PLoS ONE: lyddæmpning Muteret β-Catenin Hæmmer Cell Proliferation og stimulerer apoptose i binyrebark Cancer Cell Linje H295R

Abstrakt

Kontekst

binyrebark carcinom (ACC) er en sjælden og meget aggressiv endokrine neoplasma, med begrænsede behandlingsmuligheder. Aktivering β-catenin somatiske mutationer findes i ACC og har været forbundet med en dårlig klinisk resultat. Faktisk aktivering af Wnt /β-catenin signalvej synes at spille en vigtig rolle i ACC aggressivitet, og kan således repræsentere et lovende terapeutisk mål.

Mål

Svarende til patient tumor prøve beregnes H295 cellelinien afledt af en ACC huser en naturlig aktiverende β-catenin mutation. Vi heri vurderer

in vitro

in vivo

effekt af β-catenin inaktivering ved hjælp af en doxycyclin (dox) inducerbart shRNA plasmid i H295R binyrebark kræftceller linje (klon ved navn shβ).

Resultater

Efter dox behandling en kraftig reduktion i

β-catenin

udtryk var påviselig i shβ kloner i forhold til at styre kloner (CTR). Følgelig observerede vi et fald i Wnt /βcatenin-afhængige luciferase reporter aktivitet samt en nedsat ekspression af

AXIN2

repræsenterer en endogen

β-catenin

målgen. Samtidigt,

β-catenin

lyddæmpning resulterede i et fald celleproliferation, cellecyklus ændringer med celle ophobning i G1 fasen og øget apoptose

in vitro

.

In vivo

, på etablerede tumor i athymiske nøgne mus, 9 dage med

β-catenin

lyddæmpning resulterede i en betydelig reduktion af

CTNNB1

og

AXIN2

ekspression. Endvidere kontinuerlig

β-catenin

nedregulering, startende 3 dage efter inokulation af tumorceller, var forbundet med en fuldstændig mangel på tumorvækst i shβ gruppen, mens tumorer var til stede i alle dyr i kontrolgruppen.

Konklusion

sammenfattende disse forsøg giver beviser, Wnt /β-catenin pathway hæmning i ACC er en lovende terapeutisk target

Henvisning:. Gaujoux S, Hantel C, Launay P, Bonnet S, Perlemoine K, Lefèvre L, et al. (2013) Silencing muterede

β-Catenin

Forhindrer Cell Proliferation og stimulerer apoptose i binyrebark Cancer Cell Linje H295R. PLoS ONE 8 (2): e55743. doi: 10,1371 /journal.pone.0055743

Redaktør: Hans A. Kestler, University of Ulm, Tyskland

Modtaget: 14. september 2012; Accepteret: December 30, 2012; Publiceret: 7 Feb 2013

Copyright: © 2013 Gaujoux et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af Contrat d’Indledning à la Recherche Clinique (tilskud CIRC 05045 – AP-HP), Plan Hospitalier de Recherche Clinique (AOM06179) til COMETE Network, Recherche Translationnelle DHOS /INCA 2009 (RTD09024), ESF (07-RNP-067), Association pour la Recherche sur le cancer (SFI20111203542), den Weigand Trust Tyskland, Sander Stiftung (2011.003.1) og Ligue contre le cancer (RS12 /75-105). Desuden har forskning, der fører til disse resultater modtaget finansiering fra det syvende rammeprogram (FP7 /2007-2013) i forbindelse med tilskudsaftale nummer 259.735 (ENS @ T-KRÆFT). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

binyrebark carcinom (ACC) er en sjælden og meget aggressiv endokrine neoplasma, med en 5-års samlet overlevelse på omkring 40% [1] – [4]. Terapeutiske muligheder for disse patienter er knappe, og tilgængelige kemoterapi af begrænset effektivitet. En bedre forståelse af tumor biologi og molekylær prognostiske faktorer vil bidrage til at udvælge relevante terapeutiske mål og til at udvikle innovative terapeutiske strategier.

Aktivering af Wnt /β-catenin signalvejen i binyrebark tumorigenese er for nylig blevet undersøgt i detaljer [ ,,,0],5] – [10], og synes at spille en vigtig rolle i adrenocortical carcinoma prognose. I dyremodeller, en konstitutiv aktivering af Wnt /β-catenin pathway i binyrebarken af ​​transgene mus fører til udvikling af adrenocorticale tumorer med maligne karakteristika [11]. Hos mennesker er denne vej ofte aktiveres hovedsageligt trug β-catenin genet (

CTNNB1

, dvs. Catenin (cadherin-associeret protein), beta 1) mutationer [5], [7], og er forbundet med specifikke kliniske og patologiske egenskaber og et dårligt resultat [8]. Ligeledes

CTNNB1

mutation er for nylig blevet vist en specifik transkriptom underskrift af tumorer med [12], og kan være ansvarlig for den særlige dårlig prognose af berørte patienter. Samlet set har disse observationer antyder Wnt /β-catenin signalvej inaktivering som en lovende terapeutisk mål i ACC.

Formålet med denne undersøgelse var at vurdere

in vivo

in vitro

effekter af Wnt /β-catenin signalvej specifik inaktivering ved hjælp af korte hårnål RNA (shRNA) i en tumor model for binyrebark carcinom (H295R).

Materialer og metoder

Cell Kultur og generation af H295R Kloner Salg

adrenocorticale carcinom cellelinje H295R stabilt transficeret med Tet-repressor (H295R /TR) blev venligst leveret af Dr. Lalli [13]. Celler blev dyrket som tidligere beskrevet [14]. PTER-β-catenin vektor, som udtrykker et doxycyclin inducerbar shRNA målrettet

CTNNB1

(

β-catenin

; målsekvens: 5′-GTGGGTGGTATAGAGGCTC-3 ‘) mRNA, og kontrolvektoren ( PTER) blev opnået fra Dr. van de Wetering [15]. H295R /TR blev transficeret med PTER-β-catenin eller PTER og kloner blev selekteret ved zeocin (50 ug /ml, InvivoGen). Tre shRNA-βcatenin kloner (shβ) blev udvalgt i hvilken

CTNNB1

ekspression blev nedreguleret mindst 5 gange i en doxycyclin (DOX, 0,2 ug /ml, Sigma) afhængig måde i forhold til tre kontrol kloner ( CTR) transficeret med PTER vektor. Alle celle kloner blev undersøgt for deres evne til at udtrykke specifikke steroidogene gener (

Star

CYP11B1

) og deres reaktion på den cAMP /PKA-vejen, som viste sig at være sammenlignelig med forældrenes cellelinie, H295R [16] (data ikke vist). S45P

CTNNB1

(

β-catenin

) gen aktivering mutation, der tidligere er identificeret i den parentale H295R cellelinje [5], [8], blev bekræftet ved direkte sekventering i alle Ctr og shβ kloner (data ikke vist). Mens data præsenteres for et enkelt Ctr og shβ klone alle

in vitro

eksperimenter blev bekræftet med tilsvarende resultater i 2-3 individuelle kloner (Ctr og shβ).

Analyse af RNA og protein niveauer

totalt RNA eller protein ekstraktioner og analyser fra cellelinier blev udført som tidligere beskrevet [14] med primere og antistofferne beskrevet i tabel S1.

celletransfektion, og reporter assays

som Wnt /β-catenin pathway reporterkonstruktion driver ekspression af luciferasegenet blev TopFlash plasmid (Top) anvendes som indeholder to kopier af β-catenin /T-celle faktor TCF-bindingssteder hvorimod FopFlash plasmid (Fop) indeholder to muterede kopier af β-catenin /TCF-bindingssteder [5]. Rous sarcoma virus (RSV) -Renilla (Promega) blev anvendt som kontrol af transfektionseffektiviteten. Celler blev cotransficeret og Firefly og Renilla luciferase-aktiviteter blev sekventielt målt som tidligere beskrevet [14].

Celleproliferation, cellecyklus og apoptose analyse

Proliferation blev målt ved MTT-assayet (Promega). Cellecyklus og apoptose blev analyseret ved flowcytometri som tidligere rapporteret [17].

xenograft, patologisk undersøgelse og immunhistokemisk farvning

Athymiske NMRI nu /nu-mus (6-8 uger) var indkøbt fra Harlan Winkelmann (Borchen, Tyskland) og holdt under patogenfrie betingelser. Alle forsøg blev udført følgende protokoller godkendt af Regierung von Oberbayern og i overensstemmelse med de tyske retningslinjer for dyreforsøg. 15 × 10

6 celler af individuelle kloner blev inokuleret i et volumen på 200 pi PBS subkutant i halsen på hver mus. For kortsigtede terapeutiske eksperimenter blev indledt dox behandling, når de længste tumordiametre varierede mellem 0,2-0,9 cm i størrelse (efter 21-31 dage). Doxycylin blev tilsat i en slutkoncentration på 2 mg /ml til drikkevandet i brune vandflasker. Efter 9 dages DOX behandling tumorer blev udskåret, fikseret i formalin, indlejret i paraffin, og 4 um snit skåret og farvet med Hematoxylin-Eosin-Saffron. Immunhistokemi for β-catenin blev udført som tidligere beskrevet [5]. Celler til langsigtede terapeutiske forsøg blev podet og 3 dage efter tumor induktion mus var begyndt fra da kontinuerligt behandlet med dox vand. Tumorstørrelse blev målt hver anden dag under anvendelse af en kaliber, som beskrevet tidligere [18]. På dag 31 dage efter tumor induktion, når de første tumorer nåede en længste tumor diameter på 1,5 cm blev musene aflivet og tumorer skåret.

Statistisk analyse

Alle

in vitro

data med statistiske analyser repræsenterer kvantificering af mindst tre forsøg. Kontrolbetingelser blev sat som 100% og data blev analyseret under anvendelse af Fishers test. Den statistiske analyse til sammenligning af tumorvægt efter langvarig terapeutisk eksperiment

in vivo

blev udført ved Mann-Whitney-test. Signifikans blev fastsat til P 0,05 (repræsenteret ved * i tal); P 0,01 (**) og P 0,001 (***)

Resultater

Effektiv inaktivering af

CTNNB1

efter shRNA i adrenocorticale kræftceller

H295R celler, der huser en heterozygot

CTNNB1

genmutation på GSK3p fosforylering stedet (S45P), udviser en konstitutiv transkriptionsaktivitet af β-catenin-LEF /TCF [5]. Celle kloner, der udtrykker en doxycylin inducerbar shRNA målretning β-catenin blev dannet. To dage efter shRNA-β-catenin induktion af doxycyclin (DOX) behandling,

CTNNB1

mRNA (-85%, p 0,01) og proteinniveauer blev signifikant reduceret (figur 1-A). Dette fald i

CTNNB1

mRNA og protein niveauer varet med dox behandling op til 10 dage. I modsætning hertil dox behandling havde ingen effekt på

CTNNB1

udtryk i kontrol klon (CTR) (figur 1-A).

A, histogram og Western blot paneler repræsenterer

CTNNB1

(

β-catenin

) mRNA og protein akkumulering, i Ctr og shβ kloner efter 2, 5 eller 10 dage efter tilsætning af doxycyclin (DOX) i dyrkningsmediet (0,2 ug /ml). B-venstre, celler blev forbigående cotransficeret med en kunstig Wnt /-β-catenin vej reporter konstruk (Top) eller hans kontrol muteret (Fop). Efter 24 timer blev celler behandlet med vehikel eller DOX (0,2 ug /ml) i 24 timer og luciferaseaktivitet blev målt. -højre, histogram repræsenterer

AXIN2

mRNA akkumulering efter 2 dages dox behandling. C-venstre, Celleoverlevelse kurve af celler, som vurderet ved MTT-assayet uden eller med DOX (0,2 ug /ml) i 1, 4, 8 eller 12 dage. -Center, Fordelingen af ​​celler i de forskellige faser af cellecyklussen blev analyseret ved flowcytometrisk analyse af propidiumiodid-farvning efter køretøj eller dox behandling for 2, 5 og 10 dage. Western blots viser β-catenin, CyclinA og CDK2 proteinniveauer ved 10 dag. -højre, histogrammer repræsenterer apoptotiske celler målt ved flowcytometrisk annexin V inkorporering, efter køretøj eller dox behandling for 2, 5 og 10 dage, uden eller med staurosporin co-behandling for sidste 6 h (0,5 ug /ml). Western blots viser spaltede caspase 3 (CC3) i samme stand.

CTNNB1

nedregulering falder Wnt /β-catenin-LEF /TCF afhængig transskription

Wnt /β-catenin-LEF /TCF afhængig transkription blev undersøgt ved hjælp af top-Flash /Fop-Flash-plasmider (Top og FOP). Som forventet viste transficerede H295R celler højere transkriptionsaktivitet af β-catenin-LEF /TCF afhængige luciferase-reporterkonstruktion Top sammenlignet med den muterede Fop konstrukt (figur 1-B, Ctr-Fop: 5% i forhold til Ctr-Top: 100 %, p 0,01 og shβ-Fop: 9% i forhold til shβ-Top: 100%, p 0,01). H295R celler, som udtrykte shRNA-β-catenin (shβ med DOX) viste lavere transkriptionel aktivitet af reporterkonstruktionen Top (shβ-Top: -53%, p 0,01). Dox behandling påvirkede ikke aktiviteten af ​​Top konstruere i kontrollen klon (Ctr-Top) eller på Fop konstruere med muterede LEF /TCF sites i begge kloner (Ctr-Fop og shβ-Fop).

Desuden ,

CTNNB

1 lyddæmpning i to dage faldt betydeligt mRNA niveau af en endogen kanoniske nedstrøms target gen af ​​Wnt /β-catenin vej, dvs.

AXIN2

, i shβ klon (figur 1-B , shβ: -82%, p 0,01) sammenlignet med kontrol kloner (Ctr,

ns

)

CTNNB1

tavshed ændrer proliferation, cellecyklus og apoptose

en tidsforløb undersøgelse af

CTNNB1

nedregulering i H295R cellelinje viste et signifikant fald i proliferation (-45,8% ved 12 dage, p 0,05) sammenlignet med shβ klon uden

CTNNB1

silencing (-dox) eller kontrol klon (figur 1-C), bestemt ved MTT konvertering.

Flowcytometrisk analyse af cellecyklus ved propidiumiodidfarvning viste ingen effekt på cellecyklus indtil 5 dage. Men efter 10 dages dox behandling,

CTNNB1

silencing resulterede i akkumulering af celler i G1 faser og et fald i celle andel i S-fasen (figur 1-C, shβ-10d-G1: 55,3 ± 0,4%

vs

65,8 ± 2,2%; -S: 27,5 ± 0,2%

vs

16,5 ± 1,6%, p 0,05). Ingen sådan forskel blev observeret i kontrolgruppen klonen (CTR). På dette tidspunkt, observerede vi en reduktion på to vigtige proteiner til G1 /S overgang, cyclin A og CDK2 kun i celler tavshed for

CTNNB1

(figur 1-C).

På samme måde ingen virkning på apoptose analyseret ved flowcytometrisk analyse af annexine V inkorporering i celler, iagttoges indtil 5 dage mens 10 dage dox induceret

CTNNB1

silencing øget andelen af ​​apoptotiske celler (Figur 1-C, shβ- 10d: 167%, p 0,05) sammenlignet med celler uden dox behandling. Ingen sådan forskel blev observeret i kontrolgruppen klonen. Denne stigning i apoptose ved

CTNNB1

lyddæmpning blev også bekræftet af gevinsten af ​​en proapoptotiske proteinniveau, kløvet caspase3 (CC3), som var påviselig allerede på et tidligere tidspunkt (5 dage, figur 1-C). Ligeledes

CTNNB1

lyddæmpning forøgede apoptotiske effekt af staurosporin (figur 1-C; shβ-5d + stau: 224%

vs

377%, p 0,05), mens der blev observeret nogen signifikant forskel i kontrol-kloner.

CTNNB1

lyddæmpning afskaffe xenograft udvikling af ACC cellelinje

for at vurdere den funktionelle betydning af β-catenin knock-down på tumor udvikling vi fortsatte med efterforskning i en subkutan xenograft tumor model i athymiske nøgne mus.

i et første skridt, kortsigtede forsøg med

CTNNB1

inaktivering på etablerede tumorer (21 til 31 dage efter xenografting) for en periode på ni dage blev udført for at afspejle tidsforløbet fra vores

in vitro

eksperimenter (figur 1-C). Svarende til

in vitro

indstilling mRNA-ekspression analyser afslørede en dox afhængig signifikant fald i tumoral

CTNNB1

og

AXIN2

udtryk i shβ klon (figur 2-A;

CTNNB1

: -89%, p = 0,007;

AXIN2

: -87%, p 0,001), mens kontrol kloner forblev upåvirket af dox behandling. Endvidere og i overensstemmelse med de celledyrkningsforsøg, immunhistokemisk analyse (figur 2-B) afslørede en dosisafhængig reduktion af β-catenin-protein dox behandling. Men har vi ikke observeret nogen forskel for Ki67 og det spaltede caspase3 ekspression ved immunhistokemi analyser (data ikke vist), hvilket antyder, at 9 dages dox ikke er tilstrækkelig

in vivo

at inducere virkninger på proliferation og på apoptose . Fordi denne gang kurset er for kort til at undersøge en potentiel virkning på tumorvækst i en

in vivo

model, var langvarig dox behandling udføres. Ctr og shβ kloner blev injiceret subkutant og 3 dage efter tumor induktion mus blev behandlet med DOX på en kontinuerlig måde. Der er ingen signifikant forskel efter 31 dage i tumorstørrelse mellem shβ og Ctr kloner i fravær af dox behandling, men det er ud til, at shβ klon vokse langsommere end Ctr klon, sandsynligvis på grund af en klonal effekt. Af denne grund doxycyclin-inducerbare system er velegnet, fordi klonerne er deres egen kontrol. Mens dox behandling ikke påvirkede tumorvækst og vægt i kontrolgruppen klon (figur 2-C-venstre, medianer vægt: 112 mg

vs

162,7 mg,

ns

), var der en signifikant effekt af

CTNNB1

tavshed på dox behandling i shβ klon (figur 2-C-rigth). Ja, for shβ klon, i de første 10 dage, tumorvækst kunne observeres i begge grupper (uden eller med DOX), men efter 13 dage, ingen tumor kunne påvises i nogen af ​​musene i shβ gruppe behandlet med DOX, også efter dissektion og patologisk analyse (figur 2-C-rigth, median vægt 67,4 mg

vs

0 mg, p 0,001).

A, histogrammer repræsenterer

CTNNB1

(

β-catenin

) og

AXIN2

mRNA akkumulering i xenograft for både Ctr (-dox n = 6; + dox, n = 5) og shβ (-dox, n = 5; + dox, n = 5) kloner på etablerede tumorer og efter 9 dages dox behandling. B, hæmatoxylin-eosin-safran og β-catenin, farvning (× 20) på repræsentative tumorer i shβ klon uden og med dox behandling (samme eksperiment som B). C, Boxplots repræsenterer tumor størrelser til CTR og shβ xenografter i mus løbende behandlet med køretøj eller dox efter 3 dages tumor induktion. Boxplots i venstre hjørne repræsenterer vægten af ​​tumorer udtaget. Ctr (-dox n = 7, + dox n = 8), shβ (-dox, n = 7; + dox, n = 8)

Diskussion

I mange. cancere, Wnt /β-catenin signalvej spiller en vigtig rolle regulering af cellevækst, motilitet, og differentiering [19]. Vi og andre har tidligere demonstreret betydningen af ​​/β-catenin-signalvejen aktivering Wnt i binyrebarken tumorigenese [5] – [10]. Denne aktivering er forbundet med en specifik molekylær signatur og et dårligere resultat med lavere samlet overlevelse [12]. Doghman og kolleger tidligere viste, at en TCF-antagonist inhiberer proliferation af adrenocorticale celler H295R, hvilket antyder en central rolle Wnt /β-catenin pathway i adrenokortikal tumorigenese [20]. Dog kan dette farmakologiske fremgangsmåde ikke være specifik for Wnt signalering. Vi heri, ved hjælp af både

in vitro

og

in vivo

eksperimenter viser, at direkte og specifik β-catenin inaktivering føre til ændringer af spredning, cellecyklus og apoptose, som fører til et dramatisk fald i tumor udvikling i en tumor model for ACC. er behov for yderligere eksperimenter for at vide, hvis β-catenin inaktivering standser væksten eller forhindrer indpodning af cellerne. Desto mindre er disse resultater bekræfter 1 /den biologiske konsekvens af Wnt /β-catenin pathway aktivering i adrenocortical tumorigenese, og 2 /den betydelig terapeutisk interesse at målrette denne vej.

Inhibering af Wnt /β-catenin pathway i en undergruppe af aggressiv ACC synes at være en interessant terapeutisk mål og bør evalueres nærmere i fremtiden.

Støtte oplysninger

tabel S1.

PCR betingelser og antistoffer bruges

doi:. 10,1371 /journal.pone.0055743.s001

(XLS)

Tak

Dr. E Lalli for den generøse gave af H295R /TR celler og Dr. H Clevers for den generøse gave PTER-sh

βcatenin

vektor.