PLoS ONE: Digoxin Undertrykker Tumor Malignitet gennem inhibiterende Flere Src-Related signalveje i ikke-småcellet lungekræft

Abstrakte

Ikke-småcellet lungekræft er den fremherskende form for lungekræft, hvilket resulterer i høj dødelighed på verdensplan. Digoxin, en hjerteglycosid, er for nylig blevet foreslået at være en hidtil ukendt kemoterapeutisk middel. Src er et onkogen, der spiller en vigtig rolle i cancer progression og er derfor et potentielt mål for cancerterapi. Her har vi undersøgt, om digoxin kunne undertrykke lungekræft progression gennem inhibering af Src-aktivitet. Virkningerne af digoxin på lungekræft cellefunktioner blev undersøgt ved hjælp af koloni dannelse, migration og invasion assays. Western blotting og qPCR assays blev anvendt til analyse af mRNA og protein ekspressionsniveauer af Src og dens downstream proteiner, og en celleviabilitetstest blev anvendt til måling cellulær cytotoksicitet effekter. Resultaterne af cellefunktion assays viste, at digoxin inhiberede proliferation, invasion, migration og kolonidannelse af A549 lungecancerceller. Lignende virkninger af digoxin blev også observeret i andre lungekræft cellelinier. Endvidere fandt vi, at digoxin undertrykte signifikant Src-aktivitet og dens proteinekspression i en dosis- og tidsafhængig måde samt nedsat EGFR og STAT3 aktivitet. Vore data antyder, at digoxin er en potentiel anticancermiddel, der kan undertrykke lungekræft progression gennem inhibering Src og aktiviteten af ​​beslægtede proteiner

Henvisning:. Lin SY, Chang HH, Lai YH, Lin CH, Chen MH, Chang GC, et al. (2015) Digoxin Undertrykker Tumor Malignitet gennem inhibiterende Flere Src-Related signalveje i ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 10 (5): e0123305. doi: 10,1371 /journal.pone.0123305

Academic Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, UNITED STATES

Modtaget: November 7, 2014 Accepteret: 3 marts 2015; Udgivet: 8. maj 2015

Copyright: © 2015 Lin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Ministeriet for Videnskab og Teknologi, Taiwan, ROC (NSC 101-2325-B-005-001, NSC 102-2325-B-005-001, og MEST 103-2314-B-005-001-MY3) og Taichung Veterans General Hospital og National Chung-Hsing University (TCVGH -NCHU-1037605), Taiwan. Igennem en yderligere finansiering kom fra Undervisningsministeriet, Taiwan, R.O.C. under ATU planen. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) er den fremherskende form for lungekræft og den hyppigste årsag til kræftdødsfald i verden [1]. Den lave overlevelsesrate af lungecancerpatienter skyldes tumor modstand på adjuverende kemoterapi og metastase [2]. Metastase af cancerceller fra primære tumorer er en multi-trins proces, der forekommer gennem blodkar eller lymfekar. Til dato er der ingen effektiv behandling til at hæmme eller kontrollere disse metastatiske processer.

Oncogene afhængighed bestemmer passende behandling af kræft med målrettede behandlinger. NSCLCs har mange driver mutationer, herunder i EGFR, HER2, KRAS, BRAF, PIK3CA, Akt1, MEK1, ROS1, og ALK [3]. Disse driver mutationer påvirker tumor følsomhed over for behandlinger mod kræft. EGFR mutationer eksemplificere den terapeutiske relevans af molekylære klynger. Kliniske og biologiske data viser udførligt, at EGFR-mutationer kan forudsige effekten af ​​EGFR-hæmmere, med svarprocenter højere end 70% og forlænget progressionsfri overlevelse observeret i flere studier [4,5]. Men disse inhibitorer, f.eks Irresa og Tarceva, er i sidste ende begrænset af fremkomsten af ​​lægemiddel-resistente mutationer og andre formodede molekylære mekanismer [6,7]. Således identificerer nye forbindelser, der er målrettet tumor progression, herunder vækst og metastase, er et spørgsmål af stor presserende kræftbehandling forskning.

onkogen Src spiller en vigtig rolle i cancer progression og forårsager dårlig prognose for patienter med et række humane cancere [8,9]. Src aktivering, detekteres ved en stigning i tyrosinkinaseaktivitet, er blevet identificeret i en række forskellige cancere, herunder NSCLC [10,11]. Src medierer mange signalveje afgørende for styringen af ​​celletransformation og homeostase [12]. I tumorceller, associering af Src med unormale receptortyrosinkinaser forøger tyrosinkinaseaktiviteten af ​​Src, for derved at aktivere pro-overlevelse veje gennem PI3K /AKT, den angiogene pathway gennem signaltransducer og aktivator for transkription 3 (STAT3), spredning pathway gennem MEK /ERK, og invasion gennem FAK /paxillin /p130CAS [13]. Desuden har Src blevet rapporteret at interagere med EGFR; disse proteiner phosphorylerer hinanden, og cellulær Src og EGFR samarbejder i kræft progression. F.eks Src medierer phosphorylering af EGFR Tyr845 at regulere overlevelse pathways [14,15]. Mutationer i EGFR og dens relaterede familiemedlemmer føre til funktionelle abnormiteter og, som følge heraf forbedret Src aktivering [16]. Desuden Src kinaseinhibitorer påvirke nedstrøms signalering kaskade af Src og inhiberingen af ​​EGFR-aktivitet [17]. Prækliniske undersøgelser med farmakologiske Src inhibitorer (dasatinib, saracatinib og bosutinib) har fremlagt dokumentation, som understøtter en rolle for Src som terapeutisk target i lungekræft [18,19].

Hjerteglykosider er en stor familie af kemiske forbindelser, der findes som sekundære metabolitter i flere planter og hos nogle dyr. Digoxin, en af ​​de velkendte hjerteglykosider, er blevet godkendt af regulerende myndigheder og er meget udbredt i behandlingen af ​​hjertesvigt. Dens kardiale effekter formidles gennem hæmning af Na + /K + ATPase, hvilket fører til øget intracellulære calciumkoncentrationer og forøger hjertets sammentrækningsevne [20]. For nylig har flere undersøgelser rapporteret, at hjerteglykosider selektivt hæmme proliferation og inducere apoptose og autofagi i kræftceller, men ikke normale celler [21,22]. Disse resultater antydede også, at hjerteglykosid lægemidler kunne have anvendelighed i anticancerterapi. Imidlertid anticancer effekter og molekylære mekanismer af hjerteglykosider i lungecancerceller er stadig ukendte. I tidligere, upublicerede data, vi identificerede digoxin fra et lille sæt af naturlige forbindelser som en potentiel kandidat til at reducere Src-aktivitet ved hjælp af en ELISA-metode. I denne rapport, vi yderligere afslører ny mekanisme af digoxin hæmme NSCLC malignitet, som kan være gennem flere Src-baserede signalveje.

Materialer og metoder

Cell kultur og narkotikabehandling

De humane lunge adenocarcinom cellelinjer, A549 (ATCC CCL-185), H3255 (ATCC CRL-2882), H1975 (ATCC CRL-5908), PC9 og PC9 /gef [20] blev dyrket ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2. Celler blev opretholdt i RPMI 1640 (GIBCO BRL, Grand Island, NY, USA) med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (GIBCO BRL) og 1% penicillin og streptomycin (GIBCO BRL). Digoxin blev indkøbt fra Sigma-Aldrich Chemical Company (St. Louis, MO, USA.) Og fremstillet i en koncentration på 100 mM i dimethylsulfoxid (DMSO) som en stamopløsning. Arbejdsgruppen opløsning blev frisk fremstillet ved fortynding med medier til de ønskede koncentrationer. Kontrollen køretøjet var 0,1% DMSO.

transfektion

A549-celler blev podet i 6 cm skåle på 5 × 10

5 celler /skål eller i 96 brønde på 5 × 10

3 celler /brønd og transficeret med pEGFP-N3-Src Y527F eller pEGFP-N3 tom vektor (Clontech, Mountair View, CA, USA) under anvendelse af Lipofectamine reagens (Invitrogen) ifølge producentens protokol.

Western blot analyse

Western blot-analyse blev udført som tidligere [21] beskrevne. De primære antistoffer anvendt til Western blot-analyser indeholdt anti-phospho-Src (Tyr418) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), anti-phospho-FAK (Tyr576) (Invitrogen), anti-FAK (Invitrogen), anti-GAPDH ( Invitrogen), anti-phospho-EGFR (Tyr1068) (Cell Signaling, Beverly, MA, USA), anti-phospho-STAT3 (Tyr705) (Cell Signaling), anti-phospho-PI3K (Tyr458) (Cell Signaling), anti- AKT (Cell Signaling), anti-phospho-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185) (Cell Signaling), anti-SAPK /JNK (Cell Signaling), anti-phospho-paxillin (Tyr118) (Cell Signaling), anti phosphor-p130Cas (Tyr410) (Cell Signaling), anti-EGFR (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), anti-STAT3 (Santa Cruz Biotechnology), anti-PI3K (Santa Cruz Biotechnology), anti-phospho-MEK1 /2 ( Ser218 /Ser222) (Santa Cruz Biotechnology), anti-MEK (Santa Cruz Biotechnology), anti-phospho-ERK (Tyr204) (Santa Cruz Biotechnology), anti-ERK2 (Santa Cruz Biotechnology), anti-paxillin (Santa Cruz Biotechnology) , anti-p130 Cas (Santa Cruz Biotechnology), anti-phospho-AKT (Ser473) (Millipore, Billerica, MA, USA)

Real-time revers transkription PCR

Src, EGFR blev STAT3, og FAK mRNA-niveauer detekteret med SYBR Green real-time RT-PCR på en ABI Prism 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster, CA, USA). TATA-box-bindende protein (TBP) blev anvendt som en intern kontrol (GenBank X54993). Alle oplysninger om de empiriske procedurer og beregninger er tidligere [21] beskrevet. Følgende primere blev anvendt: Src fremad, 5′-GAGGCCCAGGTCATGAAGAA-3 ‘; Src omvendt, 5’-CCCTTGAGAAAGTCCAGCAAA-3 ‘; EGFR fremad, 5’-CTGGCAGCCAGGAACGTACT-3 ‘; EGFR omvendt, 5’-GCCATCCACTTGATAGGCACTT-3 ‘; STAT3 fremad, 5’-CCCTTTGGAACGAAGGGTACA-3 ‘; STAT3 omvendt, 5’-AAGTGACGCCTCCTTCTTTGC-3 ‘; Fak fremad, 5’GAGAGCTGAGGTCATTTTTGCA -3 « FAK omvendt, 5’GCAGCAATGTCCCTGTGTACA -3 « TBP fremad, 5’-CACGAACCACGGGACTGATT-3 ‘; og, TBP omvendt, 5’-TTT TCTTGCTGCCAGTCTGGAC- 3 ‘. Alle eksperimenter blev udført tredobbelt.

Cellelevedygtighed assay

PrestoBlue cellelevedygtighed reagens (Invitrogen, USA) blev anvendt til at evaluere celleoverlevelse efter digoxin behandling ifølge fabrikantens protokol. OD-aflæsninger målt ved 570/600 nm ved en Victor

3 spektrofotometer (Perkin-Elmer, Boston, MA, USA) blev registreret efter tilsætning af reagens og inkubation. Alle prøver blev testet tredobbelt.

Colony dannelse assay

De detaljerede procedurer for kolonidannelse assay blev beskrevet tidligere [22]. Kort fortalt, for forankringsafhængige vækst assay 500 celler blev resuspenderet i RPMI og podet i seks-brønds plader. Efter 10 dage blev cellerne vasket og fikseret med 3,7% paraformaldehyd. Derefter blev cellerne farvet med 0,05% krystalviolet. I modsætning til forankringsuafhængig vækst assay blev de seks-brønds plader belagt med 0,7% LMP agarose i RPMI medium med 10% FBS. 1000 celler blev podet i 0,35% LMP agarose /RPMI medium med 10% FBS. Efter størkning blev cellerne behandlet med digoxin i 2 uger. Pladerne blev farvet med 0,5 mg /ml p-iodonitrotetrazolium violet. Kolonier med en diameter på over 1 mm, blev talt. Tredobbelte prøver blev anvendt i eksperimentet.

invasion og migration assays

Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af digoxin i 24 timer og udsået i transwell kamre (8 um porestørrelse, 6,5 mm diameter Corning Costar Corporation, MA, USA), der var eller ikke var belagt med Matrigel (R 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Fremme af NSCLC celledød ved digoxin

Digoxin, et hjerteglykosid, er blevet rapporteret. at have talrige anticancer effekter [24,25]. For at bestemme om digoxin havde lignende cytotoksiske virkninger i forskellige lungecancer-cellelinjer, fem cellelinier, A549, H3255, H1975, PC9 og PC9 /gef, blev behandlet med 0,01, 0,05, 0,1, 0,5 og 1 uM af digoxin til 24-96 h. PC9 celler, der udtrykker en mutant EGFR med en deletion i exon 19 er en gefitinib-sensitive NSCLC cellelinie. PC9 /GEF celler blev udvalgt fra forældrenes PC9 celler, der var løbende blevet udsat for stigende koncentrationer af gefitinib [23]. Resultaterne viste, at cellelevedygtigheden blev påvirket på en dosis- og tidsafhængig måde (Fig 1A-1E). De største effekter blev noteret i A549-celler (IC

50 = 0,048, 0,036, 0,030 og 0,029 pM til 24, 48, 72 og 96 h, henholdsvis), og den anden største effekter blev noteret i H3255 celler (IC

50 = 0,104, 0,107, 0,070 og 0,057 pM i 24, 48, 72 og 96 timer, henholdsvis). Efter 72 timers udsættelse for stoffet, IC

50 værdier for digoxin i PC-9 og PC-9-IR-celler var 0,0917 og 0,101 pM, henholdsvis.

Fem lunge kræft cellelinjer, ( a) A549, (b) H3255, (c) H1975, (d) PC9 og (e) PC9 /gef, blev behandlet med 6 forskellige doser (0, 0,01, 0,05, 0,1, 1 og 5 um) af digoxin på forskellige tidspunkter (0, 24, 48, 72 og 96 h), og cellelevedygtighed blev målt under anvendelse af PrestoBlue cellelevedygtighed reagens efter behandlingen. Kvantitative data er præsenteret som middelværdi ± SD (n = 3); * P. 0,05 sammenlignet med opløsningsmiddel kontrol (0,1% DMSO) på det tilsvarende tidspunkt

rolle digoxin i anticancer effekter

For at undersøge anticancer effekter af digoxin, vi næste udført celle forankring-afhængighed, forankring-uafhængighed, migration og invasion assays. Vores resultater viste, at digoxin inhiberede dannelsen af ​​A549 cellekolonier på en dosis-afhængig måde (10, 25, 50 og 100 nM) i løbet af uger, uanset forankringsafhængige (Fig 2A) eller forankringsuafhængig vækst (Fig 2B). For yderligere at evaluere antitumor virkninger af digoxin om migration og invasion, A549 celler forbehandlet med forskellige koncentrationer af digoxin i 24 timer og derefter udsat for invasion og migration analyser til 12 timer og 16 timer, hhv. Vores data viste, at digoxin signifikant inhiberede celle migration og invasion ved 100 nM sammenlignet med opløsningsmiddel kontrol (0,1% DMSO, fig 2C og 2D).

A549-celler dyrket i en dyrkningsskål med (b) eller uden (a ) blød agar blev behandlet med de ønskede koncentrationer af digoxin og derefter underkastet kolonidannelse analyser. (C) Digoxin formindsker A549 cellemigrering evne, som vurderet af Transwell migration assay. (D) invasivitet af A549-celler behandlet med digoxin blev evalueret under anvendelse af en Matrigel-baserede transwell invasion assay. * P 0,05 sammenlignet med vehikel-behandlet kontrol (0,1% DMSO). Hver behandling blev uafhængigt udført i tre eksemplarer.

Digoxin hæmmer aktiveringen af ​​Src og relaterede proteiner

Dasatinib (BMS-354.825), en Src kinase inhibitor (SKI), er blevet identificeret som en effektiv målterapi lægemiddel in vitro og i klinisk forskning [26,27]. I denne undersøgelse blev dasatinib anvendt som en positiv kontrol. En cytotoksicitet assay indikerede, at cellelevedygtigheden blev signifikant reduceret med digoxin, og virkningerne var stærkere end dasatinib ved den samme koncentration (100 nM) i 24, 48, 72 og 96 timer (Fig 3A). For at bestemme om digoxin påvirker phosphorylering af Src og relaterede proteiner i en dosisafhængig måde blev et Western blot-assay udføres. Resultaterne viste, at phosphorylering af Src Y418, EGFR Y1068 og STAT3 Y705 blev reduceret på en dosis-afhængig måde (50-500 nM) ved digoxin i A549 lungecancer-cellelinje, der besidder vild-type EGFR (fig 3B). Vi bestemt også, at digoxin reducerede phosphorylering af Src Y418, EGFR Y1068 og STAT3 Y705 i en tidsafhængig måde fra 2 til 24 timer i A549-celler (fig 3C). Lignende resultater blev opnået i andre lungekræft cellelinier, fx H3255 cellelinien bærer en L858R EGFR-mutant og H1975 cellelinien indeholdende en L858R /T790M EGFR-mutant (fig 3D og 3E). For at bekræfte, at effekten af ​​digoxin er via regulering af Src-aktivitet blev en konstitutivt aktiveret Src mutant konstruktion (Src Y527F) [28] anvendes. Resultaterne viste, at overekspression af Src Y527F forøgede phosphorylering af STAT3 og FAK. Imidlertid blev phosphorylering af Src Y418, STAT3 Y705 og Y576 FAK stadig reduceret i digoxin-behandlede celler (fig 3f). For yderligere at vurdere virkningerne af Src Y527F på cellelevedygtighed blev A549-celler transficeret med Src Y527F i 18 timer og derefter behandlet med 100 eller 250 nM af digoxin i 24 timer. Mutant Src Y527F-transfekterede celler viste en stigning på cellelevedygtighed sammenlignet med mock transfektanter (α = 0,05, p 0,05). Dataene viste også, at 100 og 250 nM digoxin signifikant inhiberede cellelevedygtighed i Src Y527-transficerede celler sammenlignet med kontrolgruppen vehikel (0,1% DMSO) af Src Y527 transfektant (α = 0,05, p 0,05) (Fig 3G). Disse resultater indikerede, at digoxin kan forårsage cytotoksiske virkning og reducerer phosphoryleringen af ​​Src, STAT3 og FAK i celler med konstitutiv Src aktivering.

(a) A549 cellelevedygtighed blev målt under anvendelse af Prestoblue cellelevedygtighed Reagens til forskellige tidspunkter (0, 24, 48, 72 og 96 h) med eller uden 100 nM digoxin eller dasatinib. (B) Analyse af phosphoryleret og ikke-phosphoryleret Src, EGFR og STAT3 i A549-celler på en dosis-afhængig måde. Kræftcellerne behandlet med eller uden forskellige koncentrationer af digoxin (50, 100, 250 og 500 nM) eller 100 nM dasatinib i 24 timer blev analyseret ved Western blot. (C) Analyse af phosphoryleret og ikke-phosphoryleret Src, EGFR og STAT3 i A549-celler i en tidsafhængig måde. Efter digoxin behandling (250 nM) til 2, 4, 8, 12 eller 24 timer blev cancercellerne høstet og analyseret ved Western-blot. Virkningen af ​​digoxin på Src, EGFR, og STAT3 i (d) H3255-celler og (e) H1975 celler. GAPDH blev anvendt som en intern kontrol. Hver behandling blev uafhængigt udført tredobbelt. (F) Virkning af Src Y527F på phosphorylering af STAT3 og FAK efter digoxin behandling i A549-celler. Mock og EGFP-Src Y527F transfektanter blev behandlet med 100 eller 250 nM af digoxin i 24 timer. De phosphorylering og total protein niveauer af Src, STAT3 og FAK blev påvist ved Western blotting. GAPDH blev anvendt som en intern kontrol. Hver behandling blev uafhængigt udført tredobbelt. (G) Digoxin inhiberer levedygtigheden af ​​celler transficeret med Src Y527F mutant. Efter transfektion med Src Y527F og behandling med 100 eller 250 nM af digoxin i 24 timer blev A549 cellelevedygtighed bestemt ved PrestoBlue cellelevedygtighed reagens. Kvantitative data er præsenteret som middelværdi ± SD (n = 3); * P. 0,05 sammenlignet med kontrolgruppen køretøj (0,1% DMSO) af EGFP-Src Y527F transfektant

Digoxin hæmmer Src aktivitet og nedstrøms signalering

Virkningerne af digoxin på Src nedstrøms mål blev detekteret ved Western blotting i digoxin-behandlede cellelinjer (fig 4A-4C). En signifikant inhibering af PI3K, FAK, SAPK /JNK, paxillin og p130Cas aktiviteter ved digoxin blev vist i tre cellelinier ved 250/500 nM og nedenfor. Især A549-celler, de mest følsomme over for digoxin vækstinhibering, viste fremme af p-MEK1 /2 og p-ERK af digoxin ved 100 nM (fig 4A). H3255-celler var den anden mest følsomme over for digoxin, fordi p-Src inhiberet (fig 3D). I denne cellelinie, digoxin let nedsat p-MEK1 /2 og p-ERK ved 500 nM (fig 4B). Desuden, selv om digoxin inhiberede signifikant ekspressionen af ​​p-Src ved 250 nM i H1975 celler (fig 3E), en stigning i p-AKT aktivitet var i forening med inhiberingen af ​​p-MEK og p-ERK (Fig 4C) . For at undersøge rollen af ​​ERK1 /2 i virkningen af ​​digoxin, A549-celler behandlet med ERK-inhibitoren U0126 og 100 eller 250 nM af digoxin i 24 timer. Cellerne blev derefter underkastet Western blotting (Fig 4D) og cellelevedygtighed (figur 4E) assay. Resultaterne viste, at inhibering af ERK1 /2 phosphorylering var ikke i stand til at forhindre de cytotoksiske virkninger af digoxin eller fremme af p-ERK og p-MEK1 /2 ved digoxin ved 100 nM. Dette resultat antydede, at digoxin kan påvirke andre signalveje og hæmme andre vækstfaktorer eller proteinkinaser at regulere cellevækst i disse cellelinjer.

Western blotting analyser af phosphoryleret og ikke-phosphoryleret PI3K, AKT, MEK1 /2, ERK, FAK, SAPK /JNK, paxillin og p130Cas i (a) A549, (b) H3255, og (c) H1975 cellelinier efter en 24-h behandling med 100, 250 eller 500 nM digoxin. Opløsningsmidlet kontrol var 0,1% DMSO; GAPDH blev anvendt som en intern kontrol. (D) Western blotting-analyser af phosphoryleret og total ERK, MEK1 /2 og AKT i A549-celler efter en 24-h behandling med 10 uM U0126 og 100 eller 250 nM af digoxin. GAPDH blev anvendt som en intern kontrol. (E) ERK inhibitoren har ingen virkning på digoxin-induceret celledød. A549-celler blev behandlet med de udpegede koncentrationer af U0126 og digoxin. Cellelevedygtigheden blev målt ved PrestoBlue cellelevedygtighed reagens. Data er præsenteret som middelværdi ± S.D. (N = 3).

Digoxin reducerer mRNA ekspression af Src og beslægtede proteiner

figurerne 3 og 4 viste, at digoxin ikke kun hæmmede Src og beslægtede protein kinase aktivitet, men også reduceret mængde Src og beslægtede proteinkinaser. Vi yderligere undersøgt, om denne virkning kan opstå fra protein ustabilitet eller transkriptionel nedregulering. A549-celler blev forbehandlet med proteasominhibitor MG-132 ved 10 uM i 2 timer før udsættelse for 250 nM digoxin i yderligere 24 timer. Men i nærværelse af proteasominhibitor, ekspressionen af ​​digoxin-reducerede Src, EGFR og STAT3 blev ikke ændret væsentligt i forhold til den i celler behandlet med digoxin alene (Fig 5A). Vi yderligere xamined hvorvidt digoxin faldt ekspressionen af ​​Src, EGFR, STAT3, og FAK mRNA’er i A549-celler ved anvendelse af revers transkription kvantitativ polymerasekædereaktion (RT-qPCR, Fig 5B). Vi observerede en nedregulering af EGFR og FAK mRNA-ekspression til 0,5- og 0,6-fold, henholdsvis ved 100 nM digoxin i modsætning til opløsningsmiddel kontrol (p 0,05) og nedregulering af Src og STAT3 mRNA-ekspression til 0.48- og 0,67 gange, henholdsvis ved 250 nM digoxin (p 0,05). Disse resultater viste, at ekspressionen af ​​Src og beslægtede proteiner er reguleret af digoxin, hvilket på sin side påvirkninger transkriptionel regulering.

(a) A549-celler blev forbehandlet med eller uden MG132 (10 uM) i 2 timer, derefter behandlet med digoxin (250 nM) eller 0,1% DMSO (kontrol opløsningsmiddel) og opsamlet ved 24 timer. Proteinekspression blev evalueret ved Western blot analyse. GAPDH var en kontrol for protein lastning og overførsel. (B) Celler blev behandlet med digoxin (100 og 250 nM) i 24 timer, og påvisning af Src, EGFR, STAT3 og FAK mRNA-ekspression blev bestemt ved real-time RT-PCR. * P 0,05, signifikant forskellig fra den vehikelbehandlede kontrolgruppe (0,1% DMSO). Hvert forsøg blev uafhængigt udført tredobbelt.

Diskussion

Lungekræft har en høj dødelighed og er en af ​​de mest almindelige maligne tumorer. De seneste succeser i målrettet terapi har forbedret resultaterne af kræftbehandlingen. En regime af EGFR TKI’er, herunder gefitinib og erlotinib, er standard first-line behandling mod fremskreden NSCLC patienter huser aktiverende EGFR mutationer. [29]. Men denne tilgang uundgåeligt fremmer TKI modstand. Src, en velkendt onkogen, spiller en vigtig rolle i mange signalveje og opretholder aktivering i forskellige cancerformer, herunder lungecancer [30]. I denne rapport, fandt vi, at digoxin væsentlig grad hæmmer Src fosforylering i NSCLC celler med varierende EGFR genotyper, herunder vildtype, en L858R mutant, og en L858R /T790M mutant. Endvidere har vi afslørede evne digoxin at inhibere lungekræft proliferation, migration og invasion in vitro. Derudover viser vi en multi-funktionel rolle for digoxin muligvis involverer signalveje, som til vores viden, er ikke tidligere blevet rapporteret.

Digoxin er et naturligt stof udvundet fra fingerbøl (

Digitalis purpurea

L.) [31], som tilhører en gruppe af hjerteglykosider, som kan binde og hæmmer natrium pumper. Det er blevet anvendt klinisk til behandling af hjertesvigt og atrial arytmi via hæmning af Na

+ /K

+ – ATPase i mange år [32], og det hæmmer væksten af ​​bugspytkirtelkræftceller [33] betydeligt. Som tidligere bemærket har lave koncentrationer af hjerteglykosider vist sig at have lav cytotoksicitet i normale celler [32]. Desuden har digoxin vist sig at hæmme primær tumorvækst og metastase af cancerceller fra bryst til lungen i en orthotopisk model, hvor humane brystcancerceller blev implanteret i SCID-mus [34]. På molekylært niveau, digoxin nedregulerer NDRG1 og VEGF gennem inhiberingen af ​​HIF-1α under hypoxiske betingelser i A549-celler [35] og inducerer autofagi at redegøre for væksthæmmende virkninger i NSCLC-celler gennem regulering af mTOR og ERK1 /2 signalveje [36]. I denne undersøgelse fandt vi, at digoxin reducerede phosphorylering af Src i en dosis (50-500 nM) og tid (2-24 timer) -afhængig måde. Vore data viste også, at digoxin reducerede phosphorylering af exogene, konstitutivt aktiv Src i transficerede celler. Men en tidligere rapport angivet, at digoxin lidt forhøjede phosphoryleringen af ​​både Src og ERK i NSCLC-celler inden for 10 minutter ved en koncentration på 100 nM og resulterede i en reduktion af p53-proteinsyntese [37]. Vi spekulere, at uoverensstemmelsen kan skyldes eksponeringstiden til digoxin. Men dette er den første undersøgelse at påvise, at digoxin kan inhibere ikke kun Src men også phosphorylering og ekspression af EGFR og STAT3 til yderligere forsinke cancercelleproliferation, migration og invasion. Vores resultater understøtter den potentielle anvendelse af digoxin som en multi-target agent i kræftbehandlinger

TKI’er med aktiviteter mod EGFR er effektive i patienter med lungecancer med EGFR-mutationer.; dog modstand opstår over tid. Således, at finde en ny agent mod EGFR vildtype og TKI-resistent lungecancere er en nødvendighed. I vores undersøgelse, en EGFR vildtype lungekræft cellelinien, A549, blev anvendt til at screene Src kinaseinhibitorer. NSCLC patienter med en Arg substitution for Leu ved position 858 eller en sletning af exon 19 i EGFR er lydhøre over for EGFR TKI’er [38]. Adskillige kliniske undersøgelser har vist, at amplifikation af et T790M mutation i EGFR bidrager til købet af EGFR TKI-resistens [39]. Derfor TKI-følsomme lungekræft cellelinier (PC9, exon 19 sletning, H3255, L858R EGFR mutant) [40] og TKI-resistente lungekræft cellelinier (PC9 /gef, exon 19 sletning, erhvervet resistens, H1975, L858R /T790M EGFR mutant) [38] blev anvendt til at evaluere anticancer effektiviteten af ​​digoxin. Vores resultater indikerede, at A549-celler var de mest følsomme over for digoxin ved lave koncentrationer, hvorimod andre lungecancerceller reagerede på digoxin ved koncentrationer fra 250-500 nM.

En nylig undersøgelse viste, at Src-aktivering regulerer en række veje, herunder overlevelse, angiogenese, proliferation, migration og invasion, gennem en række proteiner, herunder PI3K /AKT, STAT3, MEK /ERK og FAK /paxillin /p130CAS [13]. Liu et al. viste, at celledeling er reguleret af PI3K /AKT og RAF /MEK /ERK signalveje [41]. I en separat undersøgelse blev ERK1 /2-aktivering samtidig findes i digoxin-induceret autophagy [36]. I den foreliggende undersøgelse, digoxin reducerede phosphorylering af PI3K og ERK i forskellige typer af lungekræft ved 250 nm, men fremmet phosphoryleringen af ​​MEK og ERK ved en lav koncentration (100 nM) i A549-celler. Men hæmning af ERK-vejen ikke ændre virkningen af ​​digoxin, hvilket indikerer, at der kan være andre veje involveret i virkningerne af digoxin. Vi foreslår, at digoxin kan inhibere cancercellevækst ved inhibering af PI3K /AKT signalveje, der fører til autophagy ved forskellige koncentrationer. STAT3 aktiveres i EGFR vildtype NSCLC og korrelerer med cancer progression, herunder celleoverlevelse, migration og invasion [42]. Sorafenib og et af dets derivater (SC-1) er blevet rapporteret at inhibere EGFR vildtype NSCLC vækst og inducere apoptose via SHP-1 /STAT3 pathway [43]. I denne undersøgelse fandt vi, at digoxin ikke kun reduceret STAT3 phosphorylering i EGFR vildtype NSCLC men også i EGFR mutant-typen NSCLC. Derudover aktivering af FAK-Src molekylære stilladser og p130Cas-JNK signaleringskaskader ved a1-integriner fremmer invasion af colon cancerceller [44]. Endvidere er paxillin afvigende reguleret i forskellige maligniteter og involveret i tumorvækst og invasion. Den ektopiske udtryk for paxillin letter celledeling og migration, mens paxillin knockdown hæmmer disse begivenheder i mavens celler [45]. Vores data viser, at digoxin undertrykker FAK-Src, paxillin, PI3K /AKT, MEK /ERK, STAT3 og p130Cas-JNK signalveje i forskellige EGFR-holdige lunge kræftceller, hvilket antyder, at digoxin hæmmer kræftcelle invasion ved at sænke Src aktivering og aktivering af beslægtede signalveje.

som konklusion anvendelse af in vitro lægemiddelscreening og cellefunktion assays, opdagede vi, at digoxin kan undertrykke lungekræft progression ved at inhibere Src aktivering og aktiveringen af ​​relaterede pathways, herunder celleproliferation, migration, og invasion. Men vi kan stadig ikke udelukke, at andre signalveje og proteiner spille nogle roller i digoxin-inducerede effekter (Fig 6). Tilsammen foreslår vi, at digoxin vil være vigtig i udviklingen anticancerlægemiddel.

digoxin-behandlede celler, phosphoryleringen af ​​Src og dens relaterede proteiner blev inhiberet, hvilket kan føre til inhibering af lungecancer celleproliferation, migration, og invasion.

tak

forfatterne vil gerne takke professor Chih-Hsin Yang for at give lungekræft PC9 og PC9 /GEF cellelinjer. Vi takker også Dr. Hong-Chen Chen til at give pEGFP-N3-Src-Y527F mutant plasmid.