PLoS ONE: MAGE-A Cancer /Testikel Antigener Inhibit MDM2 ubiquitylering Funktion og fremme øget Niveauer af MDM4

Abstrakt

melanom-antigen A (MAGE-A) proteiner omfatter et strukturelt og biokemisk lignende sub-familie af kræft /testis-antigener, som udtrykkes i mange cancertyper og menes at bidrage aktivt til malignitet. MAGE-A-proteiner er etableret regulatorer af visse cancer-associerede transkriptionsfaktorer, herunder p53, og er aktivatorer af flere ringfinger-afhængige ubiquitin E3 ligaser. Her viser vi, at MAGE-A2 associerer med MDM2, et ubiquitin E3 ligase der medierer ubiquitylering på mere end 20 substrater, herunder hovedsageligt p53, MDM2 selv, og MDM4, en potent p53-hæmmer og MDM2 partner, som er strukturelt relateret til MDM2. Vi finder, at MAGE-A2 interagerer med MDM2 via N-terminale p53-bindende lomme og den RING finger domænet af MDM2, der kræves til homo /hetero-dimerisering og for E2 ligase interaktion. I overensstemmelse med disse data, viser vi, at MAGE-A2 er en potent inhibitor af E3 ubiquitin-ligaseaktivitet af MDM2, men det har ikke nogen signifikant virkning på p53 omsætning medieret af MDM2. Slående, dog øget MAGE-A2 udtryk fører til reducerede ubiquitylering og øgede niveauer af MDM4. Ligeledes nedregulering af endogen MAGE-A udtryk formindsker MDM4 niveauer på en måde, der kan reddes ved proteasomalaktivitet hæmmer, bortezomid, og tilladelser øget MDM2 /MDM4 forening. Disse data antyder, at MAGE-A-proteiner kan: (i) koble ubiquitin-ligasen og nedbrydningsprodukter funktioner MDM2; (Ii) virke som potente inhibitorer af E3-ligase funktion; og (iii) regulerer omsætning på MDM4. Vi finder også en sammenhæng mellem tilstedeværelsen af ​​MAGE-A og øget MDM4 niveauer i primær brystcancer, tyder på, at MAGE-A-afhængig styring af MDM4 niveauer har relevans for kræft klinisk

Henvisning:. Marcar L, Ihrig B, Hourihan J, Bray SE, Quinlan PR, Jordan LB, et al. (2015) MAGE-A Cancer /Testikel Antigener Inhibit MDM2 ubiquitylering Funktion og fremme øget Niveauer af MDM4. PLoS ONE 10 (5): e0127713. doi: 10,1371 /journal.pone.0127713

Academic Redaktør: Chunhong Yan, Georgia Regents University, UNITED STATES

Modtaget 22. januar 2015; Accepteret: 17. april, 2015; Udgivet: 22 maj, 2015

Copyright: © 2015 Marcar et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud numre: 2008NovPR32 og 2001NovPhD07, URL: https://www.breastcancercampaign.org. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

melanom-associerede antigener (MAGE) blev oprindeligt opdaget som cancer-associerede antigener i melanom patienter [1] og er nu kendt for at omfatte en super-familien (der omfatter flere undergrupper) på mere end 60 gener i mennesker [2,3]. MAGE’er inddeles i to grupper, MAGE-I og MAGE-II, baseret på kromosomale placeringer af generne og vævsfordelingen af ​​deres produkter [2,3]. MAGE-I-proteiner (omfattende undergrupper MAGE-A, -B og -C) er medlemmer af den bredere familie af kræft /testis (CT) Antigener, som er fysiologisk udtrykt primært i kimceller, men er udtrykkes afvigende, hovedsagelig gennem epigenetisk omprogrammering, i en lang række af cancere herunder bryst-, ovarie-, lunge- og blære [3,4,5,6]. MAGE-II-proteiner mere bredt udtrykt, og normalt ikke er forbundet med kræft.

Medlemmer af MAGE-A sub-familie show slående strukturelle og funktionelle lighed med hinanden [3]. Angivelse af MAGE-A observeres hovedsageligt i kræftsygdomme, der har erhvervet maligne fænotyper såsom invasiv, eller metastase, og korrelerer med dårlig [3] prognose. Mærkeligt, MAGE-A-gener er ofte co-udtrykkes, med de fleste kræftformer viser tilstedeværelsen af ​​mindst to eller flere af disse antigener. Niveauerne af udtryk kan også varierer enormt og kan dermed påvirke den biologiske skæbne celler, der udtrykker disse proteiner. I overensstemmelse med en cancer-fremmende rolle, MAGE-A ekspression stimulerer cellecyklusprogression, vandringshastighed og invasivitet af dyrkede celler

in vitro

og kan fremme stigninger i tumorstørrelse og antallet og størrelsen af ​​metastatiske foci i dyr modeller [7,8]. Kollektivt, disse data understøtter ideen om, at MAGE-A udtryk kan bidrage til malignitet.

Den normale funktion (er) i MAGE-En familie er stadig ukendt, men voksende tyder disse proteiner modulerer vigtige transkriptionsfaktorer såsom SKIP , p300, p160 (TIF2) androgen receptor ER-alpha, og p53 tumor suppressor [3,7,9,10,11,12,13,14,15]. Gennem interaktion med disse proteiner, MAGE-A (og andre MAGE jeg proteiner) kan regulere transkriptionelle begivenheder ved forskellige mekanismer såsom rekruttering og målretning af histon deacetylase (HDAC) aktivitet SKIP eller p53 [11,13,16], fremme interaktion af androgen receptor med p160 og andre co-aktivator proteiner [14], eller koblingen af ​​co-repressor, KAP1 /TRIM28, til KRAB domænenavn zink finger (KZNF) transkriptionsfaktorer [8,17,18]. Ud over disse effekter, seneste data viser, at en række MAGE proteiner (begge typer I og II) kan fremme ubiquitylering ved at fungere som aktivatorer af RING (virkelig interessant nyt gen) finger-typen E3 ubiquitin ligaser [8,17,19] . For eksempel kan MAGE-G1 stimulere ubiquitin-ligaseaktivitet af NSE1. Tilsvarende kan interaktionen af ​​MAGE-C2 med KAP1 (TRIM28) co-repressorkomplekset protein stimulere KAP1-afhængig omsætning af p53 tumor suppressor uafhængigt af den større p53 regulator, MDM2 [17]. Denne samlende tema af MAGE proteiner som modulatorer af ringfinger ligaser understøttes af den observation, at ni nye MAGE-I bindende partnere identificeret ved TAP-tag /massespektrometri analyse er ringfinger proteiner [17]. Inden MAGE-A-familien, nuværende biokemisk dokumentationen indikerer en høj grad af funktionel redundans, for eksempel i reguleringen af ​​p53-funktion [12,13]. På den anden side, nylige publikationer indikerer, at der kan være en høj grad af specificitet i MAGE /partner interaktioner, i det mindste for nogle partnere [14,15,17].

p53 virker hovedsageligt som en transkriptionsfaktor, eliminerer cancerceller ved at koordinere ændringer i genekspression, som fører til standsning af cellecyklus, senescens eller apoptose [20]. p53 reguleres primært gennem sin interaktion med MDM2, en RING finger-typen ubiquitin E3 ligase. MDM2 og p53 opererer inden for et feedback-loop, hvor p53 stimulerer

MDM2

udtryk, hvilket fører til nedregulering af p53 niveauer ved MDM2. Induktion og aktivering af p53 ved forskellige stress stimuli opnås gennem forskellige men overlappende mekanismer, der hovedsagelig afkoble p53 /MDM2 interaktion [21]. De vigtigste træk ved MDM2-proteinet er: et N-terminalt p53-bindende domæne, hvor N-terminalen af ​​p53 interagerer med en hydrofob lomme på MDM2; nukleare eksport og import-sekvenser, der medierer nucleo-cytoplasmatisk shuttling af både MDM2 og p53; et stærkt sure og stærkt phosphoryleret centrale region, der er afgørende for p53 nedbrydning; og et C-terminalt RING finger, der er nødvendig for både ubiquitylering og nedbrydning af p53. Disse domæner understøtter flere biokemiske funktioner i MDM2 som virker sekventielt og kooperativt at nedregulere p53 niveauer: disse omfatter primært ubiquitylering, nucleo-cytoplasmatisk transport, og målretning af p53 til proteasom for nedbrydning. Derudover kan disse biokemiske funktioner reguleres

uafhængigt

af hinanden. For eksempel, mens multi-site phosphorylering af den sure centrale domæne af MDM2 har ingen påviselig effekt på dets evne til at mediere ubiquitylering af p53, disse ændringer spiller en afgørende rolle i at fremme omsætningen af ​​p53 ved at stimulere sammenslutning af MDM2 med flere komponenter af proteasomet [22,23]. Selv i stand til at mediere interaktion med proteasomet, den præcise mekanisme (r), hvorved MDM2 driver p53 nedbrydning ufuldstændigt forstået.

MDM4 (også kendt som MDMX eller HDMX) er en defekt ubiquitinligase der er strukturelt relateret til MDM2 og hæmmer p53 gennem overlappende mekanismer [24,25]. For det første er en stimulerende partner af MDM2 [26], som selv er reguleret af MDM2-medieret ubiquitylering [27,28,29]. Som med MDM2, p53 binder til MDM4 hovedsagelig gennem en N-terminal hydrofob lomme derved sterisk forhindrer interaktionen af ​​p53 transaktiveringsdomænet (TAD1) med det transkriptionelle maskineri og derved nedregulere p53-medieret transaktivering [30].

p53 funktion går tabt under udviklingen af ​​en høj andel af kræft af forskellige typer gennem mutation af

TP53

gen (kodning p53). I nogle kræftformer dog

TP53

mutation frekvens er lavere, men andre mekanismer, såsom ændret ekspression eller mutation af p53 regulatorer (for eksempel MDM2, MDM4, ARF) menes at eliminere p53-funktion [31]. Vi og andre har vist, at forskellige medlemmer af MAGE-A-familien, som alle viser slående sekvenslighed, virker på lignende måde og er potente inhibitorer af p53-medieret transkription og apoptose [8,12,13]. To af disse undersøgelser viser, at MAGE-A handlinger, i det mindste delvist, ved at binde til kernen (site-specifikke DNA binding) domæne af p53 og regulere sin nedstrøms transskription funktion [12,13]. MAGE-A kan også regulere p53 acetylering (aktivering) gennem HDAC3 rekruttering og interaktion med PML nukleare organer [13,16]. Gennem disse mekanismer MAGE-A kan bibringe resistens over for lægemidler, der virker gennem p53 pathway [13]. Interessant, nogle [17,32], men ikke alle [12,13], undersøgelser tyder på, at MAGE proteiner kan regulere p53 niveauer, for eksempel gennem interaktion med E3 ligaser såsom KAP1 (TRIM28) [17]. Imidlertid har dette problem ikke er blevet løst. I betragtning af den nu etableret rolle MAGE-A-proteiner som regulatorer af RING finger E3 ligaser det er ikke påvist, om disse proteiner kan have indflydelse på den rolle MDM2.

I den foreliggende undersøgelse viser vi, at endogene MAGE -A proteiner og, via ektopisk udtryk, MAGE-A2, associeret med MDM2

uafhængigt

af p53. Denne observation fik os til at udforske samspillet mellem disse to proteiner i større dybde med henblik på at forstå den funktionelle betydning af deres forening. Vores data indikerer, at ud over at regulere p53-funktion direkte, kan MAGE-A selektivt påvirke niveauerne af MDM4 gennem interaktion med MDM2, og støtter idéen, at denne familie af proteiner regulerer p53 funktion gennem flere uafhængige men komplementære mekanistiske hændelser. Vi etablerer også at MAGE-A-proteiner, virker samtidig som stimulatorer af nogle RING finger typen proteiner [17], kan også opføre sig som en potent hæmmer af MDM2 RING finger typen E3 ubiquitinligase.

Materialer og metoder

Cellelinier, transfektioner, og plasmider

U2OS (humane osteosarcom-afledte) celler og H1299 (human lunge carcinom-afledte) celler blev opnået fra Cancer Research UK depot. Cellerne blev testet for p53- og MAGE-A status ved western blotting. Transfektioner blev udført under anvendelse af Lipofectamine reagens (Invitrogen) som instrueret af producenten. Plasmider, der anvendes til ekspression af humane cDNA’er var derivater af pcDNA3 og var som følger (med katalognumre står i parentes): vildtype p53 i pCDNA3 (DWM715), HA-mærket MAGE-A2 i pCDNA3 (DWM1574), human vildtype MDM2 ( under CMV promotor; DWM1127), MDM2-C464A (DWM1214), HA-mærkede (N-terminal) human MDM4 (1318), His

6 tagget ubiquitin (DWM1432). Glutathion-S-transferase (GST) -fusion proteiner blev kodet i derivater af vektoren pGEX-4T. Disse omfattede et sæt tidligere offentliggjorte MDM2 “mini-proteiner”, hvor overlappende domæner af MDM2 er fusioneret til GST [33,34], og var som følger: GST alene (DWM223), GST-MP1 (DWM1074), GST-MP2 (DWM1093 ), GST-MP3 (DWM1076), GST-MP4 (DWM1077).

Antistoffer og Western blot-analyse

SDS-PAGE og western blotting blev udført ved anvendelse af standardbetingelser. Anvendte antistoffer var som følger: 6C1 (pan MAGE-A), og H164 (p21) blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology. DO1 (p53), 4B2 (MDM2) og SMP14 (MDM2) var fra Moravian Biotechnology. CM1 var en slags gave fra professor Sir D. Lane. Anti-MDM4 antistoffer 8C6 og BL1258 blev opnået fra Millipore og fra Bethyl Laboratories hhv. 12CA5 (HA-tag) var fra Cancer Research UK og 20-33 (actin) var fra Sigma-Aldrich. HRP (peberrodperoxidase) -konjugeret kanin anti-mus og gede-anti-kanin-sekundære antistoffer blev købt hos Dako og Bio-Rad, hhv. Proteiner blev påvist ved forøget kemiluminescens i overensstemmelse med producentens anvisninger (Pierce Biotechnology, Inc.).

GST-pull-down Eksperiment

GST-mærket MDM2 fusionsproteiner [33,34] (eller GST alene som kontrol) blev bundet til GSH (glutathion Sepharose 4B) perler (Amersham) og efterfølgende inkuberet med

35S-mærket MAGE-A2 (udarbejdet af

in vitro

transskription /oversat TNT T7 System (Promega )). Efter ekstensivt vask af perlerne, blev immobiliserede proteiner elueres i 2 X SDS prøve buffer og påvises ved western blotting.

In vitro

pull-down-analyser ved hjælp biotinylerede peptider

Biotinyleret peptider blev købt fra Mimotopes og generelt omfattede følgende format: “Biotin-SGSG-peptid-amid”. Peptider der repræsenterer de N- og C-terminalerne var henholdsvis: “Amine-peptid-GSG-biocytin amid” og “Biotin-SGSG-peptid-syre”. Streptavidin-agaroseperler (Sigma) blev vasket i PBS indeholdende 0,1% (v /v) Tween-20 før tilsætning af 10 ug biotinyleret peptid. Kugler blev inkuberet natten over ved 4 ° C og efterfølgende vasket med den samme buffer.

35S-mærket MAGE-A2 (fremstillet ved

in vitro

transkription /translation TNT T7 System (Promega)) blev tilsat til perlerne og inkuberet i 2 timer ved 4 ° C. Perlerne blev efterfølgende vasket 4 gange i PBS /Tween-20 og resuspenderet i SDS-PAGE-prøvebuffer. Co-udfældning protein blev opløst ved SDS-PAGE og påvist ved fluorografi.

Immunopræcipitation

Celler blev lyseret på is i 30 minutter i IP-buffer (50 mM Tris-HCI [pH 7,5], 150 mM NaCl, 1% (v /v) NP-40, 2 mM EDTA og protease-inhibitor (Roche)), centrifugeres i 10 minutter ved 13.000 xg og supernatanten fjernet til analyse. Lysatet blev derpå præ-clearet med 50 pi opslæmning af protein G-perler (Sigma) i 30 minutter ved 4 ° C, centrifugeret i 3 min ved 2000 x g, og perlerne blev kasseret. I alt 1-2 ug protein blev inkuberet med 2 ug /ml antistof natten over ved 4 ° C og immunopræcipiteret den følgende dag med 50 pi opslæmning af protein G-perler (Sigma) i 2 timer ved 4 ° C. Bundfald blev vasket tre gange i 5 minutter i IP-buffer ved 4 ° C før tilsætning af SDS-gel-ladningsbuffer og immunopræcipiterede proteiner blev påvist ved western blot.

ubiquitylering assay

ubiquitylering assay afhængig af transfektion af celler med et plasmid, der koder His-mærket ubiquitin efterfulgt af separation og oprensning af ubiquitylated proteiner fra celleekstrakter under anvendelse nikkel-agarose-perler. Dette assay er blevet beskrevet i betydelige detaljer andetsteds [35]. De oprensede ubiquitylated proteiner blev analyseret ved western blotting

Gene lyddæmpning hjælp siRNA

MAGE-A udtryk blev stille ved hjælp af to uafhængige, tidligere publicerede siRNA oligonukleotider [12,13]:. MAGE-A siRNA (1) [13] og MAGE-A siRNA (2) [12] er målrettet mod to forskellige sekvenser fælles for hver af de Mage-A familiemedlemmer bortset Mage-A10 og er som følger:

MAGE- En Oligo 1 [13] 5′-AACCAGCUAUGUGAAAGUC-3 ‘

MAGE-A Oligo 2 [12] 5′-UCACAAAGGCAGAAAUGCU-3′

Ikke-silencing Oligo (kontrol) 5′ CAGUCGCGUUUGCGACUGG-3 ‘

siRNA oligonukleotider blev fremstillet af Dharmacon og blev introduceret i celler ved revers transfektion under anvendelse RNAiMAX (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Celler blev høstet 48 timer efter transfektion.

Patienter, Samtykke og Immunhistokemi (IHC)

anvendt i denne undersøgelse kohorte (TMA24) er blevet rapporteret tidligere [36,37] og består primært, tidligere ubehandlet brystkræft fra 225 umarkeret præ- og postmenopausale kvinder (i alderen 28-89; median 62 år) behandlet på Tayside universitetshospitaler Skotland fra 1997 til 2002. Erhvervelse af prøver og forberedelsen af ​​tumor microarray (TMA) har blevet beskrevet andetsteds [36,37]. Undersøgelsen fik etisk godkendelse fra både Tayside Forskning og etiske komité (Ref. 07 /S1402 /90) og Tayside Tissue Bank Udvalg (Ref. TR000236). Generic, skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver patient før overtagelsen væv og før operation blev udført, en proces, der er godkendt af Research etiske komité, til brug af overskydende væv ikke nødvendig til diagnostiske formål og for venøs blodprøve, der skal bruges i forskning .

Sektioner fra TMA blok (nominelt 4 mikrometer tyk) blev fremstillet og behandlet som tidligere [37] beskrevet. Antistoffer specifikke for proteiner, der anvendes i undersøgelsen var: 6C1 (pan-MAGE-A); og BL1258 (MDM4).

TMA nettet til MAGE-A og MDM4 blev udført af en specialist bryst patolog (LBJ) ved hjælp af Quickscore metoden [38] for intensiteten og andelen af ​​celler farves med det passende antistof .

Resultater

MAGE-A-proteiner interagerer med MDM2 i dyrkede celler

for at bestemme om MAGE-A-proteiner interagerer direkte med MDM2 uafhængigt af p53, co-immunoudfældning af endogent udtrykte proteiner blev udført under anvendelse H1299 celler (som ikke udtrykker p53). Som kontrol blev forsøgene også udføres i vildtype p53-udtrykkende U2OS celler, som vi og andre tidligere har brugt i MAGE-A /p53 interaktionsundersøgelser [12,13,16]; begge disse linjer udtrykker flere detekterbare medlemmer af MAGE-A-familien (S1 Fig). I overensstemmelse med denne observation den pan-MAGE-A antistof, 6C1, opdaget adskillige nært migrerende bånd svarende til forskellige MAGE-A familiemedlemmer i celleekstrakterne (figur 1A, lavere panel). Immunopræcipitation af MAGE-A under anvendelse 6C1 resulterede i co-immunfældning af MDM2 (Fig 1A, øvre panel). I en gensidig analyse blev MAGE-A-proteiner fundet at være til stede i immunopræcipitater af MDM2 fra de samme ekstrakter anvendelse af antistofferne, 4B2 og SMP14 (nederste panel). Co-immunopræcipitation blev også udført ved hjælp U2OS celler (som udtrykker vildtype p53) med lignende resultater. De langsommere migrerende MDM2 proteiner ses at co-immunpræcipitere med MAGE-A i begge cellelinier antyder, at MAGE-A-proteiner fortrinsvis kan vekselvirke med en posttranslationelt modificeret form (er) af MDM2. Tilsvarende kunne langsommere migrerende bånd af MAGE-A tyder på, at modificerede MAGE-A-proteiner fortrinsvis forbinder med MDM2 eller alternativt at MDM2 associates fortrinsvis med specifikke MAGE-A familiemedlemmer. Vi har ikke definitive svar på disse punkter på nuværende tidspunkt. MAGE-A-proteiner var ikke påviselige i MDM4 immunpræcipitater eller, i hinanden, gjorde MDM4 co-immunpræcipitat, når anvendtes anti-MAGE-A antistof (data ikke vist). Disse data lig med specificitet med MAGE-A /MDM2 interaktion. Sammenfattende indikerer disse data, at MDM2 og MAGE-A associeret i et cellulært sammenhæng.

(A) H1299 celler (venstre hånd paneler) eller U2OS celler (højre hånd paneler) blev lyseret og immunpræcipitation blev udført under anvendelse antistoffer mod MAGE-a (6C1), MDM2 (SMP14 plus 4B2) eller, som kontrol, en ikke-specifik muse IgG. Blottene blev probet for tilstedeværelse af MDM2 (toppaneler) eller MAGE-A (bundpaneler). Positionerne af antistof-tunge kæder (HC) og lette kæder (LC) er angivet i de nedre paneler. (B) GST pull-down assays blev udført, hvor

35S-radiomærket MAGE-A2 blev indfanget på glutathion Sepharose 4B perler ved anvendelse GST bundet til fuld længde MDM2 eller fire miniproteiner (betegnet MP1, -2, -3 og -4), der repræsenterer overlappende regioner af MDM2 [33,34]. Co-udfældning MAGE-A2 blev påvist ved SDS-PAGE efterfulgt af fluorografi (øvre panel). Det midterste panel viser tilstedeværelsen af ​​GST-MDM2 proteiner efter binding til glutathionperler. Bundpanelet viser skematisk fuld længde MDM2 sammen med de overlappende regioner omfattet inden for mini-proteiner. Dataene er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

MAGE-A-proteiner interagerer med MDM2

in vitro

For at bestemme om MDM2 og MAGE-A interagerer

in vitro

blev GST pull-down-forsøg udført ved anvendelse af en række GST-fusionsproteiner, der omfatter GST-humane fuldlængde MDM2 sammen med en tidligere publiceret serie af GST-fusionsproteiner i forbindelse med overlappende domæner af MDM2 [33, 34]. De data (Fig 1B) bekræfter, at

35S-mærket

in vitro

-translated MAGE-A2 interagerer med MDM2 og ikke med GST del af fusionsproteinet i pull-down analyse. (MAGE-A2 blev valgt til denne analyse, fordi det er en velkarakteriseret regulator af p53 pathway, der udfører lige godt sammenlignet med andre MAGE-A-proteiner (-A1 og -A6) i deres evne til at blokere p53-funktion [12,13 ].) dataene viser også, at MAGE-A2 interagerer kraftigt med de N-terminale 110 aminosyrer af MDM2 og den C-terminale region omfattende aminosyrerne 279-491. Der er en svag interaktion med MDM2 aminosyrer 108-207 men meget lidt sammen med aminosyrer 203-282 primært omfatter den vigtige sure domæne.

At udforske yderligere site (s) for interaktion, evne til MDM2 aminosyresekvenser til at co-præcipitatet

35S-mærkede

in vitro

-translated MAGE-A2 blev målt i pepscan assays. Disse assays anvendes en respektiv serie af 15-mer biotyinylated peptider bundet til streptavidin-beads, hvert peptid overlapper med den næste i serie med 5 eller flere aminosyrer, og som omfatter henholdsvis hele den menneskelige MDM2 aminosyresekvens (S2 Fig). Vi har tidligere brugt en lignende tilgang til at bestemme de steder for interaktion af MAGE-A2 i p53 [12]. Data fra denne analyse identificerer flere peptider som interagerer med MAGE-A2 (fig 2A og opsummeret i figur 2B). Der er to kraftigt vekselvirkende peptider repræsenterer N-terminale aminosyrer (51-65 og især 91-105) og tre peptider, der repræsenterer sekvenser i C-terminalen af ​​MDM2 (451-465, 461-475 og 481-491). Dataene fremhæver også svagere interaktioner ved peptider svarende til aminosyrer 151-165 og 171-185, som indeholder henholdsvis de to etablerede nukleare lokalisering sekvenser i MDM2. Svage men påviselige interaktioner blev observeret ved 191-205, 291-305, og 311-325. Slående, er disse data i fremragende aftale med GST pull-down eksperimenter (figur 1B). (De fem store interagerende peptider i N- og C-terminale regioner af MDM2 er vist på linje med de tilsvarende sekvenser i MDM4 i S3 Fig. Disse justeringer fremhæve en række væsentlige forskelle i aminosyresekvenser i mindst fire af de peptider, især peptid svarende til aminosyrerne 91-105 af MDM2 som viste den største grad af interaktion (figur 2A). Disse forskelle i sekvensen kan forklare, hvorfor MDM4 kunne ikke være co-immunpræcipiteret med anti-MAGE-A antistof (fig 1) .)

(a) Pepscans assays (pull-down eksperimenter) blev udført, hvor en serie af 15-mer biotinylerede peptider (nummereret 1-49) overlappende med 5 eller flere aminosyrer og repræsenterer hele MDM2 amino -sekvens blev koblet til streptavidin-sepharose-perler og bruges til at indfange

35S-mærkede in vitro-translaterede MAGE-A2. Co-udfældning MAGE-A2 blev påvist ved SDS-PAGE efterfulgt af fluorografi. Styringen pull-down (nederste venstre panel) blev et peptid, der repræsenterer BoxIV /V-regionen af ​​p53, som vi tidligere fastsatte binder meget tæt til MAGE-A2 [12]. (B) Skematisk viser regioner repræsenteret ved de interagerende peptider i pull-down assay. Stærke og svage bindingssteder er angivet i forbindelse med vigtige funktionelle domæner inden for MDM2-proteinet. Dataene er repræsentative for tre uafhængige forsøg. (C) Modellen viser en dimer af MDM2 ring fingre, baseret på den offentliggjorte 3D-struktur (Protein Data Bank deponeringsnummer: 2HDP). De to identiske underenheder i dimeren er repræsenteret i grå og lyseblå hhv. Billedet til højre blev opnået ved at dreje 3D-struktur ved ca. 90 ° til højre i det vandrette plan. Placeringen af ​​MAGE-A2-bindende peptider er vist på en underenhed: aminosyrerne 456-470 er repræsenteret i rødt, mens aminosyrerne 486-491 er vist i lys orange

MDM2 C-terminal. peptider, som MAGE-A2 binder er beliggende inden for RING finger domænet som er afgørende for homo-dimerisering og hetero-dimerisering med MDM4. Denne region spiller også en afgørende rolle i interaktion med, og i mediering overførsel af ubiquitin fra, E2 ligaser til substrater [39,40,41,42,43]. Desuden, når det ses i sammenhæng med 3D-strukturen af ​​MDM2 RING, ligge disse peptidsekvenser sammenstillet på overfladen af ​​den ring, der er blevet foreslået at mediere kontakt med E2 ligase, UbcH5 ([39,40,42], Fig 2C). Derudover de indeholder adskillige aminosyrer, der er blevet påvist ved mutagenese analyse for at spille en afgørende rolle i MDM2-afhængig p53 ubiquitylering og auto-ubiquitylering [39,40,41,42,43]. Bindingen af ​​MAGE-A2 til denne region tyder på, at det kunne påvirke MDM2-afhængig ubiquitylering, eventuelt i en inhiberende måde.

MAGE-A2 interagerer med N-terminalen af ​​MDM2

in vitro

på en måde svarende til p53

Yderligere undersøgelse af sammenslutningen af ​​MAGE-A2 med N-terminalen af ​​MDM2 viste, at de to samvirkende peptider udgør henholdsvis hver side af den hydrofobe grove der er ansvarlig for at mediere interaktion med det N-terminale domæne af p53. Positionerne af disse peptider inden for krystalstrukturen af ​​MDM2 N-terminale region [44] er fremhævet med rødt og magenta henholdsvis i fig 3A. Aminosyrer i begge disse regioner er påkrævet for p53 binding [44] tyder på, enten at MAGE-A2 kan interagere med MDM2 på en måde svarende til den i p53, eller at den kan påvirke p53 /MDM2 interaktion. For at bestemme om MAGE-A2 binder til N-terminalen af ​​MDM2 i et cellulært sammenhæng blev “MP1” MDM2 mini-protein (der omfatter aminosyre 1-110 af MDM2) udtrykkes som en fusion med grønt fluorescerende protein (GFP, Fig 3B) sammen med MAGE-A2 i H1299-celler. Som en positiv kontrol blev p53 udtrykt i stedet for GFP-MP1. Co-immunoprecipitation analyse (Fig 3C) bekræftede, at både MAGE-A2 og p53 kontrol var i stand til at associere med GFP-MP1 (MDM2) i de dyrkede celler. Ingen sammenhæng blev observeret, når GFP mangler MP1 forlængelsen blev anvendt.

(A) Strukturen af ​​den N-terminale ende (p53-bindende domæne) af MDM2 (1YCR), der viser positionerne af MAGE-A2-bindende peptider 51 -65 (rød) og 91-105 (magenta). Rygraden er vist i grøn. Placeringerne af aminosyrerne i flankerne af hver af disse peptider er vist. (B) Skematisk viser strukturen af ​​GST-MDM2 mini-protein, MP1, anvendt i dette eksperiment. En version, hvor GST erstattes af GFP og blev anvendt til dyrket celle ekspression og immunpræcipitationsanalyse. (C) Co-immunfældning blev udført efter ekspression af GFP-MP1 (eller GFP alene som kontrol) i H1299-celler sammen med MAGE-A2 eller p53 (som positiv kontrol). (D) GST pull-down assays blev udført, hvor

35S-radiomærket MAGE-A2, eller

35S-radiomærket p53 som kontrol blev indfanget på glutathion Sepharose 4B perler ved anvendelse GST bundet til MDM2 mini-protein, MP1, der omfatter aminosyrerne 1-110 herunder hydrofobe p53-bindende kløft. Associeringen af ​​MAGE-A2 eller p53 blev målt i nærværelse af stigende koncentrationer af Nutlin-3a. Det co-udfældning MAGE-A2 og p53 proteiner blev påvist ved SDS-PAGE efterfulgt af fluorografi. Bemærk, at

in vitro

transskription /translation af p53 giver anledning til to polypeptider. (E) Kvantificering af pull-down eksperiment efter densitometri. I alle tilfælde dataene er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg.

For at teste ideen om, at p53 og MAGE-A2 binder til MDM2 på en tilsvarende måde blev GST pull-down-forsøg udført

in vitro

at afgøre, om kompetitiv inhibitor, Nutlin-3a, hvilket efterligner p53 og binder tæt inden for den hydrofobe rille i MDM2 der udgør p53 bindingsstedet, kunne blokere interaktionen af ​​MAGE-A2 med MDM2 [45] . Dataene viser, at stigende koncentrationer af Nutlin-3a faktisk hindrer MAGE-A2 fra binding til N-terminalen af ​​MDM2 (fig 3D og 3E). Interaktionen af ​​p53 med MDM2, der blev målt i det samme forsøg som en kontrol blev også gradvist inhiberes ved stigende koncentrationer af Nutlin-3a (fig 3D og 3E). IC

50 værdier for dissociation af p53 og MAGE-A2 henholdsvis fra MDM2 var 18 uM og 10 uM hvilket indikerer, at p53 binder til denne region forholdsvis bedre end MAGE-A2. Mærkeligt, højere niveauer af Nutlin-3a faktisk vendt hæmning og stimuleret binding af MAGE-A2 til MDM2, en effekt, der ikke forekomme med p53. En mulig forklaring på denne effekt er, at forudgående binding af p53 (eller en p53 analog) kan påvirke efterfølgende binding af MAGE-A2.

MAGE-A2 blokke MDM2-medieret ubiquitylering i dyrkede celler, men påvirker ikke p53 omsætning

For at bestemme om faktisk MAGE-A-proteiner kan fungere som MDM2 regulatorer, blev anvendt en etableret cellekultur-baserede ubiquitylering assay [35], hvori H1299-celler blev co-transficeret med plasmider, der udtrykker vildtype humant p53 , MDM2, His-mærket ubiquitin, og stigende mængder af MAGE-A2. Ved 36 timer efter transfektion blev cellerne lyseret i 6 M guanidinium-buffer, betingelser, der forhindrer deubiquitylation af proteiner og afbryder enhver ikke-kovalente protein-protein-interaktioner. His-tagged ubiquitylated proteiner blev oprenset ved affinitetskromatografi under anvendelse af Ni

2 + -agarose perler, så efterfølgende elueret og analyseret ved Western blotting med anti-p53-antistof, DO-1. Dataene (figur 4A, øvre panel) bekræftede, at MDM2 kunne ubiquitylate p53 i dette assay og, vigtigere, reducere p53-niveauer. Især blev p53 ikke ubiquitylated af MAGE-A2 alene (sammenlign bane 1, 2 og 3).