PLoS ONE: En Predictive Phosphorylering underskrift Lung Cancer

Abstrakt

Baggrund

Afvigende aktivering af signalveje driver mange af de fundamentale biologiske processer, der ledsager tumor initiering og progression. Upassende fosforylering af mellemprodukter i disse signalveje er en hyppigt observeret molekylær læsion, der ledsager den uønskede aktivering eller undertrykkelse af pro- og anti-onkogene veje. Derfor er metoder, som direkte forespørgsel signalvejen aktivering via fosforylering analyser i de enkelte kræft biopsier forventes at give vigtig indsigt i den molekylære “logik”, der adskiller kræft og normalt væv på den ene side, og muliggør tilpassede interventionsstrategier på den anden.

Resultater

Vi først dokument den største tilgængelige sæt tyrosinphosphoryleringssteder der er individuelt forskelligt phosphoryleres i lungekræft, hvilket giver en umiddelbar sæt lægemiddelkandidater. Dernæst udvikler vi en ny beregningsmæssige metode til at identificere veje, hvis fosforylering aktivitet er stærkt korreleret med lungekræft fænotype. Endelig demonstrerer vi muligheden for at klassificere lungekræft baseret på multi-variate phosphoryleringsassays signaturer.

Konklusioner

Meget forudsigelige og biologisk gennemsigtige phosphoryleringsbegivenheder underskrifter af lungekræft bevis for eksistensen af ​​et robust sæt af phosphorylering mekanismer (fanget ved underskrift) til stede i størstedelen af ​​lungekræft, og at pålideligt skelne hver lungekræft fra normal. Denne tilgang bør forbedre vores forståelse af kræft og vejlede dens behandling, da phosphoryleringsbegivenheder signaturer fremhæve proteiner og veje, hvis phosphorylering bør hæmmes for at forhindre ureguleret spredning

Henvisning:. Wu CJ, Cai T, Rikova K , Merberg D, Kasif S, Steffen M (2009) En Predictive Phosphorylering underskrift lungekræft. PLoS ONE 4 (11): e7994. doi: 10,1371 /journal.pone.0007994

Redaktør: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, USA

Modtaget: August 24, 2009; Accepteret: 16 oktober 2009; Udgivet: November 25, 2009

Copyright: © 2009 Wu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af en bevilling fra National human Genome Research Institute (R01 HG003367-01A1 til SK), og den amerikanske Lung Association (RG-52.430-N til MS). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. D.M. og K.R. er ansat af Vertex Pharmaceuticals og Cell Signaling Technology henholdsvis. Ingen af ​​selskaberne forudsat nogen direkte midler for dette håndskrift eller havde nogen rolle i analysen, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Disse relationer ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker vedrørende datadeling og materialer som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

På molekylært niveau, kræftformer er heterogene sygdomme som følge af genetiske faktorer, miljømæssige kræftfremkaldende stoffer og tilfældig, somatisk mutation [1]. Phosphorylering af proteiner er en vigtig regulator af protein aktivitet [2], særlig, ændring af tyrosinrester modulere kritiske signal- og kontrolprocesser [3]. I kræft, har afvigende fosforylering status af vigtige rester (dens tilstedeværelse eller fravær) blevet observeret og dokumenteret i mange undersøgelser, som omfatter den oprindelige onkogen, src [4], og mange andre [5].

Signaturer baseret på protein niveauer er begyndt at blive udviklet [6]. forventes Protein niveauer at være stærkt korreleret med fænotype og protein-baserede diagnostik kan nemt implementeres i de fleste større medicinske centre. Overvågning af funktionelle status af proteiner kan derfor være yderst relevant for kliniske anvendelser, og giver et ekstra lag af specificitet for at øge vores videnskabelige forståelse af kausale sygdomsprogression. Fremgangsmåder til high-throughput påvisning af phosphorylerede rester under anvendelse af massespektrometri bliver hurtigt udviklet [7], [8], [9], [10] og anvendt til studiet af signalveje [11] sammen med komplementær analyse og modellering tilgange [ ,,,0],12], [13].

I dette papir, undersøgte vi global tyrosinphosphoryleringssteder data fra lungekræft og normal lungevæv [14], der søger at identificere forskelligt phosphorylerede protein sites og differentieret aktiverede veje, og for at vurdere deres egnethed som klassificører. Vi rapporterer et stort sæt af websteder, der er differentielt phosphoryleres i tumorer, hvoraf mange kan anvendes som direkte mål for nye lægemidler. Vi præsenterer beviser for, at visse veje forskelligt aktiveres, baseret på deres globale fosforylering status ved hjælp af en ny beregningsmæssige tilgang til at udføre et protein variant af sæt berigelse gen-analyse.

Vi derefter vise, at et relativt lille antal fosforylerede peptider observeret ved at data [14] kan skelne mellem normalt væv og tumor med udsøgt følsomhed og specificitet. Vi validerer vores fosforylering signatur ved hjælp streng cross validering og afprøvning på et ikke tidligere udgivet uafhængigt sæt. Endelig har vi sammenligne bindingsaffiniteter multiple kinaseinhibitorer med phosphoryleringsaktiviteten af ​​deres mål i vores undersøgelse. Integrationen med farmaceutiske data fører til interessante hypoteser om den relative effekt af sådanne lægemidler og foreslår uudforskede men potentielt potente lungekræft agenter, fremhæver potentielle kliniske anvendelser.

Der er en grundlæggende forskel mellem prædiktive underskrifter, som dem udviklet her, og den observation, at et protein differentielt udtrykkes (eller phosphoryleret) med statistisk signifikans. I princippet kan et protein være forskelligt phosphoryleret men være af ringe prædiktiv nytte for den brede klassificering af en sygdom eller til at udarbejde en personlig behandlingsstrategi. Differentiel phosphorylering af et protein er en population aggregat resumé. Det betyder, at i gennemsnit phosphoryleringen niveau af et protein er højere eller lavere i en cancer end normalt væv. Men for enhver given patient sandsynligheden for fejl ved klassificeringen af ​​biopsi som en cancer kan være så højt som 0,49 (hvis afgivelsen af ​​de målinger for cancer og normale væv overlapper). Ikke hensyn til sygdom heterogenitet betragtes, og forhøjede niveauer kan resultere udelukkende fra en delmængde af tilfældene sygdom. Omvendt er en signatur med høj prædiktiv værdi tyder på, at phospho-sites indgår i signaturen er en del af et centralt sæt af veje, som er universelt operativ i sygdommen. De er derfor potentielt afspejler en universel patogenetisk mekanisme for den pågældende sygdom, og kan føre til opdagelsen af ​​en “phosphorylering logisk”, der fanger den vævsspecifikke, eller endda en generelt neoplastisk fænotype. Heterogene cancer undertyper vil nødvendigvis kræve mere komplekse underskrifter, der kræver et stort sæt af prædiktive mekanismer, der kan levere høj dækning af forskellen aktivitet af centrale veje i den specifikke cancer. Endelig, hvis de prædiktive underskrifter består af et lille sæt af proteiner, der implicerer bestemte veje (som det fremgår af vores arbejde), dette sæt af veje bliver et oplagt mål for en bred kombinatorisk multi-target narkotikastrategi.

Resultater Salg

Flere Tyrosin steder differentielt fosforyleret i lungekræft Tissue

Vi først analyseret individuelle protein sites til at bestemme dem, der er forskelligt fosforyleret mellem 48 normale og 94 ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) tumorprøver. Vores resultater afslører 129 unikke aminosyre websteder, der var betydeligt forskelligt fosforyleret mellem normale og tumor prøver (falsk opdagelse sats, FDR

q

værdi 0,05). Af disse 77 af de steder var mere phosphoryleret i kræft væv og 52 steder var mere phosphoryleret i normalt væv. Tabel 1 viser de højest rangerende 20 protein sites med den mindste ranksum

s

værdier, med alle websteder, der er opført i tabel S1.

Ud over de øverste gener, der er anført i tabellen blev påvist mange andre fremtrædende markører for cancer i vores analyse. Navnlig EGFR er en receptortyrosinkinase impliceret i lungekræft og er involveret i flere biologiske processer, herunder apoptose, celleadhæsion og vækst [15], [16], [17]. Mutationer af EGFR ses i et sæt af NSCLC-patienter med god respons på EGFR-inhibitor [18], [19]. Phosphoryleringsniveauerne status af to tyrosiner på den cytoplasmatiske hale af EGFR viste sig at være statistisk forskellig, udviser større grad af phosphorylering i cancer. Resterne Y1172 og Y1197, vides at regulere proliferative aktivitet [20]. Interessant, Y1172 er hyper-phosphoryleret (Tumor /Normal fosforylering spektral tæller forholdet 1) kun i adenocarcinom (AD) prøver. Y1197 er hyper-phosphoryleret i både AD og pladecellekræft (SCC) undertyper, men til en væsentlig højere grad i AD.

stedspecifikke analyse viste, noget overraskende, at aminosyren mest konsekvent forskelligt phosphoryleres i normale og tumorvæv var Y34 alkohol dehydrogenase 1B, ADH1B (mindre phosphoryleret i tumorer). Dette protein deltager i flere beslægtede processer, såsom glycolysen, og fedtsyre stofskiftet. Dets ekspression opreguleres i den sene fase af rottelunge udvikling, men nedreguleret i humant NSCLC [21]. Specifikke rolle Y34 er i øjeblikket ukendt, men den lave fosforylering count kan afspejle enten kompromitteret enzymaktivitet eller reduceret protein overflod i tumorer. Med sin rolle i alkohol stofskifte, kan dette være en konsekvens af Warburg effekten hvorved tumorer ansætte aerob glykolyse at opfylde deres metaboliske behov [22]. ADH1B blev for nylig identificeret som en risiko modifier for pladecellekræft aerodigestive kræftformer, med en postuleret mekanisme af ændret ethanol metabolisme som værende medvirkende [23]. En anden undersøgelse bemærkede nedsat proteinniveauer af ADH1B i brysttumorer [24], postulerer den manglende evne til at oxidere hydroxylgruppen i retinol blokerer produktionen af ​​retinsyre, et molekyle, der hjælper med at opretholde epitelceller i deres differentierede tilstand.

Der var mange andre forskelligt phosphorylerede proteiner. De, hyperphosphoryleret i tumorer indbefatter flere receptortyrosinkinaser (listet i tabel S2), og andre signalproteiner, såsom p38 delta, proteinkinase C-delta, og medlemmer af PI3K signalvejen, herunder p85 beta. Omvendt proteiner hypophosphorylerede (tumorvæv /normalt phosphorylering spektral optællingsforholdstal 1) i tumorer indbefatter transskriptionsfaktorerne STAT1 og STAT5, den proteintyrosinphosphatase PTPN11, G-protein-koblet receptor GPRC5A, og kinaserne MAPK1, MAPK3, og TNK2.

Meget nøjagtig klassificering af tumorvæv via Cross Validering

for at vurdere den potentielle nytte af overvågning protein aktivitet via tyrosinphosphoryleringssteder data, vi udviklede klassificører til at forudsige kræft /normale fænotyper af individuelle prøver . Især undersøgte vi vores evne til at skelne normale væv fra kræft baseret på små sæt phosphotyrosines. Tabel 2 sammenfatter opførelser af fem forudsigende modeller, vi undersøgte. To af modellerne var baseret på statistisk udvalgte steder, der giver maksimal diskriminere magten mellem kræft og normalt væv. Tre modeller var baseret på biologisk drevet udvælgelse af lokaliteter fra centrale veje er forbundet med lungekræft. En normaliseret regressionsmodel (til formål at reducere sandsynligheden for overfitting data) baseret på alle væsentligt forskelligt phosphorylerede protein sites (FDR

q

værdi 0,05) held forudsagde prøven klasser med en gennemsnitlig klassificering nøjagtighed på 0,925 og et område-under-the-kurven, AUC ved 0,974 i en streng bootstrappet cross validering analyse, der omhyggeligt adskiller træning på tilfældige delmængder af data og afprøvning på den resterende delmængde. Udvælgelsen af ​​mest informative sites anvendes til at konstruere modellen blev også gjort på træningsdata. Det gennemsnitlige antal phosphotyrosin steder, der anvendes på tværs af alle bootstrap forsøg var 88.

Vi undersøgte også, om biologisk informerede modeller baseret på relevante gen moduler kan levere en lige nøjagtighed. Specifikt regressionsmodeller baseret på gener i MSigDB “Proliferation” protein-sæt (almindeligt omtalt som “gensæt” i microarray litteratur) [25], og to forskellige protein-sæt repræsenterer EGFR pathway, blev også påvist at diskriminere mellem normale og tumorprøver med stor nøjagtighed. For EGFR vej, vi overvejet to repræsentationer: en “kerne” sti med 11 proteiner (Biocarta) og en “udvidet” sti med 47 proteiner (HPRD). Proteinerne er anført i tabel S3. Vores resultater tyder på, at mens de centrale EGFR proteiner giver en rimelig nøjagtighed skelne kræft versus normale væv (0,83 AUC), den “udvidede” EGFR vej, med ekstra proteiner, giver betydeligt bedre (0,96 AUC). De mest informative proteiner i den udvidede vej ikke inkluderet i kernen EGFR-netværket er CAV1, GAB1, PXN, og PTPN11. Endelig en model baseret på de 20, der udfører sites har en gennemsnitlig klassificering nøjagtighed på 0,88 og AUC på 0,94. Denne klassifikator støtter gennemførligheden af ​​at opbygge en relativt billig chip bruger meget få steder som markører for at muliggøre detektion af cancerceller baseret på phosphorylering assays.

Disse resultater taget sammen tyder på, at der kan anvendes phosphoryleringsstatussen af ​​proteiner at udvikle modeller, der forudsiger en ondartet fænotype af kliniske prøver med meget stor nøjagtighed, svarende til udførelsen rapporteret fra mRNA-ekspression (se note S1) [26].

meget nøjagtig klassificering af kræft Tissue via Forudsigelse på en uafhængig Validering datasæt med 16 NSCLC prøver

Vi anvendte to regressionsmodeller uddannet fra de 142 prøver til en uafhængig datasæt bestående af 16 NSCLC prøver. Koefficienterne til integrere phosphorylering niveau af proteiner i de to modeller er vist i supplerende Tabel S4 og S5. Ved 90% sensitivitet for kræftpatienter i uddannelsen data, den statistiske model ved hjælp af de 20 mest informative phosphoryleringssteder har 87,5% følsomhed på validering prøver. Vi gentog analyse ved hjælp af kategorien “Spredning gener” fra C2 database MSigDB. Den tilsvarende validering følsomhed er 93,8%, hvilket er lidt bedre end sensitiviteten opnået ved den statistiske model. De mest informative steder, der anvendes i spredning modul klassificeringen er afledt af EGFR og SYK (Spleen Tyrosin kinase).

Fordi vi havde ingen nye uafhængige normale prøver at vurdere specificiteten af ​​de klassificører, vi vedtog en variant af en resampling tilgang at anslå den samlede nøjagtighed på uafhængige sæt (beskrevet i metodeafsnittet). Vi rapporterer den gennemsnitlige sensitivitet, specificitet, nøjagtighed, og AUC i tabel S6. Med syv prøver udeladt fra træningsdata, viste de nye klassificører let nedsat følsomhed over 16 validering kræft prøver. Spredningen modul klassificeringen viste bedre sensitivitet, men lavere specificitet end den er baseret på statistisk mest informative markører. Estimaterne af nøjagtighed for disse to klassificører varierer mellem 84 til 88%, og den anslåede AUC er 92-93%.

Differential Phosphorylering af Cancer Associated Pathways

For at få indsigt i biologiske processer, hvis aktivitet kan moduleres i lungetumorer, testede vi 639 inputbaserede protein-sæt fra den kanoniske pathway database af MSigDB at bestemme, om de samlede phosphoryleringsniveauerne af tyrosin sites i proteiner fra hver pathway er signifikant forskellige mellem normale og tumorprøver. Vi var ikke i stand til at bruge traditionelle Gene Set Berigelse Analysis [25] for at opdage disse dysregulerede veje på grund af den ekstreme sparsomme data. I stedet har vi tilknyttet en metaprotein repræsentation med hver sti og beregnet, om phosphorylering niveau af denne metaprotein er korreleret til ændringer i fænotype. Denne teknik er en ny variant af metagene teknik indsat til genekspression analyse.

I alt 181 proteiner observeret i dette datasæt var et medlem af mindst en af ​​de 639 protein-sæt. Tabel 3 viser de øverste 15 protein-sæt, der viser differentierede phosphoryleringsniveauerne. Proteinet-sæt, der viser den største ændring i sin samlede fosforylering niveau, når sammenligningen af ​​den normale og NSCLC væv er Kegg sti “HSA05211 renalcellecarcinom.” Af de 181 proteiner betragtes her, 14 af dem hører til dette protein-sæt, og 9 viste høj korrelation med metaprotein phosphoryleringsniveauerne. Disse 14-proteiner er vist i supplerende tabel S7, hvori en positiv koefficient angiver højere phosphorylering i tumoren. To andre veje, der er særligt relevante for lungekræft, som har markant forskellige overordnede phosphoryleringsniveauerne er “HSA05223 NON småcellet lungekræft” og “METPATHWAY BIOCARTA.” Fem yderligere veje er eksplicit relateret til kræft: “HSA05220 kronisk myeloid leukæmi”, “HSA05215 prostatakræft “” HSA05218 melanom “,” HSA05213 endometriecancer “og” HSA05210 tarmkræft. “To veje er generisk for signalveje,” HSA04070 phosphatidylinositol signaler “og” HSA04010 MAPK signalvejen “, og geneset med de fleste medlemmer var den “integrin-medieret celleadhæsion GENMAPP,” med 32 observerede og 28 korrelerede proteiner.

på grund af sin centrale rolle i lungekræft, vi undersøgte EGFR vej mere detaljeret. I figur 1, kort vi alle de observerede tyrosinphosphorylering begivenheder til konstituerende proteiner, med en model konstrueret ud fra Kegg og HPRD /NetPath databaser. Som forventet, EGFR og mange downstream proteiner i vejen er forskelligt phosphoryleres i NSCLC prøver. I alt 10 tyrosin steder er mere phosphoryleret i tumorer (pink), 7 mere phosphoryleret i normalt væv (grøn) og 12 proteiner blev phosphoryleret til en tilsvarende grad i begge prøvetyper. Selv om der ikke klart mønster er umiddelbart indlysende, er det måske overraskende at konstatere, at de tyrosiner Y186 og Y204 om ERK1 og ERK2 henholdsvis mindre phosphoryleres i lungetumorer. Det er blevet observeret mange gange, at overskydende phosphorylering af ERK1 /2 kan resultere i standsning af cellecyklus, revideret i [27], og dermed de lavere niveauer observeret i tumorer kan føre til øget celle-cykling, men dette kræver yderligere undersøgelse.

Pink indikerer højere fosforylering i tumorprøver, mens grøn indikerer højere fosforylering i normale vævsprøver. blev observeret Gule knudepunkter for at phosphoryleres dog ikke ændre sig væsentligt i de to typer. Grå knuder blev ikke observeret i analysen. En rød pil (eller kant) vedrører en kinase til sit mål, grønne kanter indikerer en fosfatase og sit mål. Blå kanter angiver aktivering, som ikke kan være direkte. Endelig en diamant på enden af ​​en kant indikerer phosphorylering, mens en cirkel angiver en inhibering af phosphorylering. Pilespidser angiver aktivering, hvilket kan være indirekte.

Phosphorylering analyse af forskellige Tumor Undertyper

histopatologiske skelnen af ​​AD og SCC kan være udfordrende [28], men med forskellige behandlingsmuligheder til rådighed [29], et vigtigt spørgsmål. Vi analyserede fosforylering niveauforskellene mellem AD og SCC væv på niveauerne for de enkelte steder, stier og protein-sæt.

Til vores overraskelse er der ingen individuelle websteder, der er statistisk forskelligt phosphoryleret i de to tumor undertyper i aktuelle datasæt. Ligeledes ansætte de metaprotein ovenfor beskrevne analyse, vi observerer ikke væsentligt forskelligt phosphorylerede veje eller protein-sæt (supplerende tabel S8). De tidligere diskuterede gen modeller for tumor subtype klassifikation blev vurderet, og resultaterne er opsummeret i supplerende Tabel S9. Det eneste klassifikator der udfører rimeligt godt, med AUC = 0,78, er baseret på EGFR funktioner udvalgt manuelt med vægt på websteder observeret hyppigt (uden hensyntagen til kræft undertype). Antages det, at alle prøver blev diagnosticeret korrekt, disse resultater tyder på, at forskellene i phosphoryleringsbegivenheder målinger mellem AD og SCC er små og svære at opdage med rene statistiske eller maskine læringsmetoder. Vi forventer, at en mere kvantitativ analyse ved hjælp af relative toparealer, i modsætning til spektrale tæller, ville sandsynligvis klare sig bedre til denne opgave.

Sammenligning af Klassificører Baseret på mRNA Expression data med Phosphotyrosine data

For sammenligning, inkluderer vi i tillægget en rapport om nøjagtighed klassificører baseret på mRNA-ekspression. Baseret på de nuværende data, fremgår det, at phosphorylering status og mRNA-ekspression er nogenlunde lige så informativ med hensyn til at klassificere prøver som tumorer eller normalt. For at skelne tumor undertyper, phosphotyrosines fungerer rimeligt godt (AUC ~0.78), men klassificører bygget med mRNA transkriptniveauer udføre væsentligt bedre (AUC ~0.98). Hverken type data er vellykket på at skelne tidlig fase (fase I og II) fra sent stadie tumorer (fase III og IV). Men denne “fiasko” kan afspejle den tilsvarende biologi af de primære tumorer i de to sager, der ikke kan ændre væsentligt som metastaser kolonisere fjerne steder. Interessant, vi ikke observere en signifikant sammenhæng mellem disse mRNA-niveauer, der er differentielt udtrykte, og differentieret-tyrosinphosphorylering niveauer af det beslægtede protein produkt, fremhæver den komplementære karakter af de oplysninger, som aktivitetsbaserede foranstaltninger.

Diskussion

de resultater, der præsenteres i dette papir åbne døren til en række fremtidige retninger i både grundlæggende og translationel forskning. Forståelse den præcise rolle fosforylering måling i regulering af signalveje i kræft er fortsat en vigtig udfordring, og vi primært fokuseret på den rolle, EGFR og celleproliferation veje. Vi har identificeret et sæt af tyrosinrester, der er forskelligt phosphoryleres i kræft og normal lungevæv. Mere end mRNA-transkript eller protein ekspressionsniveauer, er phosphoryleringsstatussen af ​​udvalgte rester i forbindelse med den funktionelle aktivitet af de associerede genprodukter. Dette er potentielt særligt vigtigt i cancere som nærvær eller fravær af forskellige receptorproteiner kan afvige aktiviteten af ​​nedstrøms signalering mellemprodukter. Dette scenario kan være vigtig i mindst to tilfælde, hvad angår signalveje, en hvor en receptor er til stede, men der er ingen aktiverende ligand (eller en overflod af et ikke-fungerende ligand) at initiere nedstrøms signaleringsbegivenheder, eller hvis receptor er til stede, men muteret og inaktive og derfor ude af stand til at overføre den bindende signal.

Som i enhver systematisk genom-skala undersøgelse, observation af uventede resultater udfordrer evnen til at udlede forklarende hypoteser. Dette er tilfældet med den iagttagelse, at ADH1B er den mest differentielt phosphoryleret protein, med nedsat beløb observeret i tumorer. Involveret i pladecellekræft aerodigestive tumorer [23], hvor en fremtrædende rolle i metabolismen af ​​indtaget ethanol er overbevisende, kan det være tilfældet, at i lungetumorer, kan tumor-associerede hypoxi være at ændre cellulære kulhydratstofskiftet.

Den centrale resultatet af analyserne præsenteres her er påvisningen af, at signaturer baseret på forskellen fosforylering af tyrosinrester udviser robust ydeevne ved at klassificere kræft fra normalt væv. Dette gælder, uanset om signaturen er baseret på et stort antal proteinsteder, et mindre antal, eller pathway-specifikke rester. Dette resultat blev bekræftet i begge strenge cross valideringsundersøgelse samt på en uafhængig sæt. Klassificeringen nøjagtighed af cancer vs. normalt væv er i det væsentlige ækvivalent med resultaterne opnået ved microarray eksperimenter, selv når udført på bulk–dissekerede væv.

Tyrosinkinaser der hyperphosphoryleres i lungetumorer er en hypotese, der skal uhensigtsmæssigt aktiveret, og kan derfor betragtes som potentielle terapeutiske mål for inhibering. I denne undersøgelse har vi observerer op til 19 tyrosinkinaser, der har statistisk forskellige phosphoryleringsniveauerne mellem lungekræft og normalt væv, og næsten alle de hyperphosphoryleres i lungetumorer (Supplerende Tabel S2).

Aktiveringen af ​​multipel tyrosinkinaser i en given cancer er tidligere blevet observeret i glioblastoma multiforme [30]. I så fald kombinationer af tyrosinkinaseinhibitorer (TKI’er) var nødvendige til at nedbringe cellernes levedygtighed. Snarere end kombinationer af lægemidler, et alternativ er at anvende en multi-kinase-inhibitor, såsom imatinib, sorafenib og sunitinib, som hver især er i stand til at inhibere flere tyrosinkinaser [31]. Dette førte os til at udforske den mulige eksistens af en multi-kinase inhibitor, som målrettet en stor del af disse kinaser, som vi observerede at blive hyperphosphoryleret i lungekræft. En omfattende, offentligt tilgængelige datasæt af TKI bindende oplysninger [32] analyseret 38 TKI’er mod 317 kinaser. Vi har integreret TKI bindende data med vores differential fosforylering analyse (Supplerende tabel S2). Af de tyrosin kinsases for hvilke bindende data indberettet, og vi finder, at næsten alle af dem var bundet af TKI dasatinib med høj affinitet (Kd s 2 nM). Dette tyder på, at dasatinib potentielt kunne være en nyttig behandling for et udvalg af patienter med lungekræft. Mere generelt vores undersøgelse viser nytten af ​​at integrere globale tyrosinphosphoryleringssteder analyser [14] med narkotika bindende data til hurtigt at nå frem til potentielle terapeutiske muligheder, og muligheden for at forudsige en reaktion på bestemte kinase hæmmere.

Analyse af sti -specifikke total-phosphoryleringsniveauerne demonstrerer specificiteten af ​​den overordnede tilgang, som 7 af de top 15 protein-sæt identificerede udtrykkeligt defineret som kræft protein-sæt. Signalveje tegnede sig for 4 af de resterende top 15 protein-sæt, herunder de vigtige eksempler på phosphatidylinositol og MAPK signalveje. Veje nedstrøms for EGFR og Met-receptorer, med fremtrædende roller i lungekræft biologi, blev ligeledes impliceret.

Mens udførelsen af ​​phosphotyrosin underskrifter var beskeden for diskrimination af AD og SCC, med de mest effektive klassificeringen have en AUC på 0,78, mRNA transkriptniveauer klassificere disse undertyper med større nøjagtighed, og hverken metode adskiller tidligt på fremskredne lungekræft. Sidstnævnte observation kan afspejle en begrænsning af den metode, eller det kan præcist afspejler biologi lungekræft, i er ikke nødvendigt, at fundamentalt nye processer for progression, kun er gået den tid nok til de dysregulerede gener og veje til at erodere længere ind omgivende væv og at metastaser er forekommet.

Fremtidige udfordringer for karakterisering af tumorer baseret på fosforylering signaturer omfatter den relative sparsomme data (især blandt flere prøver), foldning af protein niveauer med phosphoryleringsniveauerne, og semi- kvantitativ karakter af spektral tælle til måling peptid overflod. Der findes imidlertid enkle forbedringer for at klare hver af disse begrænsninger. Det er sandsynligt, at den væsentligste forbedring ville være resultatet af anvendelsen af ​​stabile isotop etiketter. Disse ville tillade direkte sammenligninger mellem flere prøver, og øge kvantitativ nøjagtighed. Det faktum, at der allerede kan opnås en sådan fremragende præstation til klassificering normale versus tumorvæv gør yderligere forbedringer meget ønskeligt. En anden løfte er potentiale til at udvikle signaturer til at guide behandlinger og forudsige patientresultater. Kinaseinhibitorer er en spændende ny klasse af behandlinger for cancer [33], [34], men de seneste undersøgelser har understreget, at enkelte mål for inhibering ikke kan være tilstrækkelig til at opnå et terapeutisk respons [30]. Kombinationer af kinaseinhibitorer, med hver potentielt binding til flere mål, kan være nødvendig for at inhibere uønskede vækst og proliferation signaler aktive i neoplasmer [35]. De phosphorylerede proteiner analyseres her repræsenterer mål for kinaser, der skal formodentlig inhiberes at opnå virkningsfuldhed. Computational [36] eller eksperimentelle [37] metoder til at udlede de aktive kinaser vil potentielt bidrage til at identificere de relevante terapeutiske mål i de enkelte tilfælde.

Konklusioner

Fordi uhensigtsmæssig aktivering af signalveje repræsenterer fundamentale biologiske processer i kræft, analyserede vi phosphoryleringsbegivenheder data fra lungekræft og normal lungevæv til at identificere forskelle. Vi identificerede flere hundrede forskelligt phosphorylerede steder i lungekræft, og udviklet nye beregningsmæssige metode til at identificere veje, hvis fosforylering er dysreguleret. Endelig er vi demonstreret evne til at klassificere lungekræft med stor nøjagtighed baseret på multi-variate phosphoryleringsassays signaturer. De phosphoryleringssteder identificerede give en øjeblikkelig sæt af nye lægemiddelkandidater, og en analyse af komplementet af websteder giver en logik for udvælgelse blandt potentielle behandlinger med multi-målrettede kinase inhibitorer eller kombinationer af selektive hæmmere.

Materialer og Metoder

Datakilder

procedurerne af forsøgene og erhvervelse af tyrosin-phosphorylering data blev beskrevet i forrige publikation [14]. Den første datasæt indeholder 151 NSCLC og 48 normale lunge prøver. Af de 151 tumor prøver blev 42 adenocarcinom (AD) prøver og 52 pladecellekræft (SCC) prøver med tilgængelige kliniske oplysninger, der anvendes i analysen klassificeringen. De fleste af de 4551 observerede phosphoryleringssteder blev identificeret i et relativt lille antal prøver. For vores analyser, vi medtaget de websteder, der blev phosphoryleret i mindst 10% af prøverne under overvejelse. En anden datasæt bestående af 16 NSCLC prøver, der blev ikke oprindeligt er medtaget i [14] (og derfor ikke tidligere udgivet) blev anvendt til at give en uafhængig validering af prædiktive signatur.

Statistisk Analyse for Differential Phosphorylering af Protein steder