PLoS ONE: Overekspression af Nuclear Protein kinase CK2 α katalytiske subunit (CK2α) som en dårlig prognosticator i Human Kolorektal Cancer

Abstrakt

Baggrund

Kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de mest almindelige maligne lidelser, men de nuværende terapeutiske strategier til avanceret CRC er mindre effektive. Således er hårdt brug for nye behandlingsmetoder. Formålet med denne undersøgelse er at undersøge inddragelsen af ​​nukleare protein kinase CK2 α subunit (CK2α) i tumor progression, og i prognosen for human CRC.

Metode /vigtigste resultater

Ekspressionsniveauer af nuklear CK2α blev analyseret i 245 colorektale væv fra patienter med CRC ved immunhistokemi, kvantitativ realtids-PCR og Western blot. Vi korreleret ekspressionsniveauerne med clinicopathologic parametre og prognose i human CRC patienter. Overekspression af nuklear CK2α var signifikant korreleret med dybde invasion, nodal status, American fælles udvalg om kræft (AJCC) iscenesættelse, grad af differentiering, og perineurale invasion. Patienter med høje ekspressionsniveauer af nukleare CK2α havde en betydeligt dårligere samlet overlevelse sammenlignet med patienter med lave ekspressionsniveauer af nukleare CK2α. I multi-variate Cox regressionsanalyse blev overekspression af nukleare CK2α vist sig at være en uafhængig prognostisk markør for CRC. Desuden blev DLD-1 humane colon cancerceller anvendes som en cellulær model til at studere rollen som CK2α på cellevækst, og ekspressionen af ​​CK2α i DLD-1-celler blev inhiberet ved hjælp af siRNA teknologien. Dataene viste, at CK2α-specifikke siRNA behandling resulterede i væksthæmning.

Konklusioner /Betydning

Tilsammen kan overekspression af nuklear CK2α være en nyttig markør til at forudsige udfaldet af patienter med CRC.

Henvisning: Lin KY, Tai C, Hsu JC, Li CF, Fang CL, Lai HC, et al. (2011) Overekspression af Nuclear Protein kinase CK2 α katalytiske subunit (CK2α) som en dårlig prognosticator i Human kolorektal cancer. PLoS ONE 6 (2): e17193. doi: 10,1371 /journal.pone.0017193

Redaktør: Terence Lee, University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: August 11, 2010; Accepteret: 25 Januar 2011; Publiceret: 17 feb 2011

Copyright: © 2011 Lin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling (DOH98-TD-i-111-TM006) fra Department of Health, Taiwan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) tegnede sig for omkring 1 million nye tilfælde i 2002 (9,4% af verdens samlede), og i modsætning til de fleste steder, tal var ikke så forskellige hos mænd og kvinder (ratio, 1.2:1) [1]. Med hensyn til forekomst, CRC rangerer fjerde i hyppighed hos mænd og tredje i kvinder. Der er mindst en 25-fold variation i forekomst af CRC verdensplan. De højeste incidensrater er i Nordamerika, Vesteuropa, og hos mænd især, Japan. Forekomst tendens til at være lav i Afrika og mellemprodukt i de sydlige dele af Sydamerika. I Taiwan, CRC rangerer som den anden hyppigst diagnosticerede malignitet og forårsager mere end 10000 dødsfald årligt (https://www.doh.gov.tw/statistic/index.htm; tilgås i december 2008). På trods af de nuværende kirurgiske teknikker og kemoterapi, der har gjort betydelige forbedringer, kuren sats for avanceret CRC fortsat lav, og morbiditet er fortsat høj [2]. Således fremskridt i behandlingen af ​​denne sygdom vil sandsynligvis komme fra en mere fuldstændig forståelse af dens patogenese og biologiske funktioner.

Prognose for nydiagnosticerede CRC overvejende afhængig af amerikanske Blandede Cancer (AJCC) fase bestemmes af dybde af invasion, inddragelse af lymfeknuder, og fjernmetastaser [3], [4]. Men i virkeligheden er det velkendt, at patienter med det samme AJCC fase CRC display overlevelse heterogenitet, med nogle patienter udviser relativt korte overlevelsestider. Derfor identifikation af mere lovende prognostiske faktorer, som faktisk er yderst prædiktive af CRC patienter, der gennemgår kirurgisk behandling er obligatorisk. Mange undersøgelser har antydet den rolle, genetiske ændringer kan have i udviklingen og progressionen af ​​CRC [5], [6]. Molekylær patologi kan være nyttigt ikke blot at forstå sygdommen patogenese, men også at give nyttige prognostiske molekylære markører. Nogle foreslåede biologiske prognostiske faktorer omfatter overekspression af vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF), forstærker af Zestes homolog 2 og transglutaminase 2 [7] – [9].

Protein kinase CK2 (tidligere kendt som casein kinase 2) et højt konserveret serin /threonin-kinase. Det fordeles allestedsnærværende i eukaryote organismer, hvor det oftest synes at eksistere i tetramere komplekser bestående af to katalytiske subunits (αα, α ‘α «eller αα«) og to regulatoriske Ø underenheder [10], [11]. CK2 er et bemærkelsesværdigt multifunktionelt protein kinase med en bred vifte af mere end 300 substrater, hvoraf mange er kritisk involveret i processen af ​​cellevækst, proliferation og differentiering [12], [13]. Afbrydelse af

Saccharomyces cerevisiae

gener, der koder begge CK2 katalytiske underenheder fører til en fiasko i udvikling, og påvisning af, at knockout af genet kodende for det regulatoriske CK2 β underenhed i mus er også dødbringende styrker betydningen af ​​CK2 i opretholdelsen af cellelevedygtighed i normal celle liv og under embryogenese [14], [15]. I β-underenheden, kan visse cysteinrester spille en rolle i forankring kinasen til nukleare strukturer. CK2 aktivitet kan have en rolle i cellevækst gennem sin signalering til vigtige steder i nukleare matrix og kromatin strukturer [16]. Adskillige vækststimuli kan forbedre CK2 nuklear shuttling, således at der observeres højere kernelokalisering i tumorceller sammenlignet med normale celler [17], [18].

Desuden CK2 dysregulering i tumorceller kan påvirke den apoptotiske aktivitet og at forbedre celleoverlevelse [19]. CK2 kan udøve antiapoptotiske virkninger gennem forskellige mekanismer. For eksempel CK2 modvirke apoptose ved at beskytte Bid fra tumornekrosefaktor-relateret apoptoseinducerende ligand (TRAIL) -induceret caspase-8-medieret nedbrydning [20]. CK2 er også involveret i phosphorylering af adskillige proteiner relateret til apoptose, herunder p53and nuklear faktor-KB [21], [22]. Desuden er Fas receptor-medieret celledød reguleres af CK2-ekspression [23].

Niveauet for CK2 synes at være stramt reguleret i normale celler, modsætter en ændring i deres iboende niveau af CK2 [24]. Stigende tyder på, at CK2 enzym er en komponent af regulerende protein kinase netværk, der er involveret i flere aspekter af cellulær transformation og kræft [25]. Stigninger i CK2 niveau og aktivitet har konsekvent blevet observeret i en række humane cancere, herunder brystkirtel, hoved og hals, og nyrekræft [26] – [28]. der kun er observeret overekspression og prognostisk betydning CK2 α subunit i lungekræft, prostatakræft og leukæmi [29] – [31]. Så vidt vi ved, ekspressionen og prognostisk betydning af nuklear CK2α i human CRC er stadig ukendt. Formålet med denne undersøgelse var at undersøge sammenhængen mellem nukleare CK2α udtryk og clinicopathologic parametre og prognose i humane CRC patienter. Vi evaluerede også virkningerne af siRNA-hæmmet CK2α udtryk på spredning af tyktarmskræft celler.

Resultater

Grundlæggende data

To hundreder og femogfyrre CRC patienter, 139 hanner og 106 hunner, blev indrulleret i denne undersøgelse. Alder varierede fra 21 til 88-årige i første diagnose (gennemsnit 64 år). Baseret på AJCC klassificering, der var 36 trin I-patienter, 98 stadie II patienter, 110 stadium III patienter, og 1 stadie IV patient. Opfølgning for de patienter varierede fra 2,93 til 123.97 måneder (gennemsnit 68,3 måneder). Under opfølgning, 69 patienter døde af CRC. Postoperative komplikationer forekom ikke hos disse patienter.

Nuclear CK2α ekspression blev opreguleret og forbundet med flere clinicopathologic parametre i CRC

Vi undersøgte udtryk for nukleare CK2α i 245 CRC patienter ved immunhistokemi, og i fire patienter ved Western blot. Resultaterne indikerede, at nuklear CK2α ekspression var højere i tumorvæv end i ikke-tumorvæv (figur 1). Derudover demonstrerede kvantitativ real-time PCR-analyse, at ekspressionen af ​​CK2α væsentlige blev forøget i tumorvæv sammenlignet med ikke-tumorvæv (tabel 1). Som vist i tabel 2, nuklear CK2α udtryk havde en statistisk signifikant sammenhæng med dybden af ​​invasion (

P

= 0,008), nodal status (

P

0,001), AJCC iscenesættelse (

P

0,001), grad af differentiering (

P

= 0,011), og perineurale invasion (

P

= 0,041). De repræsentative mikrofotografier af nukleare CK2α udtryk for forskellige parametre blev vist i figur 2. Der var ingen signifikant sammenhæng mellem nuklear CK2α udtryk og alder, køn og vaskulær invasion.

Nuclear CK2α udtryk i ikke-tumor og tumorvæv , analyseret ved immunhistokemi blev vist i panel A og B, hhv. Forstørrelse: 400 x. Panel C. Nuclear CK2α udtryk i fire ikke-tumor /tumor par blev undersøgt ved Western blot

Forstørrelse:.. 400 × Vejviser

Overekspression af nuklear CK2α som en uafhængig prognostisk markør for CRC

Korrelationer af kliniske resultater med nukleare CK2α udtryk er vist i figur 3. Inferior samlede overlevelse var signifikant associeret med overekspression af nukleare CK2α (betyde mærkning indeks 40%,

P

0,0001). Patienter med høj ekspressionsniveauer af nukleare CK2α havde en tiårig samlede overlevelse på 22,2% sammenlignet med 72,5% for patienter med lave ekspressionsniveauer af nukleare CK2α.

Alle statistiske tests var to-sidet. Signifikansniveau:.

P

0,05

uni-variate analyse af prognostiske markører for CRC er opsummeret i tabel 3. lymfeknudestatus (

P

= 0,025) og overekspression af nukleare CK2α (

P

0,0001) blev korreleret signifikant med samlede overlevelse

Denne forening mellem overekspression af nukleare CK2α og overlevelse forblev selv efter kontrol for andre. velkendte prognostiske markører i multi-variate analyse (tabel 4). I multi-variate analyse, overekspression af nukleare CK2α var prognostisk uafhængig (hazard ratio = 4,53, 95% konfidensinterval = 2,46-8,32,

P

0,0001).

Effect af banke ned af CK2α på tyktarmskræft proliferation

for at bestemme virkningen af ​​CK2α udtryk på DLD-1 human coloncancer celleproliferation,

CK2

α genet blev slået ned ved transfektion af CK2α- specifikke siRNA. Kodede siRNA’er blev anvendt som kontroller. Efter CK2α-specifik siRNA behandling, ekspressionsniveauet af nukleart CK2α i DLD-1-celler var signifikant inhiberet (figur 4A). Imidlertid scrambled siRNA fører ikke til signifikant inhibering (figur 4A). Vi tælles antallet af kolonier af siRNA-behandlede og ubehandlet DLD-1-celler. Kolonier af CK2α-specifikke siRNA-behandlede celler var signifikant færre end ubehandlet og scrambled siRNA-behandlede celler (nedsat til 33% (dag 8) og 57% (dag 14) af dem af ikke-behandlede celler, henholdsvis ) (figur 4B). De repræsentative mikrofotografier blev vist i figur 4C. Resultaterne viste en rolle CK2α spiller i at fremme celledeling og er i overensstemmelse med de kliniske data beskrevet ovenfor.

Panel A. Nuclear CK2α udtryk i siRNA behandlet og un-behandlet DLD-1 kolon kræftceller blev undersøgt ved Western blot-analyse. Panel B. Histogrammer repræsenterer celleformeringsanalyse resultater baseret på gennemsnittet af tre uafhængige forsøg. * Betegner

P

0,001 sammenlignet med un-behandlet DLD-1 celler. Panel C. De repræsentative mikrofotografier.

Diskussion

Forhøjet CK2α mRNA-niveau er blevet rapporteret i flere humane kræftformer, herunder melanom og lungekræft [32], [33]. Men på trods af disse undersøgelser, kliniske data, der beskæftiger sig med det specifikke udtryk CK2α på proteinniveauet er knappe. En nylig undersøgelse viste forhøjede CK2α proteinekspression i prostatacancer [30]. Så vidt vi ved, er dette det eneste undersøgelse under anvendelse immunhistokemi til evaluering CK2α ekspression i humane cancere. Ekspressionen af ​​nukleare CK2α i human CRC er stadig ukendt. I nærværende undersøgelse blev ekspressionsniveauerne af nukleare CK2α i kolorektale væv fra 245 patienter med CRC vurderet, og resultaterne viste, at nuklear CK2α udtryk var højere i tumor kolorektale væv end i ikke-tumor kolorektale væv.

Desuden viste vores data CK2α nukleare akkumulering i CRC, er i overensstemmelse med tidligere undersøgelse foretaget i prostatakræft. Den mekanistiske basis af CK2α kerneakkumulation er i øjeblikket uklar, men, som en CK2 katalytiske underenhed, dets fortsatte tilstedeværelse i kernen måske ikke kun relateret til den forøgede proliferative kapacitet af dedifferentierede tumorceller, men også til deres markante modstand mod apoptotiske signaler. Hvad kunne være den funktionelle konsekvens af nukleare ophobning af CK2 i kræftceller? En undersøgelse udført af Scaglioni et al. viste, at CK2 phosphoryleret promyelocyt leukæmi-proteinet (PML, en tumor suppressor) og målrettet det for nedbrydning med proteasomet [34]. Tab af den kritiske CK2 phosphoryleringssite i PML resulterede i stabilisering af dette protein, forbedring af PML-induceret apoptose. Endvidere i humane ikke-småcellet lungekræft, er der et omvendt forhold mellem PML ekspression og CK2 aktivitet. Da PML er en nuklear-matrix-associeret protein, kan en nuklear ophobning af CK2 være funktionelt relevant at inaktivere tumor-undertrykkende funktioner PML. I en anden undersøgelse har CK2 nylig blevet beskrevet som en vigtig regulator af tumor suppressor NKX3.1 i LNCaP-prostatacancerceller. Ligesom PML, blev det konstateret, at blokering CK2 aktivitet i LNCaP-celler med inhibitor apigenin medførte et hurtigt fald i NKX3.1 akkumulering der blev reddet ved proteasomhæmning [35].

I den aktuelle undersøgelse, vi demonstreret for første gang, at overekspression af nuklear CK2α i CRC væv var nært korreleret med flere clinicopathologic parametre, herunder dybden af ​​tumorinvasion, lymfeknudemetastase, og perineurale invasion. Selvom mekanismerne bag disse foreninger er stadig uklart, vil flere linjer af beviser for disse korrelationer blive diskuteret i det følgende. For det første bevis for sammenhængen mellem overekspression af nuklear CK2 og dybden af ​​invasionen kommer fra matrixmetalloproteinaser (MMP’er), der længe har været forbundet med kræft-celle invasion og metastase [36]. En nylig undersøgelse viste, at PC-3 humane prostatacancerceller overudtrykker membrantype-1 matrixmetalloproteinase (MT1-MMP) voksede hurtigere end mocktransfekterede kontrolceller [37]. Dette resultat antydede, at invasionen-fremmende MT1-MMP er direkte knyttet til tumor aggressivitet. Hele genomet ekspression profilering af MT1-MMP-overekspression versus MT1-MMP-tavshed cancerceller og yderligere data mining analyse af det forud eksisterende ekspression database af 190 humane tumorer i 14 cancertyper førte til identifikation 11 gener, herunder CK2 ekspressionen af som korrelerede fast og universelt med den af ​​MT1-MMP [38]. For det andet ved hjælp af immunhistokemi, sammenhængen mellem VEGF-C og udvikling af lymfeknudemetastase er blevet beskrevet af Yonemura Y. et al [39]. Som respons på hypoxi, sket i de fleste tumorer dyrket større end 1 mm

3, kan ekspressionen af ​​VEGF-C stimuleres ved hypoxi-inducerbar faktor-1 (HIF-1) [40]. Det blev vist, at inhibitorer af CK2 blokerede aktiveringen af ​​HIF-1, og derefter ekspressionen af ​​VEGF-C [41]. Endelig øgede neurit dannelse påvist i de foregående

in vitro

undersøgelser tyder på, at axonal migration kan være et centralt element i perineurale invasion. Axonal vækst er en kompleks proces, der kræver neurotrofiske vækstfaktorer og axonal vejledning molekyler [42], [43]. En undersøgelse udført af Arevalo et al. viste, at nervevækstfaktor, en af ​​de neurotrofiske vækstfaktorer, kan stimulere axon vækst gennem aktivering af CK2 [44].

Vores undersøgelse viste, at overekspression af nuklear CK2α kan være en uafhængig prognostisk markør for CRC. Kliniske data, der beskæftiger sig med den prognostiske værdi af CK2α er begrænsede. Brug af global genekspression profilering har CK2α genet blevet identificeret som en prognostisk markør i patienter med pladecellecarcinom i lungen [29]. Laramas et al. forudsat beviserne for en stærk association mellem et nukleart lokalisering af CK2α og dårlige prognostiske faktorer i human prostatacancer [30]. Desuden studier af Kim et al. viste, at overekspression af CK2α protein i leukæmi blev forbundet med dårlig patientresultatet [31]. Så vidt vi ved, er der ingen rapport nævne den prognostiske betydning af nuklear CK2α i human CRC. Det er bemærkelsesværdigt at bemærke, at for første gang, kan overekspression af nuklear CK2α være en uafhængig prognostisk markør for CRC. Overekspression af nuklear CK2α er derfor en nyttig markør til at forudsige resultatet af patienter med CRC der havde en kirurgisk resektion af tumoren. Patienterne med CRC viser overekspression af nukleare CK2α bør følges op omhyggeligt.

Materialer og metoder

Undersøgelse emner

Patienten kohorte bestod 245 på hinanden følgende CRC sager fra 1998 gennem 2002 dokumenterer patologiske og kliniske faktorer og klinisk resultat. Ingen af ​​disse patienter havde fået præoperativ kemoterapi og /eller strålebehandling. Den ikke-tumor del blev taget fra groft normal colorektal mucosa væk fra tumoren i resektion kolorektale prøve. Clinicopathologic parametre for CRC’er blev bestemt i henhold til AJCC klassificering. Opfølgningen varighed blev defineret som perioden mellem driften dato og dag i det sidste besøg, i henhold til patientens journal. Den institutionelle gennemgang bord Chi-Mei Medical Center godkendt købet væv protokollen til at foretage denne undersøgelse. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver deltager før overtagelsen væv. Tumor /ikke-tumor par af kolorektale væv blev analyseret for nuklear CK2α udtryk.

immunhistokemisk analyse

Nuclear CK2α udtryk blev analyseret ved immunhistokemi. Paraffinindlejrede væv blokke blev snittet på 5 um og overført til mikroskop slides (Muto Pure Chemicals, Tokyo, Japan). Hepatoma blev anvendt en positiv kontrol for CK2α. Den negative kontrol bestod af udeladelsen af ​​det primære antistof og inkubering med phosphatbuffer saltvand. Efter rehyfration og antigen-genvinding, blev antigen blokering udført under anvendelse Dako REAL Peroxidase-blokeringsopløsning (Dako, Carpinteria, CA) i 5 minutter. Objektglassene blev efterfølgende inkuberet med et primært antistof: polyklonalt anti-CK2α (StressGen Bioreagents, Victoria, Canada) i 30 minutter ved stuetemperatur i en fortynding på 1:50. Påvisning af det immunoreaktive farvning blev udført ved avidin-biotin-peroxidase-kompleks fremgangsmåde ifølge producentens instruktioner. Et følsomt Dako REAL EnVision Detection System (Dako) blev anvendt som detektionssystem. Efter inkubation med diaminobenzidin i 5-8 minutter blev snittene kontrastfarvet og monteret til mikroskopisk fortolkning. Immunoreaktiviteten blev uafhængigt scoret af to patologer (C-F Li og C-L Fang). Procentdelen af ​​tumorceller med moderat eller stærk nuklear immunreaktivitet blev registreret, og scorer på samme patient blev midlet til opnåelse af en gennemsnitlig nuklear CK2α mærkning indeks. Cutoff af den gennemsnitlige mærkning indekset til at definere nukleare CK2α overekspression var nukleare reaktivitet i 40% celler (median værdi). Klinisk dataindsamling og immunhistokemisk analyse blev udført uafhængigt af hinanden, i en investigator-blindet undersøgelse.

RNA ekstraktion og cDNA-syntese

Ifølge producentens anvisninger, total RNA fra 10 tumor og ikke -tumor par af kolorektale væv blev isoleret ved anvendelse af et RNA-ekstraktion kit (Sigma, St. Louis, MO). RNA kvalitet blev analyseret ved hjælp af Agilant 2100 Bioanalyzer. RIN værdierne for alle 20 prøver var over 7. cDNA-syntese blev udført som beskrevet i vores tidligere undersøgelse [45]. Syntetiserede cDNA blev lagret ved -20 ° C indtil anvendelse.

Primere og prober

Taqman genekspression Assays herunder primere og prober af CK2α og β-actin, en intern kontrol, blev indkøbt fra Applied Biosystems. Assayet antal CK2α og β-actin var Hs00751002_s1, og Hs99999903_m1 henholdsvis.

Kvantitativ realtids-PCR

Ekspressionsniveauerne for de målgener blev målt ved brug af kvantitativ real-time PCR i ABI Prism 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems) som beskrevet i vor tidligere undersøgelse [45]. Tærskelcyklus (

C

t

) er den fraktionerede cyklusnummer hvor fluorescensen genereret ved spaltning af proben overstiger et fast niveau over baseline. For en valgt tærskel, et mindre udgangspunkter kopi nummer resulterer i en højere

C

t Drømmeholdet værdi. Mængden af ​​CK2α mRNA i tumor eller ikke-tumorvæv, standardiseret over for mængden af ​​β-actin mRNA, blev udtrykt som Δ

C

tumor

eller Δ

C

ikke-tumor

=

C

t

(CK2α) -.

C

t

(β-actin)

Cell kultur og siRNA behandling

Menneskelig coloncancercellelinie (DLD-1) blev opnået fra fødevareindustrien for Forskning og Udvikling Institute (Hsinchu, Taiwan). Celler blev dyrket i RPMI-1640 suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (Moregate BioTech, Bulimba QLD, Australia), 100 enheder /ml penicillin G, 100 ug /ml streptomycinsulfat og 250 ng /ml amphotericin B (alle fra Sigma). Celler blev dyrket ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2. For siRNA behandling blev celler transficeret med 30 nM CK2α-specifik eller krypteret siRNA (Applied Biosystems) under anvendelse siPORT NeoFX Transfektion Agent. 48 timer efter transfektion blev kerneproteiner ekstraheret, og derefter Western blot blev udført for at vurdere virkningen af ​​siRNA behandling.

Nuclear proteinpræparat

Totalt cellulært og væv nukleare proteiner blev ekstraheret med NE -per nukleare og Cytoplasmatisk Extraction reagenser (Pierce Biotechnology, Rockford, IL), i henhold til producentens anvisninger. Prøverne blev opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved anvendelse af et BCA Protein Assay Kit (Pierce Biotechnology) med bovint serumalbumin som en standard.

immunblotting

denatureret protein prøver blev underkastet 10% SDS-PAGE. Proteiner blev overført til nitrocellulosemembraner. Blokerede blots blev inkuberet ved stuetemperatur natten over med anti-CK2α polyklonalt antistof (1:161 fortynding). β-actin (Sigma, 1:8000 fortynding) blev anvendt som en intern kontrol for lige protein loading. Blots blev yderligere inkuberet med sekundære antistoffer konjugeret med peroxidase (Sigma) i 1 time ved stuetemperatur. Forøget kemiluminescens reagenser (Pierce Biotechnology) blev anvendt til at visualisere de målrettede proteiner, som derefter semikvantitativt blev målt ved densitometri. Alle forsøgene blev udført tre gange, uafhængigt af hinanden.

Celleproliferationsassay

Efter siRNA behandling, de transficerede celler blev dyrket i en 37 ° C, 5% CO

2 inkubator i 4 , 8 og 14 dage. Individuelle kolonier ( 50 celler /koloni) blev fikseret, farvet under anvendelse af en opløsning af 1% krystalviolet i methanol i 30 minutter, og talt. Assayet blev udført tre gange, uafhængigt af hinanden. For hvert eksperiment blev to brønde pr tilstand anvendes. Fejlsøjler er SD

Statistisk analyse

Forskelle i nuklear CK2α ekspression mellem tumor og ikke-tumor-væv i den samme patient og i celleproliferation blev analyseret ved anvendelse af en parret

t

prøve. Nogle clinicopathologic parametre blev undersøgt i denne undersøgelse. De var alder, køn, dybde invasion, nodal status, iscenesættelse, grad af differentiering, vaskulær og perineurale invasion. Sammenhængen mellem nukleare CK2α udtryk og clinicopathologic parametre blev undersøgt med χ

2 test. Alle tid-til-hændelse effektmål Ifølge forskellige clinicopathologic parametre blev afbildet af Kaplan-Meier-metoden og betydningen blev derefter bestemt ved en uni-variate log-rank test. I princippet, at de væsentlige parametre i uni-variate analyse (

P

≤0.05) blev indgået med flere variate Cox regressionsmodellen bestemme hazard ratio og uafhængighed prognostisk effekt i en trinvis baglæns måde. Alle data blev analyseret under anvendelse af SPSS software-version 14 (SPSS, Chicago, IL). En

P

værdi 0,05 blev betragtet som signifikant

Tak

Forfatterne vil gerne takke Kuo-Shan Wen for hans hjælp med immunhistokemi.. Forfatterne vil også gerne takke Wen-Chun Chen for hendes hjælp med klinisk dataindsamling.