PLoS ONE: Histologisk og Molekylær Evaluering af Patient-afledte Kolorektal Cancer Explants

Abstrakt

Mus modeller er blevet udviklet til at undersøge tarmkræft ætiologi og evaluere nye anti-behandlinger mod kræft. Mens gensplejsede og kræftfremkaldende-induceret musemodeller har tilvejebragt vigtige oplysninger om mekanismerne bag den onkogene proces, forbliver tumor xenograftmodeller standarden for evalueringen af ​​nye kemoterapi og målrettet medicinsk behandling til klinisk anvendelse. Men det er uklart, i hvilket omfang eksplanteret kolorektale tumorvæv bevarer iboende patologiske funktioner over tid. I denne undersøgelse har vi skabt et panel af 27 patient-afledte kolorektal cancer eksplantater (PDCCEs) ved direkte transplantation af menneskelige kolorektal cancer væv i NOD-SCID mus. Brug af denne panel udførte vi en sammenligning af histologi, genekspression og mutation status mellem PDCCEs og de oprindelige humane væv, hvorfra de blev afledt. Vores resultater viser, at PDCCEs opretholde vigtige histologiske træk, grundlæggende genekspression mønstre og

KRAS-service /

BRAF

mutation status gennem flere passager. Alt i alt tyder disse resultater på, at PDCCEs opretholde lighed til patienten tumor, hvorfra de er afledt, og kan have potentialet til at fungere som en pålidelig præklinisk model, der kan inkorporeres i fremtidige strategier til at optimere individuel terapi til patienter med colorectal cancer.

Henvisning: Uronis JM, Osada T, McCall S, Yang XY, Mantyh C, Morse MA, et al. (2012) Histologisk og Molekylær Evaluering af Patient-afledte Colorectal Cancer Eksplantater. PLoS ONE 7 (6): e38422. doi: 10,1371 /journal.pone.0038422

Redaktør: Alana L. Welm, Huntsman Cancer Institute, University of Utah, USA

Modtaget: Marts 8, 2012; Accepteret: 9 maj 2012; Udgivet: 4 juni 2012

Copyright: © 2012 Uronis et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra mentored Research Scholars Grant (119.824-MRSG-10-195-01-TBG) fra American Cancer Society (www.cancer.org). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den tredje mest almindelige kræftform og den anden hyppigste årsag til kræft dødsfald i USA. I 2010 blev ca. 142.000 mennesker diagnosticeret med CRC, og omkring 40% af disse patienter præsenteret med fremskreden sygdom [1]. Behandling af fremskreden CRC med kemoterapi er typisk beregnet til sygdomsbekæmpelse og lindring af eneste symptomer, og som et resultat, inoperabel CRC fortsat en uhelbredelig sygdom. For at forbedre kliniske resultater og udvikle nye terapeutiske metoder, er udviklingen af ​​en pålidelig præklinisk model til at studere CRC biologi og narkotika følsomheder påkrævet.

Mus modeller af CRC fortsat en af ​​de mest nyttige værktøjer til at dechifrere den biologiske mekanismer bag den onkogene proces. Til dato har en bred vifte af gensplejsede, kræftfremkaldende-induceret og xenograft musemodeller er etableret [2], [3], og det er generelt enige om, at ingen model er tilstrækkelig til at belyse alle aspekter af CRC ætiologi.

Genetisk manipulerede mus (GEM) modeller har været uvurderlige i oprettelse rollen af ​​mange forskellige genetiske mutationer og signaltransduktionsveje, der bidrager til den onkogene proces og tillade undersøgelse i forbindelse med et aktivt immunsystem [2], [3]. Men mange af disse GEM modeller, primært dem, der involverer mutation af

APC

tumorsuppressorgen, udvikle tumorer i tyndtarmen i stedet for tyktarmen. Dette gør langsgående sygdomsprogression studier vanskeligt foruden mangler den genetiske kompleksitet observeret i humane cancere [2], [3].

andet meget brugt musemodeller for CRC bygger på anvendelsen af ​​kræftfremkaldende stoffer for at inducere kolorektal tumorudvikling . Måske er den mest udbredte kræftfremkaldende-baserede model er den azoxymethan (AOM) model. Her colorectal tumorudvikling initieret af AOM, en potent, colon-specifik carcinogen gennem dannelsen af ​​DNA-addukter [4]. Kolorektale tumorer afledt ved hjælp af denne model rekapitulere de vigtigste menneskelige patologiske træk observeret i mennesker og tillade efterforskning af de tidlige stadier af CRC. Men tumor initiering og udvikling er en tidskrævende proces, der ofte tager op til 6 måneder med tumor mangfoldigheden og penetrans afhængig tungt på musestamme [2], [5], [6].

Mens GEM og kræftfremkaldende -baserede modeller har signifikant forøget vores viden om genetik og ætiologien af ​​CRC, behøver disse modeller ikke mulighed for nøjagtig afprøvning af kræftmedicin, der skal anvendes i det kliniske miljø [7]. Den mest almindeligt brugt

in vivo

model for test af anti-cancer stof effekt og kombinationer er xenograft model. Historisk set har xenotransplantater fastslået gennem subkutan injektion af genetisk definerede human-afledte cellelinier i immunsvækkede nøgne mus [8]. Men til dato har de fleste af disse cellelinje-baserede xenograftmodeller undladt at generere stof følsomhed data, der udmønter sig i klinisk relevante oplysninger [7]. Desuden nylige rapporter antyder, at tumor-stroma-interaktioner ikke forekommer i cellelinie-baserede xenotransplantater kan repræsentere en integreret komponent i onkogent potentiale og tumor lægemiddelrespons [9], [10]. Derfor senere, hel-vævseksplantater afledt af humane cancere, herunder bryst- [11], lunge [12], prostata [13] og kolorektal cancer [14] – [16], er blevet etableret i et forsøg på at generere mere klinisk nøjagtige og pålidelige xenograftmodeller. Men disse undersøgelser undersøgt primært tidlige passage eksplantater ( 5 generationer) fra overvejende primære tumorer og der er derfor fortsat behov for yderligere at karakterisere disse modeller og vurdere, hvor godt de bevarer vigtige egenskaber for den oprindelige menneskelige tumor især i metastatisk sygdom

H 10 høj- powered felter per sektion. Tumor kerner blev bedømt for CDX-2-farvning ved anvendelse af en standard kvantitativ skala fra 0, 1+, 2+ og 3+. Farvning af tumor kerner på 2+ og 3+ blev betragtet som positive, og alle tilfælde anses for positivt udviste mindst 20% af tumor kerner med farvning.

Oncogene Mutation Analysis

Genomisk DNA blev isoleret fra snap frosne PDCCE væv under anvendelse af et Qiagen genomisk DNA isolation kit. Prøver blev fortyndet til 10 ng /pl og PCR blev udført under anvendelse af følgende primere for

KRAS

: forward 5’GTGTGACATGTTCTAATATAGTCA 3 ‘; omvendt 5’GAATGGTCCTGCACCAGTAA 3 ‘og

BRAF

: frem 5’TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA 3′; omvendt 5’GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA 3 ‘. Amplikoner blev sekventeret ved konventionelle fremgangsmåder under anvendelse af de fremadrettede primere.

microarray analyse

RNA blev isoleret fra lynfrosset PDCCE væv under anvendelse af et Qiagen RNA /DNA Allprep kit, omdannes til cDNA og mærket ved en cyklus IVT. IVT mærkede cDNA’er blev fremstillet i overensstemmelse med producentens anvisninger, og mål hybridiseret til Human U133A 2.0 GeneChip og læse på en Affymetrix matrix scanner. Rådata blev omdannet til. CEL filer og RMA normaliseret. CEL filer (GSE35144) er tilgængelige på Gene Expression Omnibus (GEO) datalager (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). For at kontrollere for prøve outliers og batch effekter, blev udført 3D hovedkomponenter analyse af det globale genekspression. Batch effekter blev normaliseret ved hjælp Combat algoritmen (https://jlab.byu.edu/ComBat/) [18]. Uovervåget hierarkisk klyngedannelse af de humane tumorer og matchende PDCCEs blev udført på de 20% af gener med den største variationskoefficient. Agglomerative klynger blev genereret ved hjælp af Pearsons korrelationskoefficient og komplet kobling ved hjælp af R-programmet (R Foundation for Statistisk Computing).

Software til analyse

R statistisk software pakke er tilgængelig på www .r-project.org. Den BioConductor R pakke er tilgængelig på www.bioconductor.org. Combat er tilgængelig som en R-script på https://jlab.byu.edu/ComBat/. Graphpad Prism er et produkt af Graphpad Software (La Jolla, CA, USA) og er tilgængelig på www.graphpad.com/prism/prism.htm.

Resultater

Histologisk Evaluering af PDCCEs

Et panel af 27 patient-afledte kolorektal cancer eksplantater (PDCCEs) ved direkte transplantation af menneskelige kolorektal cancer (CRC) væv i NOD-SCID-mus blev skabt i denne undersøgelse. Tabel 1 viser oprindelsen af ​​patientens tumor og i alt 5 primære PDCCEs og 22 metastatiske PDCCEs blev dannet. For at vurdere, i hvilket omfang

in vivo

modeller af patient-afledte kolorektal cancer eksplantater (PDCEEs) præcist rekapitule- og kan derfor tjene som en model af den menneskelige tilstand, vi undersøgte, om PDCCEs fastholde nøglepersoner biologiske funktioner iboende individuelle humane kolorektal kræft (CRC) over tid. For det første at vurdere i hvilket omfang histologiske parametre bevares efter xenotransplantation blev to uafhængige PDCCEs passeret gennem 10 generationer og evalueres histologisk. Begge PDCCEs undersøgte udviste patologiske træk bemærkelsesværdigt konsistente med den oprindelige patient tumor gennem 11 generationer (figur 1). Dernæst en omfattende histologisk evaluering udføres på en sub-panel af 15 matchede PDCCEs og originale opsparede væv viste, at 15/15 PDCCEs bevaret patologiske funktioner svarende til dem observeret i den matchede menneskelige tumor og blev karakteriseret som histologisk identisk med deres matchede original krænges prøve (tabel 2). Selv efter 11 generationer, PDCCEs bevarede evnen til at danne kirtler og indeholdt CDX-2 positive kerner kan sammenlignes med den første generation PDCCEs (figur 2). Disse data viser, at de histologiske træk til stede i kolorektal cancer, herunder dannelsen af ​​kirtler og tilstedeværelse af stromale komponenter bevares selv i slutningen af ​​passage eksplantater, hvilket tyder på, at i modsætning CRC cellelinie-afledte xenotransplantater, den PDCCE model giver os en forskning værktøj, rekapitulerer den menneskelige tilstand generelt ikke observeret i andre modeller.

PDCCEs Bevar Grundlæggende Global Gene Expression Profiler Iboende human tarmkræft

Dernæst yderligere vurdere, i hvilket omfang PDCCEs repræsentere deres primære humane modstykker vi analyserede 27 matchede patient tumorer og PDCCEs ved microarray analyse. Patient tumor og PDCCE genekspression data blev først normaliseret under anvendelse Combat at minimere batch virkninger. Uovervåget hierarkisk clustering analyse blev derefter udført på den normaliserede datasæt og afslørede tre distinkte klynger (figur 3). Af de 27 matchede patient tumor og PDCCEs, 22 par (81%) faldt inden for samme klynge baseret på dendrogram og 18 PDCCEs (66%) grupperet direkte med den oprindelige tumorprøve. Tilsammen tyder disse data, at de grundlæggende globale gen-ekspressionsmønstre bevares mellem PDCCEs og deres oprindelige menneskelige modstykker.

Oncogene Mutation Status Overført i PDCCEs

For patienter med fremskreden kolorektal cancer, afprøvning af mutation status onkogener såsom

KRAS

er nødvendig for at lede terapi. Konkret patienter med

KRAS

mutationer viser ingen gavn af behandling med EGFR-hæmmere såsom cetuximab eller panitumumab, mens patienter, hvis tumorer er

KRAS

WT drage fordel af anti-EGFR baserede terapier [19] , [20]. For at bestemme, om disse klinisk signifikante genomiske parametre holdes i PDCCEs blev 27 matchede PDCCEs og originale patientprøver analyseres for

KRAS

BRAF

mutation status. Af de 27 matchede par evalueret, 13 præsenteret med aktivering

KRAS

mutationer (kodon 12 = 11; Codon 13 = 2) (tabel 3). Af disse 27 matchede par, 26/27 PDCCEs (96%) matchede deres oprindelige menneskelige modstykke tyder på, at humane kolorektal cancer væv vedligeholdes som mus PDCCEs er genetisk stabile og fastholde onkogen mutation status afgørende for CRC patofysiologi. Alle prøver blev testet negative for

BRAF

mutationer. Tilsammen tyder disse data, at PDCCEs opretholde de biologisk komplekse histologiske, genekspression og mutation-baserede egenskaber observeret i humane CRC’er.

Diskussion

Til dato, en række mus xenograftmodeller er blevet etableret at undersøge CRC ætiologi og behandling. I vid udstrækning er disse modeller blevet dannet ved anvendelse sen passage cellelinier afledt fra humane CRCs og mens signifikante behandlingsrelaterede induceret tumor responser er observeret i disse modeller, er de sjældent forudsigende for tumorrespons hos humane patienter [7]. Dette skyldes sandsynligvis i disse modeller, i det mindste delvist, til den iboende mangel på stroma i tumorafledte epiteliale cellelinjer. Montering data viser, at parakrin signalering og ekstracellulære matrixkomponenter leveret af tilgrænsende stromale celler spiller en væsentlig rolle i den onkogene potentiale af colorectalt carcinom og at modulering af disse stromale interaktioner direkte påvirke effekten af ​​kemoterapi på tumorrespons [9], [10].

Nylige forsøg er blevet gjort for at generere mus xenograftmodeller af CRC ved direkte transplantation af humane colontumorer i immunsvækkede mus [14] – [16], [21]. Poupon og medarbejdere rapporterede, at passagen af ​​humane coloncancer væv gennem en xenograft fase forbedrer succesraten for cellelinie afledning fra humane CRC metastaser [15]. For nylig Hohenadl og medarbejdere rapporterede, at histologiske karakteristika og onkogene ekspressionsniveauer tilbageholdes i tidlig passage CRC xenografter [21], mens Fichtner et al., Og Messersmith et al, brugte paneler af 15- og 10 humane CRC eksplantater henholdsvis at evaluere lægemiddelfølsomhed [14], [16]. Derudover disse undersøgelser anvendte patient-afledt eksplantater hovedsagelig fra det primære site og som metastatiske tumorer tendens til at være mere aggressiv og er mere tilbøjelige til at differentiere, det forbliver uklart, om PDCCEs genereret fra metastatiske steder ville opretholde lighed med den oprindelige tumor. Mens disse undersøgelser er begyndt at understrege værdien af ​​eksplantatpartikler modeller i CRC forskning, er der behov for en mere omfattende histologiske og molekylære analyser på et større panel af humane CRC eksplantaterne at retfærdiggøre deres anvendelse som en præklinisk model til at udføre præcis narkotika effektanalyse og prædiktiv biomarkør identifikation.

i denne undersøgelse viser vi, at PDCCEs genereret fra humane adenokarcinomer med varierende histologiske træk hver bevarer parametrene for tumoren, hvorfra de blev afledt ved histologiske, globale RNA-ekspression og onkogene mutation niveauer. På trods af eksistensen af ​​forskelle i den procentdel af tumor stroma stede mellem de oprindelige humane væv og dem xenotransplanteret i mus, vores undersøgelse fokuserer på de maligne epitelceller. Først er den histologiske arkitektur uløseligt forbundet med colorektal adenocarcinom, primært evnen til at danne dysplastiske kirtler samt tilstedeværelsen af ​​CDX-2 positive kerner bibeholdes i de PDCCEs hele multiple passager ( 10). Dernæst sammenlignede vi genekspressionsprofilerne mellem matchede PDCCEs og dens tilsvarende patient tumor og bemærkede, at 18/27 (66%) af prøverne grupperet direkte sammen og 22/27 (81%) grupperet i større klynge som defineret af dendrogram .

Vi spekulere i, at de 9 PDCCE prøver, der ikke klynge direkte med deres tilsvarende oprindelige tumor kan have været på grund af den iboende heterogene karakter CRC. Det er sandsynligt, at de oprindelige CRC tumorprøver svarende til disse 9 PDCCEs nærede små delpopulationer bærer yderligere onkogene begivenheder. Dette ville til gengæld give en vækstfordel til disse populationer efter at være blevet transplanteret ind i mus, hvilket får PDCCE at have en anden genetisk sammensætning end det oprindelige væv, hvorfra det blev afledt. Til støtte for denne opfattelse, fremgår det, at de fleste variation mellem den primære tumor og dens PDCCE forekommer i tidlige PDCCE passager og at mindre variation opstår gennem processen med passage. For eksempel PDCCE CRC105 grupperet med den oprindelige patientprøve på PDCCE passager 1 og 11, mens PDCCE CRC149 ikke klynge med sin oprindelige prøve enten passage 1 eller 5 tyder på, at genetiske ændringer forekomme overvejende tidlige passager og opretholdes ved senere passager. Det er også muligt, at i disse 9 prøver, der kan have været en større stromal kontaminering resulterer i en forskel i deres clustering mønster. Disse resultater antyder, at der faktisk findes iboende forskelle mellem den matchede patient tumor og PDCCE og ekstrapolationer drages af disse modeller skal gøres så omhyggeligt. Men samlet vores resultater antyder, at den PDCCE model har potentialet til at blive anvendt i forbindelse med undersøgelsen af ​​nye terapeutiske midler, der er målrettet både det maligne epitel tumor arkitektur og /eller stromal komponent og at PDCCEs kan opretholdes i 10 eller flere generationer og samtidig bevare nøgle histologiske parametre.

Endelig har vi vurderet den

KRAS

BRAF

mutation status PDCCEs og viste, at status for alle, men en af ​​de onkogen mutationer blev bibeholdt. Vi observerede et tilfælde (CRC020), hvori en

KRAS

aktiverende mutation var til stede i PDCCE men blev ikke påvist i de oprindelige patientprøver trods for, at disse prøver grupperet sammen af ​​ukontrollerede cluster-analyse. Det er mest sandsynligt, at en lille, målbart befolkning på

KRAS

mutant celler var til stede i patienter tumor på tidspunktet for kirurgisk resektion, og at væksten fordel,

KRAS

aktivering tilladt for efterfølgende udvidelse af

KRAS

mutant celler under tidlig PDCCE passager.

Selv om enhver enkelt musemodel aldrig helt vil rekapitulere faktiske fund hos patienter, brug af prækliniske modeller er nødvendig og praktisk for udviklingen af ​​terapeutiske agenter og biomarkører og et afgørende første skridt i at bringe disse midler til klinikken. Vi er klar over begrænsningerne i vores model, og at enhver konklusion må gennemgå grundig afprøvning for at måle dens nøjagtighed, pålidelighed og reproducerbarhed og skal også efterfølgende valideret i flere patientprøver. Alligevel føler vi, at vores prækliniske musemodel har potentialet til at blive anvendt til at identificere og teste nye kombinationer af terapeutiske midler og også udvikle både prædiktive og prognostiske biomarkører, som derefter kan systematisk frembragt i det kliniske miljø.

tak

forfatterne takker hertugen microarray core facilitet til indsamling af microarray data.