygdommen. Formålet med denne undersøgelse var at identificere og validere nye serum biomarkører og demonstrere deres potentielle anvendelighed til tidlig diagnose af tyktarmskræft

Metoder

Undersøgelsen blev organiseret i tre sekventielle faser:. 1) biomarkør opdagelse, 2) teknisk og biologisk validering, og 3) proof of concept til at teste den potentielle kliniske anvendelse af udvalgte biomarkører. En prioriteret delmængde af differentielt udtrykte gener mellem vævstyper (50 colon mucosa fra kræft-fri individer og 100 normal-tumor par fra patienter med tyktarmskræft) blev valideret og testet yderligere i en serie af serumprøver fra 80 coloncancer-sager, 23 patienter med adenom og 77 kræft-fri kontroller.

resultater

i opdagelsen fase, blev 505 unikke kandidat biomarkører identificeret, med meget markante resultater og høj kapacitet til at skelne mellem de forskellige vævstyper. Efter en efterfølgende prioritering, alle testede gener (N = 23) lykkedes valideret i væv, og en af ​​dem, COL10A1 viste relevante forskelle i serum protein niveauer mellem kontrol, patienter med adenom (p = 0,0083) og tyktarmskræft tilfælde (p = 3.2e-6).

Konklusion

Vi præsenterer en sekventiel proces for identifikation og yderligere validering af biomarkører for tidlig påvisning af tyktarmskræft, der identificerer COL10A1 protein niveauer i serum som en potentiel diagnostisk kandidat til at detektere både adenom læsioner og tumor.

Impact

anvendelse af en billig serum test til screening tyktarmskræft bør forbedre sine erhvervsfrekvensen og bidrage til at mindske byrden af ​​denne sygdom.

Henvisning: Eneste X, Crous-Bou M, Cordero D, Olivares D, Guino E, Sanz-Pamplona R, et al. (2014) Discovery og validering af nye potentielle biomarkører for tidlig påvisning af tyktarmskræft. PLoS ONE 9 (9): e106748. doi: 10,1371 /journal.pone.0106748

Redaktør: Francisco X. Real, Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), Spanien

Modtaget: April 23, 2014 Accepteret: August 1, 2014; Udgivet 12. september, 2014

Copyright: © 2014 Solé et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Den genekspression datasæt findes i National Center for Biotechnology Informations Gene Expression Omnibus med GEO-serien tiltrædelsen nummer GSE44076. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af den catalanske Institut for Onkologi (ICO) og Det Private Foundation for Biomedical Research Institute of Bellvitge (IDIBELL), den Instituto de Salud Carlos III [giver PI08-1635, PI08-1359, PS09-1037, PI11-1439], CIBERESP CB06 /02/2005 og “Acción tværgående del kræft”, den catalanske regering DURSI [tilskud 2009SGR1489], Fundació Privada Olga Torres (FOT), den spanske sammenslutning Against Cancer (AECC) Videnskabelig Foundation, Europa-Kommissionen [give FP7-COOP-Sundhed-2007-B HiPerDART], og Xarxa de Bancs de tumorer de Catalunya sponsoreret af Pla direktør d’Oncología de Catalunya (XBTC). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har indgivet en patentansøgning vedrørende anvendelse af COL10A1 som biomarkør for tidlig diagnosticering af tyktarmskræft med titlen: “SERUM biomarkør til diagnosticering tarmkræft”. Europæisk patent nummer: EP2680003A1 (28.06.2012) og Spanien ES2436667A2 (2014/03/01). Forfatterne bekræfte, at dette ikke ændrer deres tilslutning til alle PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er en førende dødsårsag på verdensplan, med over en millioner af nye tilfælde og en halv million af dødsfald verden over hvert år [1]. Femårige relative overlevelsesrater er under 50%, men dette i høj grad afhænger af det stadium på diagnosetidspunktet [2]. Ingen primær forebyggende foranstaltning har vist effekt ved at reducere forekomsten, men tidlig påvisning gennem populationsscreening har vist sig at reducere dødeligheden [3].

I dag er der debat om, hvilke test bør anvendes til CRC screening. Indtil indsamles yderligere dokumentation, nuværende europæiske retningslinjer accepterer fækal okkult blodprøve efterfulgt af bekræftende koloskopi, hvilket er terapeutisk når resekterbare adenomer identificeres [4]. De fleste befolkningsbaserede screeningsprogrammer bruger guaiacum baseret fækal okkult blodprøve, som biokemisk registrerer små spor af blod stammer fra blødende læsioner i afføring eller fækal immunologisk test, som er baseret på immunodetektion af humant hæmoglobin i fæces. Disse tests har en følsomhed på 80% for CRC og 28% for adenom 1 cm, og særlige i intervallet på 91 til 94% [5]. Desuden patient-compliance med afføring assays ofte lavt [6]. Brugen af ​​koloskopi som en guld standard for CRC screening er kontroversiel. Det har rapporteret højere følsomhed (97%) og specificitet (98%) for tidlig påvisning af CRC, men det har også flere faldgruber forbundet til det: øgede økonomiske omkostninger; krav om højt uddannet personale; ubehagelig forberedelse tarm; invasionsevne; risiko for morbiditet og mortalitet forbundet med proceduren [7], [8]. Desuden er der i de lande, hvor den nationale koloskopi screening er tilgængelig, overholdelse har ofte været lav [9].

Serum-baserede markører ville være yderst attraktiv for CRC-screening, da de er minimalt invasiv og kunne integreres i enhver rutine sundhed helbredsundersøgelse uden behov for yderligere afføring prøvetagning, hvorved stigende accept blandt patienter. Aktuelle molekylærbiologiske teknikker tillader en lettere generation af mange hypoteser kandi- biomarkører for diagnose, prognose eller terapeutisk respons i CRC, men behovet for en ordentlig valideringen er ofte rapporteret [10] – [12]. Den underliggende hypotese er, at tumorceller af CRC, selv i sine pre-invasive stadier, lider vigtige genetiske ændringer, der inducerer frigivelse af karakteristiske proteiner eller nukleinsyrer potentielt påviselige i biologiske væsker opnået ved ikke-invasive fremgangsmåder, såsom blod eller fæces [11] . Detektion af molekylærbiologiske teknikker af disse stoffer vil tjene som en biomarkør for sygdom til at udvikle diagnostiske tests med forbedret forudsigende magt nuværende screeningstest. Derfor er formålet med denne undersøgelse var at identificere og validere nye serum biomarkører og demonstrere deres potentielle anvendelighed til tidlig diagnose af tyktarmskræft.

Metoder

biomarkør vurdering i denne undersøgelse blev organiseret i sekventielle og sammenhængende faser for opdagelse, teknisk og biologisk validering, og proof of concept til at teste den potentielle kliniske anvendelse af udvalgte biomarkører. For det første blev genekspression microarray data analyseres for at identificere kandidat biomarkører i vævsprøver fra tyktarmskræft tilfælde og kræft-fri kontroller (

Discovery Phase

). For det andet ved hjælp af en alternativ teknik baseret på kvantitativ real-time PCR (RT-qPCR), blev et udvalg af differentielt udtrykte gener valideret i det samme sæt af vævsbiopsier (

Teknisk Validering Phase

), såvel som i biopsier opnået fra et uafhængigt sæt af patienter (

Biologisk Validering Phase

). Endelig blev den potentielle kliniske anvendelse af de mest lovende validerede kandidater testet i serumprøver fra tyktarmskræft tilfælde, et lille sæt af adenomer og kræft-fri kontrol gennem påvisning af den tilsvarende udskilte protein under anvendelse enzymkoblet immunosorbentassay (ELISA) test (

Proof of Concept Phase

). Rapporterede stard retningslinjer [13] har været grundlag for at definere vores protokol.

Patienter og prøver

De vigtigste karakteristika for de emner, der indgår i den foreliggende undersøgelse er vist i tabel 1. Colon tumor og parret tilstødende (~5-10 cm) patologisk normale mucosa vævsprøver anvendt i denne undersøgelse blev opnået på tidspunktet for kirurgi fra en række sager med en hændelse diagnose af colon adenocarcinom deltage Bellvitge Universitetshospital (Barcelona, ​​Spanien) mellem januar 1996 december 2007. Inkluderet sager blev udvalgt til at danne en homogen serie af patienter med stadie II, mikrosatellit-stabil sporadisk tyktarmskræft. Alle patienter undergik radikale indgreb og modtog ikke kemoterapi før operation. Patologer bekræftede alle coloncancer diagnoser og udvalgte friske vævsprøver fra tumor og tilstødende slimhinde taget fra den proximale resektion margin. En hæmatoxylin-eosin-farvning blev udført på et objektglas nedskæring af tumorprøve at vejlede patologen i udvælgelsen af ​​et område med mindst 75% af tumorcellerne. Scenen gruppering fulgte den autoritative UICC guide “TNM Atlas, 6th Edition”. Den bedste tilnærmelse til denne klassificering blev afledt af oplysninger, der indsamles på tidspunktet for diagnose for hver enkelt sag.

Vævsprøver af colon mucosa fra kræft-fri kontroller blev opnået gennem koloskopi mellem februar og maj 2010. En række konsekutive patienter, som gennemgik koloskopi angivet med symptomer (som regel anæmi, blødning, gastrointestinale smerter eller ændret rytme), blev inviteret til at deltage. Dem med negative resultater (dvs. uden colon læsioner) blev inkluderet i denne undersøgelse. Ingen af ​​dem arvelig kræft.

Endelig serumprøver fra tyktarmskræft tilfælde og kræft-fri kontroller blev udvalgt fra en epidemiologisk case-kontrol undersøgelse af gen-miljø interaktioner, der tidligere er blevet beskrevet i detaljer [ ,,,0],14]. Alle serumprøver blev indsamlet før kirurgi for sager og lige før koloskopi for kontrollen.

For at forenkle navngive forskellige typer prøve, her vil vi bruge

tumor

(T), når der henvises til tumor prøver fra kolon kræftpatienter,

tilstødende normale Hotel (A), når der henvises til patologi normale kolon mucosa prøver fra patienter med tyktarmskræft, og

kræft gratis

(F), når der henvises til kolon mucosa prøver fra kræft-fri individer.

Clinical Research Ethics Committee for Bellvitge Universitetshospital godkendte forsøgsprotokollen, og alle personer forudsat skriftligt informeret samtykke til at deltage, og for genetiske analyser, der skal gøres på deres prøver.

RNA udvinding

Total RNA blev isoleret fra frosne vævsprøver ved hjælp Exiqon miRCURY RNA Isolation Kit (Exiqon A /S, Danmark), i henhold til producentens protokol, og overvejer alle anbefalede forholdsregler for at undgå RNA-nedbrydning af RNaser. Ekstraherede RNA blev kvantificeret ved NanoDrop ND-1000 spektrofotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) og opbevaret ved -80 ° C. Kvaliteten af ​​disse RNA-prøver blev yderligere kontrolleret anvendelse af RNA 6000 Nano Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) efter producentens anvisninger, og blev bekræftet ved gelelektroforese. RNA integritet tal (RIN) viste god kvalitet ([Q1 = 7,5; Median = 8.25; Q3 = 8,9] for tumorer, [Q1 = 7; Median = 7,5; Q3 = 8] for tilstødende normale og [Q1 = 7,8; ​​Median = 8.3; Q3 = 8.65] for en sund normal). RNA renhed blev målt med forholdet mellem absorbans ved 260 nm og 280 nm (middelværdi = 1,96, SD = 0,04), med ingen forskelle mellem vævstyper

Discovery-serien -. Udtryk arrays

opdagelse serien indgik 100 par tumor og tilstødende normale kolonmucosa prøver og 50 prøver af colon mucosa fra cancer-frie individer (total n = 250). Totalt RNA ekstraheret fra disse prøver blev hybridiseret på Affymetrix Human Genome U219 Array plader (Affymetrix, Santa Clara, CA) efter fabrikantens anbefalinger. Fire prøver (to tilstødende normal-tumor par) blev udelukket fra datasættet efter kvalitetskontrol. Således blev en sidste datasæt på 246 arrays bruges til efterfølgende analyser.

Rådata blev normaliseret ved hjælp af den Robust Multiarray Gennemsnitlig algoritme [15] implementeret i

affy

pakke [16] i BioConductor suite (https://www.bioconductor.org) [17]. Alle statistiske analyser blev udført med den statistiske computing software R (https://www.r-project.org) [18].

Før blev udført den differentielle ekspression analyse, lav variant og Y-kromosom udskrifter blev fjernet fra efterfølgende analyser. For de resterende probesets blev legaliseret-Students t-test anvendes til at påvise signifikant overekspression mellem tilstødende normale (A) eller tumorprøver (T) og kræft-fri mucosa (F). Bonferroni korrektion blev anvendt til at redegøre for flere test hypotese. For at indsnævre de oprindeligt opnåede lister, blev kandidat probesets yderligere filtreret baseret på forskellige kriterier: lave udtryk niveauer og lav variation i kræft-fri slimhinde; stor gennemsnitlig fold skift mellem T /F eller A /F; og ensartethed i effekter mellem flere prober til det samme gen, når de foreligger. Probesets der passerede kriterierne filtrering blev kortlagt til gener, andele i oplysninger, der anvendes for downstream analyser

En prioritering procedure blev udført for at udvælge de bedste kandidatgener til validering ved hjælp af offentligt tilgængelige oplysninger [19] -. [24] . Kriterier tegnede sig for var relateret til reproducerbarhed og specificitet spørgsmål: observeret reproducerbarhed af udtrykket forskelle; meget lave niveauer af ekspression i blod væv; og udvælgelse af gener med stor ekspression i colon væv sammenlignet med andre væv ifølge GeneCards database (https://www.genecards.org) [25], selv om de fleste gener blev udtrykt i flere væv. Den genekspression datasæt findes i National Center for Biotechnology Informations Gene Expression Omnibus [26] med GEO-serien tiltrædelsen nummer GSE44076 og i projektets hjemmeside (https://www.colonomics.org).

Teknisk og biologisk validering – RT-qPCR til ekspression vurdering

Expression niveauer af udvalgte gener blev vurderet med RT-qPCR både for opdagelsen serien og for et ekstra sæt af 104 prøver (70 parrede tilstødende normale /tumorvæv fra tyktarmskræft patienter og 34 fra cancer-fri kontrol). Disse prøver blev indsamlet i perioden mellem januar 1996 og juni 2011 efter den samme protokol og opbevaret under de samme betingelser som opdagelsen serien. cDNA blev syntetiseret ud fra det ekstraherede mRNA med transkriptionen første streng cDNA syntesekit (Roche Applied Science, Penzberg, Tyskland) ved at følge standardprocedurer.

To sæt primere blev udformet for hvert gen, og hvert sæt blev analyseret i duplikere. Tre kontrol gener blev inkluderet i analysen:

ACTB

,

TPT1

, og

UBC

.

ACTB

blev valgt baseret på den omfattende tidligere litteratur peger det som en passende rengøring gen for genekspression analyser i kolon prøver [27] – [29].

UBC

og

TPT1

blev udvalgt på grundlag af den høje stabilitet af deres ekspressionsniveauerne på tværs af alle prøver i vores array-data (Tal S1 og S2). Interessant, de havde også tidligere været postuleret som potentielt egnede husholdning gener for genekspression assays i kolon prøver [29].

Multipleksede RT-qPCRs analyser blev udført ved hjælp BioMark Dynamisk Array 96 × 96 Plader (Fluidigm Corporation, San Francisco, CA). Resulterende billeder blev analyseret med Fluidigm Biomark software ved hjælp af standard parametre. Rå qPCR data blev behandlet med HTqPCR pakken v1.10.0 [30]. Før vurderingen af ​​forskellen udtryk mellem forskellige vævstyper, blev udtrykket matrix filtreres efter kvalitet formål.

UBC

blev endeligt valgt som husholdning kontrol baseret på stabiliteten af ​​dens tærskel cyklus værdier (Figur S2). Mann-Whitney tests blev anvendt til at sammenligne ekspressionsniveauer mellem kræft-frie og tilstødende normale prøver og mellem kræft-fri og tumorprøver. Hvert sæt af primere blev analyseret selvstændigt, og det sæt af primere, der viste de højeste signifikante resultater i analysen af ​​forskellen udtryk blev valgt som repræsentant

Identifikation af serum biomarkører -. Proof of concept til screening gyldighed

for at teste den potentielle værdi for tidlig påvisning, blev de mest lovende kandidater fra den biologiske validering analyseret i serumprøver i en serie på 80 kolon kræfttilfælde, 23 patienter med adenom og 77 kræft-fri kontrol, alle testet i to eksemplarer at øge præcisionen af ​​eksperimentet. Ti-milliliter prøver af perifert venøst ​​blod blev indsamlet fra tyktarmskræft tilfælde, patienter med adenomer og kontroller. Efter centrifuge i 15 minutter ved 1000 rpm i løbet af 30 minutter efter opsamling blev serum alikvoteret og opbevaret ved -80 ° C. Kommerciel ELISA kits fra Life Sciences Inc og R 0,05, korrigeret Bonferroni). Vi har fokuseret specifikt på over-udtrykte gener, fordi disse forskelle er mere tilbøjelige til at blive detekteret i serum, og derfor mere egnede til anvendelse som diagnostiske biomarkører. Interessant nok blev en bemærkelsesværdig grad af overlap (3.101 probe sæt, ~56%) findes mellem disse to lister med probe sæt, tyder på, at tilstødende normal slimhinde i patienter med kræft allerede havde oplevet betydelige ændringer i genekspression, og stigende betydningen af ​​at bruge cancer-fri slimhinde som reference væv. Globale resultater fra differential udtryk analyse er vist i figur 1b og 1c.

For at prioritere kandidater til diagnostiske biomarkører, blev et sæt filtre anvendes på den indledende sæt af differentielt udtrykte probe sæt. Disse filtre blev primært baseret på statistiske kriterier (dvs. stor fold-skift mellem A /F eller T /F, lave niveauer af udtryk og lav variation i F prøver). Disse filtre gav et endeligt antal af 242 udvalgte probesæt mellem A /F og 443 mellem T /F, svarende til et sæt af 194 og 352 gener, (tabel S2).

Denne første udvælgelse billede en liste af 505 unikke kandidat biomarkører med højsignifikante ekspressionssystemer forskelle mellem tumor og kræft-fri væv. På grund af de tekniske vanskeligheder, der stammer fra valideringen af ​​en så stor mængde af biomarkører, blev yderligere tekniske og biologiske kriterier anvendes til yderligere at indsnævre listen over potentielle kandidater. Dette andet sæt af filtre blev baseret på en vurdering af sammenhæng mellem de forskellige probesets for hvert gen; bekræftelse af vores resultater i selvstændige og offentligt tilgængelige genekspression datasæt; og nul eller lave ekspressionsniveauer af disse gener i blodprøver fra kræft-fri individer. Desuden blev forudgående kendskab og molekylær information for hvert gen indsamlet fra litteraturen og online databaser til at sikre udvælgelsen af ​​de mest pålidelige kandidater (det vil sige protein sekretion, vævsspecificitet, proteinfunktion, tidligere evidens som biomarkør, blandt andre). En liste over de 23 bedste kandidater blev endeligt udvalgt til validering i det næste trin (tabel 2, kolonne 1-2).

Teknisk og biologisk validering

For at sikre pålideligheden af resultaterne fra genekspression arrays, var udvælgelsen af ​​23 biomarkører valideret med en alternativ teknik (RT-qPCR) begge i samme sæt prøver (dvs. teknisk validering), og også i en uafhængig serie med tilsvarende kliniske og epidemiologiske karakteristika (dvs. biologisk validering).

Figur 2 viser tovejs gen- og prøve clustering af RT-qPCR ekspression værdier både for resultaterne af den tekniske (figur 2a) og den biologiske validering (figur 2b). Horisontale akser heatmaps (dvs. kolonner) viser en klar adskillelse af tumorprøver fra tilstødende normale og cancer-fri grupper. Den lodrette akse af gener (dvs. rækker) viste to klynger af gener, en for dem, differentielt udtrykte mellem A /F og en anden for det differentielt udtrykte mellem T /F. Disse resultater stærkt kopiere mønstret udtryk observeret i arrays i opdagelsen fase, styrke den potentielle rolle af disse gener som diagnostiske biomarkører for tyktarmskræft. En formel sammenligning af ekspressionen forskelle mellem prøvetyper for den tekniske og biologiske validering er vist i tabel 2, kolonne 3-4. Selv om kun p-værdier er vist i tabel 2, ekspressionsniveauerne af alle de validerede gener opførte sig ensartet i hele de forskellige faser, som vist i figur S3.

Prøver farvekodede oven på heatmaps baseret på den vævstype (dvs. kræft-fri slimhinde = grøn, tilstødende normale væv fra patienter med tyktarmskræft = blå, tumorvæv = rød)

Proof of concept -. identifikation af serum biomarkører

som en pilot proof-of-concept for at vise deres potentielle nytte som tyktarmskræft tidlige diagnostiske biomarkører, blev et udvalg af 9 gener testet i serum ved hjælp af ELISA-test. Prioriteringen af ​​disse kandidater var baseret på en omfattende litteraturgennemgang og tilgængeligheden af ​​kommercielle ELISA-kit.

Resultater for hvert protein er vist i figur 3. Bemærkelsesværdigt, collagen type X alfa1 (COL10A1) vises meget høje koncentrationer i tyktarmen kræfttilfælde og adenomer i sammenligning med kontroller (p = 3.2e-6 og p = 0,0083, henholdsvis). Serumkoncentrationer af COL10A1 i kontrol, adenomer og tyktarmskræft sager ved scenen er vist i figur S4. Interessant, statistisk fandtes signifikante forskelle, når kontrollen blev sammenlignet med hver enkelt af de forskellige tumor stadier, undtagen fase I, sandsynligvis på grund af den lille stikprøvestørrelse på denne gruppe. Arealet under modtageren opererer karakteristik (ROC) kurve var 0,75 for kræft og 0,76 når adenom og tyktarmskræft blev behandlet samlet (figur 4), som viser potentiale god klassifikation evne. Matrix metalloproteinase-7 (MMP7) viste også en signifikant association men blev ikke yderligere, fordi det var på grund af en underekspression i adenomer i forhold til kontrolgruppen, som repræsenterede den modsatte følelse af differentieret udtryk, vi forsøgte at validere. Ingen kombination af COL10A1 med nogen af ​​de andre proteiner signifikant øget arealet under ROC-kurven (data ikke vist).

A. Receiver Operating karakteristiske kurver for både adenomer og coloncancer sammen (lilla) og tyktarmskræft tilfælde (rød). B. Forskellige markør beskæringspunkter mod følsomhed og specificitet kurver.

Diskussion

CRC screening med fækal okkult blodprøve har vist effekt i randomiserede forsøg. Ikke desto mindre den lave specificitet af testen antyder behovet for mere nøjagtige alternative diagnostiske tests. Sigmoidoskopi, koloskopi og edb Tomography scanning (dvs. virtuel koloskopi) er stærke alternative kandidater, men alle har vigtige begrænsninger, primært vedrørende omkostninger, mulige alvorlige bivirkninger og reduceret deltagelse. Deltagelse er en vigtig faktor for screening effektivitet, og det er også en generel iagttagelse, at screening baseret på fækal okkult blodprøve har lave erhvervsfrekvenser [31] – [33]. Således ville en diagnostisk test baseret på en rutinemæssig blodprøve sandsynligvis være i stand til at nå en højere procentdel af befolkningen, og de offentlige sundhedsmyndigheder ville foretrække en sådan test, hvis effekt og omkostninger svarede til fækal okkult blodprøve. Med disse lokaler i tankerne, startede vi denne undersøgelse for at søge efter diagnostiske biomarkører, der kan påvises i blodet med en enkel og økonomisk overkommelig ELISA-test.

Vores undersøgelse af genekspression i colon væv har bekræftet tidligere observationer, at en stor antal gener er dereguleret i tumor i forhold til tilstødende normale slimhinde. Fra omkring 20.000 gener afhørte i udtrykket array, og efter filtrering af flere restriktive kriterier, har 505 unikke kandidat biomarkører blevet identificeret (tabel S2), med meget markante resultater og høj kapacitet til at skelne mellem parret tumor og tilstødende normale prøver. Et vigtigt element i vores undersøgelse design er inddragelsen af ​​et sæt prøver fra kræft-fri kontrol (n = 50). Dette har gjort det muligt at identificere gener, som ikke viser ekspressionsniveauer forskelle mellem tilstødende normale og tumorvæv fra patienter coloncancer, samt at bekræfte, at overudtrykte gener i tumorer viser ikke høje ekspressionsniveauer i cancer-fri kolon væv, hvilket kan være til hinder deres potentielle anvendelse som biomarkører. Vi har tidligere beskrevet, at genekspression af tilstødende normal colon mucosa hos en patient med cancer allerede er blevet ændret væsentligt i forhold til cancer-fri colon mucosa [34], hvilket forstærker behovet for herunder væv fra kræft-fri individer i projekter til finde diagnose biomarkører for tyktarmskræft.

det store antal ansøgere identificeret i analysen af ​​udtryk data førte os til at prioritere, hvilke der skulle udvælges til yderligere validering. Vi anvendte en kombination af kriterier, som omfattede sammenhæng med andre offentligt tilgængelige datasæt og litteratur; lav eller ingen ekspressionsniveauer i cancer-fri slimhinde eller andre væv; udtryk fremherskende til tyktarmskræft væv; og udvælgelse af sekreterbare proteiner. Da identifikationen af ​​serum proteiner er dyrt og tidskrævende, vi foretog en teknisk og biologisk validering af de bedste kandidater, før du forsøger ELISA tests. Den tekniske validering (dvs. i samme sæt prøver, men med en anden teknik) viste en bemærkelsesværdig reproducerbarhed af ekspression niveauforskelle målt ved RT-qPCR og microarrays for alle testede gener, hvilket således bekræfter, at udtrykket datasæt opnået med Affymetrix HG-U219 mikroarrays var af enestående kvalitet og pålideligt identificeret udtryk forskelle mellem de forskellige vævstyper. forventer derfor, vi, at antallet af falske positive i den resterende liste (ikke valideret) af betydelige differentielt udtrykte gener mellem vævstyper at være lav. Desuden bekræftelse af de tidligere identificerede forskelle i en biologisk uafhængig datasæt fremhæver også gyldigheden af ​​de opnåede resultater med mikroarrays.

Det næste skridt i vores sekventiel valideringsproces forsøgte at identificere i serum de tilsvarende proteiner for vores kandidatgener og vurdere deres potentielle anvendelse til tidlig diagnose. Vi inkluderede også en undergruppe af patienter med adenom, da dette er også et vigtigt mål for CRC-screening. Brug kommercielle ELISA kits, vi kunne vurdere protein niveauer af alle generne prioriterede. Bemærkelsesværdigt, COL10A1 viste relevante nok forskelle mellem kontroller og kolon kræftpatienter (p = 3,2 × 10

-6), der foreslås som en potentiel diagnostisk kandidat. MMP7 viste også nogle forskelle for adenomer (p = 0,0092), men viste en modsat retning af den forventede ene.

Vi har identificeret det protein COL10A1 som, når de opdages ved høje koncentrationer i blodet, kan være tegn på tilstedeværelsen af ​​en neoplastisk læsion i tyktarmen. Dette protein blev valgt efter en sekventiel procedure, hvor vi begyndte at udforske hele genom udtryk data i colon væv. Forhøjede serumniveauer af COL10A1 blev observeret både for adenom og kolon kræftpatienter. Arealet under ROC-kurven var 0,76, hvilket gør COL10A1 som et lovende diagnostisk biomarkør. Den afskæringspunkt på 280 ng /ml opnået 0,63 følsomhed og 0,85 specificitet for coloncancer eller adenom (figur 4). Lignende værdier blev opnået for kræft kun. Et par kræft-fri forsøgspersoner viste høje niveauer af COL10A1 i serum, højere end gennemsnittet for adenom, hvilket indikerer, at andre processer ikke er relateret til kolorektale læsioner kan øge COL10A1 niveauer.

COL10A1

er en kortkædet kollagen hovedsageligt udtrykt af chondrocytter under ossifikation. Defekter i dette protein har været relateret til Schmid-typen metafysale chondrodysplasia [35]. COL10A1 udtrykkes ikke i normale colon epitel, men er en direkte transkriptionel mål på

RUNX2

[36], en transkriptionsfaktor, der udtrykkes i cancerceller, og er blevet relateret til flere cancertyper. Den forhøjede udtryk for

COL10A1

observeret i tumorer kan være en indirekte effekt af regulatoriske ændringer højere niveau forekommer i tumoren. Faktisk har vi observeret en høj korrelation mellem RUNX2 og

COL10A1

udtryk i tumorer (Pearson R = 0,5, resultater ikke vist). Vores udtryk data identificerer også høj korrelation mellem

COL10A1

og andre gener:

SFRP4

,

INHBA

,

TNFSF4 Hoteller, som er involveret i cytokin og Wnt signalering